本發(fā)明涉及一種磁共振分子探針，特別是涉及一種用于檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hcc)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，早期肝細(xì)胞癌診斷依然是提高h(yuǎn)cc患者預(yù)后的關(guān)鍵途徑。臨床上，mri(磁共振成像)掃描是診斷hcc的常用方法，但問(wèn)題的關(guān)鍵是提高mri在診斷早期hcc的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)在大部分hcc中，磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)蛋白在肝癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)并具有很高的特異性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明以gpc3作為靶點(diǎn)的單克隆抗體介導(dǎo)的mr免疫成像能夠檢測(cè)出微小的早期hcc癌灶[jameso.park,etal.glypican-3targetingoflivercancercellsusingmultifunctionalnanoparticles.molimaging.2011february；10(1):69–77.]。

顧燕等用雙乳化溶劑揮發(fā)法制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)納米粒，在納米粒表面連接gpc3抗體及順磁性對(duì)比劑gd3+(gd3+-plga-gpc3抗體)，構(gòu)建靶向肝癌gpc3的mr分子探針，并利用mr掃描儀觀察該探針標(biāo)記肝癌hepg2細(xì)胞后的體外mr成像能力[顧燕，曾燕等.靶向肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3分子探針的構(gòu)建及其在hepg2細(xì)胞中的磁共振成像[j]-中華肝臟病雜志2014(2)]。

youweili等利用spio-gpc3抗體探針標(biāo)記肝細(xì)胞癌[youweili,feili,etal.preparationandinvitrostudiesofmri-specificsuperparamagneticironoxideantigpc3probeforhepatocellularcarcinoma.internationaljournalofnanomedicine2012:74593–4611]。

2014年shamjg等利用單克隆抗體片段f(ab')2多肽對(duì)表達(dá)gpc3的hcc進(jìn)行小動(dòng)物的pet研究[jonathang.sham1,etal.glypican-3—targetingf(ab’)2for89zrpetofhepatocellularcarcinoma.http://jnm.snmjornals.org.accessedon november15,2015]。

上述研究表明，靶向gpc3的物質(zhì)(如抗體、多肽)可特異性標(biāo)記肝癌hepg2細(xì)胞，在靶向物質(zhì)上連接對(duì)比劑，可在mr成像上檢測(cè)出微小早期hcc癌灶。

但是，現(xiàn)有技術(shù)仍存在以下缺陷：

(1)在配體選擇方面，抗體是使用最廣泛的，但以單克隆抗體作為配體，存在的局限性不僅是價(jià)格昂貴、具有致免疫性，并且更為重要的是，抗體的高分子量會(huì)導(dǎo)致較差的組織穿透力，進(jìn)行體內(nèi)研究時(shí)會(huì)明顯減弱其靶向作用。而早期肝細(xì)胞癌病灶比較微小，可因此導(dǎo)致局部探針濃度不夠而使mr成像病灶顯示不夠明確。

(2)在mr成像方面，雖然含釓類對(duì)比劑使用較為廣泛，但是含釓類對(duì)比劑有可能引起一種雖然罕見卻極其嚴(yán)重的疾病——腎源性系統(tǒng)性纖維化(nephrogenicsystemicfibrosis,nsf)[kuoph,kanale,abu-alfaak,etal.gadolinium-basedmrcontrastagentsandnephrogenicsystemicfibrosis.radiology,2007,242(3):647-649]。而且，含釓類對(duì)比劑的成像效果較fe類超順磁性造影劑信噪比低。

(3)相比單克隆抗體，f(ab')2多肽的血循環(huán)時(shí)間縮短，瘤-噪比提升。但在pet研究中運(yùn)用f(ab')2多肽不能直接用作早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針。

(4)目前所應(yīng)用的單克隆抗體及順磁性對(duì)比劑gd3+不僅具有免疫原性或?qū)θ梭w有毒性，且生產(chǎn)困難、價(jià)格昂貴，將傷害身體健康、造成低利用率。

因此，為了提高敏感性及利用率、減少對(duì)人體的傷害，有必要開發(fā)一種新的用于檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針，既能與肝癌細(xì)胞表達(dá)的特異性受體靶向結(jié)合，又不具有或具有低免疫原性提高、無(wú)毒性或低毒性，且能mr成像的圖像信噪比。

本發(fā)明所述的用于檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針包括：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)受體的配體，所述配體為生物素化的氨基酸序列如seqidno:1所示的多肽；mr成像顯像劑，所述顯像劑為鏈霉親和素-聚乙二醇-超小超順磁性氧化鐵(sa-peg-uspio)納米復(fù)合物；所述生物素化的多肽與sa-peg-uspio 通過(guò)生物素-親和素結(jié)合而構(gòu)成靶向gpc3的磁共振分子探針。

