專(zhuān)利名稱(chēng):生物質(zhì)水解工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工藝，所述工藝包含在含木素纖維素材料的水解中使用纖維素水解酶的分次投入(split dosing)。
發(fā)明背景
由于化石燃料的有限儲(chǔ)備和關(guān)于溫室氣體排放的擔(dān)心，存在關(guān)于使用可再生能源，例如發(fā)酵產(chǎn)物，例如生物乙醇的越來(lái)越多的關(guān)注。來(lái)自生物質(zhì)即含木素纖維素材料的乙醇生產(chǎn)是本領(lǐng)域已知的，并且可以包括含木素纖維素材料的預(yù)處理、酶促水解和發(fā)酵成乙醇。在水解中使用的酶的成本已視為此類(lèi)工藝的收益性的限制。因此，需要提供改善的并且更有效的工藝用于將含木素纖維素材料酶促水解成適合于發(fā)酵的底物。
本申請(qǐng)的發(fā)明人目前已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將纖維素水解酶分成至少2個(gè)劑量 并且在不同階段加入所述劑量，可以顯著改善高干固體生物質(zhì)漿料的水解。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及這樣的工藝，其包括酶促水解高干固體濃度的含木素纖維素材料，和任選地將水解產(chǎn)物發(fā)酵成發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇，其中纖維素水解酶在該工藝中的兩個(gè)或更多個(gè)階段加入。
相應(yīng)地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于自含木素纖維素材料產(chǎn)生水解產(chǎn)物的工藝，其包括如下步驟，(a)預(yù)處理含木素纖維素材料；(b)形成包含水、預(yù)處理的含木素纖維素材料和纖維素水解酶的漿料，(C)且溫育所述漿料，(d)加入更多水解酶，和(e)溫育所述漿料，以產(chǎn)生水解產(chǎn)物，其中所述漿料具有至少25%的干固體濃度。
發(fā)明詳述
含木素纖維素材料
術(shù)語(yǔ)“含木素纖維素材料”在本文中用于指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的材料。含木素纖維素材料通常稱(chēng)為“生物質(zhì)”。
木素纖維素的結(jié)構(gòu)不是酶促水解能夠直接接近的。因此，木素纖維素必須在壓力、濕度和溫度的適當(dāng)條件下例如通過(guò)酸水解進(jìn)行預(yù)處理，以便破裂木質(zhì)素密封且破壞纖維素的晶狀結(jié)構(gòu)。這引起半纖維素級(jí)分的增溶和糖化。纖維素級(jí)分隨后可以水解，例如通過(guò)纖維素酶酶促水解，以將碳水化合物聚合物轉(zhuǎn)化成單糖和寡糖，其可以發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。任選地,將發(fā)酵產(chǎn)物回收,例如通過(guò)蒸餾進(jìn)行回收。
任何含木素纖維素材料都根據(jù)本發(fā)明加以考慮。含木素纖維素材料可以是含有木素纖維素的任何材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含木素纖維素材料含有至少30重量％、優(yōu)選至少50重量％、更優(yōu)選至少70重量％、甚至更優(yōu)選至少90重量％木素纖維素。應(yīng)當(dāng)理解含木素纖維素材料還可以包含其他組成成分，例如纖維素材料，包括纖維素和半纖維素，并且還可以包含其他組成成分，例如蛋白質(zhì)性質(zhì)材料、淀粉、糖例如可發(fā)酵糖和/或不可發(fā)酵糖。
含木素纖維素材料一般例如在植物的莖、葉、皮、殼(hull，husk)和穗軸或樹(shù)的葉、枝和木材中發(fā)現(xiàn)。含木素纖維素材料可以是但不限于草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙以及漿和造紙廠(chǎng)殘余物。在本文中應(yīng)當(dāng)理解含木素纖維素材料可以是在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。
含木素纖維素材料可以包含玉米秸桿，硬木材例如白楊木(poplar)和樺木(birch),軟木材例如松材,柳枝稷(switch grass),谷類(lèi)稻草(cereal straw)和/或殼(husk)例如來(lái)自稻、小麥、大麥、黑麥等的稻草，市政固體廢物(MSW)，工業(yè)有機(jī)廢物，辦公室用紙，木屑(wood chip)，甘蔗渣，紙或漿加工廢物或其混合物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含木素纖維素材料是玉米稻桿。在另一個(gè)優(yōu)選方面，含木素纖維素材料是玉米纖維。
預(yù)處理
含木素纖維素材料可以以任何合適方式進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理可以在水解和/或發(fā)酵前進(jìn)行。預(yù)處理的目的是分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，并且這種方式改善了水解速率。預(yù)處理方法例如濕氧化和堿預(yù)處理靶向木質(zhì)素，而稀酸和自水解靶向半 纖維素。蒸汽爆炸是靶向纖維素的預(yù)處理的例子。
根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理步驟(a)可以是使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)的常規(guī)預(yù)處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理在含水漿料中進(jìn)行。含木素纖維素材料可以在預(yù)處理過(guò)程中以10-80重量％之間、優(yōu)選20-70重量％之間、尤其是30-60重量％之間例如約50
重量％的量存在。
預(yù)處理在水解和/或發(fā)酵之前進(jìn)行。
術(shù)語(yǔ)“化學(xué)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理的例子包括用例如稀酸、石灰、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳處理。進(jìn)一步地，濕氧化和pH控制的水熱解也是考慮的化學(xué)預(yù)處理。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)預(yù)處理是酸處理，更優(yōu)選地連續(xù)稀酸和/或弱酸處理，例如用硫酸或另一種有機(jī)酸和/或無(wú)機(jī)酸處理，所述酸例如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。還可以使用其他酸。弱酸處理意指處理PH處于1-5的范圍中，優(yōu)選pH 1-3。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，酸濃度是在0. 1-2. 0重量％酸(優(yōu)選硫酸)的范圍中。酸可以與含木素纖維素材料接觸，并且混合物可以在160-220°C，