根據(jù)本發(fā)明所述的磁共振分子探針的進(jìn)一步特征，所述配體是通過(guò)以下步驟制備的：人工合成氨基酸序列如seqidno:1所示的多肽，然后用生物素修飾所合成的多肽。

根據(jù)本發(fā)明所述的磁共振分子探針的進(jìn)一步特征，所述鏈霉親和素-聚乙二醇-超小超順磁性氧化鐵(sa-peg-uspio)納米復(fù)合物是通過(guò)以下步驟制備的：a.人工制成帶有羧基的聚乙二醇化的超小超順磁性氧化鐵(peg-uspio)，所述peg-uspio水合粒徑為22.73±3.31nm，分散系數(shù)(pdi)為0.21±0.02，zeta電位為4.22±0.53mv；b.通過(guò)酰胺反應(yīng)與鏈霉親和素反應(yīng)合成鏈霉親和素-聚乙二醇-超小超順磁性氧化鐵(sa-peg-uspio)；所述sa-peg-uspio的水合粒徑為35.97±5.19nm，分散系數(shù)(pdi)為0.17±0.05，zeta電位為－7.91±1.22mv。

本發(fā)明利用生物素化的多肽介導(dǎo)的鏈霉親和素-聚乙二醇-超小超順磁性氧化鐵(sa-peg-uspio)納米復(fù)合物作為分子探針，對(duì)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)陽(yáng)性肝癌細(xì)胞進(jìn)行定位，并行mr成像預(yù)定位，可有效地通過(guò)磁共振檢測(cè)到早期肝細(xì)胞癌。

本發(fā)明所述的用于檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌的磁共振分子探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)在配體選擇方面：與抗gpc3單克隆抗體相比，本發(fā)明所述的多肽具有相同的靶向性能，但該多肽的分子量小、價(jià)格低廉且無(wú)免疫源性，所以，以該多肽作為配體介導(dǎo)的mri成像在理論上同樣可用于特異性檢測(cè)微小早期hcc病灶。且多肽具有良好的生物相容性、靶向性、無(wú)免疫源性、低毒性、生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單和價(jià)格相對(duì)低廉。

(2)在mr成像方面：本發(fā)明一方面引入了生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，bas)，此系統(tǒng)具有高親和性及高特異性，并易于結(jié)合多種標(biāo)記物而不影響其功能，可以放大生物信號(hào)，提高分子探針檢測(cè)微小早期肝細(xì)胞癌的靈敏度，對(duì)比起直接靶向法，bas能明顯地提高靶向組織的對(duì)比劑攝取量；另一方面應(yīng)用uspio造影劑，它屬于fe類超順磁性造影劑，信噪比比gd類順磁性造影劑更高，且對(duì)人體無(wú)毒性。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述的生物素化多肽介導(dǎo)的三步預(yù)定位方法，應(yīng)用peg修飾的納米級(jí)分子探針，可以初步實(shí)現(xiàn)體內(nèi)肝細(xì)胞癌的主 動(dòng)靶向mr成像。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的磁共振分子探針能提升對(duì)微小早期肝細(xì)胞癌診斷的特異性，對(duì)hcc的臨床診斷將有重要的理論借鑒和指導(dǎo)作用。

附圖說(shuō)明

圖1顯示預(yù)定位實(shí)驗(yàn)組(多肽-bt/sa-peg-uspio)成瘤裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)的t2加權(quán)圖像。

圖2顯示對(duì)照組(sa-peg-uspio)成瘤裸鼠不同時(shí)間點(diǎn)的t2加權(quán)圖像。

圖3是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中成瘤裸鼠腫瘤的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖(***:p<0.01)。

圖4為預(yù)定位實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤的普魯士藍(lán)染色圖。

圖5為對(duì)照組裸鼠腫瘤的普魯士藍(lán)染色圖。

圖6為裸鼠腫瘤的gpc3免疫組化染色圖。

具體實(shí)施方式

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要試劑：

多肽：arg-leu-asn-val-gly-gly-thr-tyr-phe-leu-thr-thr-arg-gln(seqid:1)人工合成生物素修飾的多肽，由博欣(廈門)生物技術(shù)有限公司合成。

聚乙二醇-超小超順磁性氧化鐵(peg-uspio)，購(gòu)于萬(wàn)德高(北京)科技發(fā)展有限公司。

鏈霉親和素(sa)，購(gòu)于sigma(美國(guó))公司。

0.1mmes緩沖液、edc、sulfo-nhs、mtt，購(gòu)于sigma(美國(guó))公司。

dmso、4％多聚甲醛、2-巰基乙醇、乙醇胺、瓊脂糖，購(gòu)于阿拉丁(上海)有限公司。

gpc3一抗，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

普魯士藍(lán)反應(yīng)液、0.5％核固紅，購(gòu)于雷根(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要儀器：

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(cellometer)；eclipsets100倒置熒光顯微鏡(nikon)；hepaclass 恒溫培養(yǎng)箱(thermo)；超濾管(millipore)；激光粒度分析儀(malvern)；3t磁共振儀(ge)；elx800酶標(biāo)儀(biotek)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1sa-peg-uspio復(fù)合物的合成

(1)取5ml0.1mmes緩沖液(ph6.0)溶解的peg-uspio(1mgfe/ml)，加入2.0mgedc和5.5mgsulfo-nhs，室溫下振蕩15min以充分反應(yīng)；

(2)加入7.0μl2-巰基乙醇來(lái)阻斷edc反應(yīng)；

(3)超濾離心管離心除去還原劑和阻斷劑，漂洗3次，pbs緩沖液(ph7.4)重懸；

(4)加入3mgsa，室溫振蕩2h；

(5)加入終濃度為30mm的乙醇胺終止反應(yīng)；

(6)超濾離心管離心除去多余的sa和阻斷劑，漂洗3次，純化好的sa-peg-uspio復(fù)合物重懸在pbs(ph7.4)中，調(diào)節(jié)濃度為1mgfe/ml。

1.2.2測(cè)定peg-uspio和sa-peg-uspio復(fù)合物粒徑和表面電位

吸取15μl制備的相應(yīng)樣品，用去離子水稀釋至離心管，終濃度為0.6mmol/l。采用英國(guó)malven-3000hs激光粒度分析儀測(cè)定zeta電位和粒徑及其分布，所選激光光源波長(zhǎng)為633nm，測(cè)試溫度為(25.00±0.05)℃，光信號(hào)用256通道、高速數(shù)字相關(guān)器進(jìn)行處理。

1.2.3細(xì)胞準(zhǔn)備

細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)hepg2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，除去培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，洗滌并消化，利用pbs緩沖液配成細(xì)胞懸液，以每只裸鼠接種細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×10⁷個(gè)計(jì)數(shù)，于冰盒內(nèi)保存，用于建立肝細(xì)胞癌模型。

1.2.4hepg2細(xì)胞的體外免疫組化分析

采用間接免疫熒光法，將hepg2肝癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，進(jìn)行計(jì)數(shù)、鋪板。4％多聚甲醛1ml固定20min后，用稀釋后的抗gpc3一抗以體積比1∶100稀釋，4℃孵育過(guò)夜。洗滌后，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗標(biāo)記上述一抗。洗滌、固定后，觀察熒光表達(dá)。結(jié)果如圖6所示。

1.2.5模型建立及麻醉

上述準(zhǔn)備的hepg2細(xì)胞以每毫升1×10⁸個(gè)的濃度重懸在pbs緩沖液中，采 用1ml注射器在無(wú)菌條件下把細(xì)胞重懸液緩慢地注射進(jìn)spf級(jí)5周齡balb/c去胸腺裸鼠(約20-30g)背側(cè)大腿根部皮下，注射的細(xì)胞懸液量為0.1ml。

裸鼠接種后飼養(yǎng)在spf級(jí)別環(huán)境下的動(dòng)物房，保持環(huán)境溫度為25攝氏度，空氣相對(duì)濕度保持在55％左右，裸鼠所需水及飼料等需要經(jīng)過(guò)高壓及紫外線滅菌處理，并定期觀察裸鼠移植瘤生長(zhǎng)狀態(tài)。

裸鼠培養(yǎng)約3周后，瘤徑達(dá)到1cm左右，用于實(shí)驗(yàn)研究。

實(shí)驗(yàn)前一天，禁止裸鼠正常飲食。

1.2.6實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分兩組進(jìn)行，各組有8只裸鼠，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

(1)預(yù)定位靶向組注射方案：

第一步，通過(guò)尾靜脈緩慢地注射生物素化多肽300μg；

第二步，36小時(shí)后，通過(guò)腹腔注射鏈霉親和素(sa)50μg；

第三步，半個(gè)小時(shí)后，通過(guò)尾靜脈緩慢注射連接鏈霉親和素超順磁性納米顆粒(sa-peg-uspio)，注射的量為0.8mmolfe量每100mg裸鼠重量；

(2)對(duì)照組注射方案：

通過(guò)尾靜脈緩慢注射連接鏈霉親和素的超順磁性納米顆粒(sa-peg-uspio)，注射的量為0.8mmolfe量每100g裸鼠重量。

1.2.7實(shí)驗(yàn)動(dòng)物磁共振掃描

磁共振掃描前先對(duì)接種成瘤的裸鼠模型進(jìn)行麻醉，用10％水合氯醛以0.5ml每100g重量的比例腹腔內(nèi)注射，麻醉后把裸鼠以俯臥及伸張?bào)w位固定進(jìn)行成像。

預(yù)定位靶向組在進(jìn)行第三步之前進(jìn)行磁共振平掃。

對(duì)照組在注射藥物之前進(jìn)行磁共振平掃。

mri掃描參數(shù)為：t2wise序列，tr＝4000ms，te＝85ms，nex為4，視野fov為12×12mm，矩陣matrix＝512×160，層厚2mm，層間隔2mm，層數(shù)＝8，所有裸鼠行橫斷位掃描。

兩組實(shí)驗(yàn)組在注射磁共振對(duì)比劑后的30min、1h、2h、4h、6h分別進(jìn)行磁共振掃描。

1.2.8圖像評(píng)估

各組裸鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均從工作站轉(zhuǎn)移至電腦進(jìn)行處理。由實(shí)驗(yàn)者對(duì)各組裸鼠磁 共振圖像感興趣區(qū)進(jìn)行描繪和最后的數(shù)據(jù)評(píng)估分析。感興趣區(qū)roi盡可能在覆蓋各組圖像所選層面的腫瘤輪廓，并避開腫瘤邊緣信號(hào)重疊的像素點(diǎn)，以此測(cè)量裸鼠移植瘤t2wi的信號(hào)強(qiáng)度si，并計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度△si，具體公式為：相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度△si＝(si增強(qiáng)后-si平掃)/si平掃×100％，同時(shí)繪制時(shí)間為橫軸，相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度為縱軸的曲線圖，以分析預(yù)定位增強(qiáng)掃描的信號(hào)隨時(shí)間改變的規(guī)律。通過(guò)對(duì)各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較裸鼠移植瘤在預(yù)定位實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異是否有顯著性。p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用spss13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)用χ±s表示，r2值的比較采用多組獨(dú)立樣本的單因素方差分析，各組間兩兩比較采用snk法和lsd法，雙側(cè)檢驗(yàn)，p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1sa-peg-uspio和peg-uspio復(fù)合物的性狀

分子探針sa-peg-uspio構(gòu)建成功，sa-peg-uspio和peg-uspio溶液均呈黑色，未出現(xiàn)明顯聚集。peg-uspio的水合粒徑為22.73±3.31nm，分散系數(shù)(pdi)為0.21±0.02，zeta電位為4.22±0.53mv。sa-peg-uspio水合粒徑為35.97±5.19nm，分散系數(shù)(pdi)為0.17±0.05，zeta電位為－7.91±1.22mv。因此，sa-peg-uspio為納米級(jí)復(fù)合物。

2.2裸鼠移植瘤體內(nèi)磁共振成像表現(xiàn)

肝癌裸鼠模型在進(jìn)行預(yù)定位組及對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)后得出的不同時(shí)間點(diǎn)磁共振成像結(jié)果如圖1及圖2所示，觀察納米顆粒注射前后不同時(shí)間點(diǎn)的圖像可以看到移植瘤的t2wi信號(hào)強(qiáng)度在10min時(shí)降至最低，但預(yù)定位組的移植瘤信號(hào)開始緩慢上升，在2h、4h及6h的圖像中，信號(hào)升高程度縮小，而在對(duì)照組中，1h及1h后的圖像可見到移植瘤的信號(hào)回升到平掃前的信號(hào)強(qiáng)度。把感興趣區(qū)的t2wi信號(hào)強(qiáng)度值收集并計(jì)算出相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度△si后，繪制相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖(圖3)，從圖中可清晰地看到預(yù)定位增強(qiáng)組在10min時(shí)，信號(hào)達(dá)最低，并緩慢升高后進(jìn)入平臺(tái)期，信號(hào)改變不明顯，而對(duì)照組在10min時(shí)達(dá)到一定低值，然后信號(hào)從1h開始回升到平掃的狀態(tài)。從相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖標(biāo)示的星號(hào)可看到，在1h、2h、4h及6h時(shí)間點(diǎn)的圖像中，預(yù)定位增強(qiáng)組與對(duì)照組感興趣區(qū)的相 對(duì)信號(hào)強(qiáng)度△si的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p值均小于0.01。

2.3裸鼠移植瘤的病理分析

正置顯微鏡下顯示預(yù)定位組和對(duì)照組的普魯士藍(lán)鐵染色情況如圖4、圖5所示，圖中可見預(yù)定位增強(qiáng)組中hepg2細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)內(nèi)可見小顆粒狀藍(lán)染顆粒，顆粒主要出現(xiàn)在靠近血管的區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)。而對(duì)照組的細(xì)胞內(nèi)未見藍(lán)染顆粒。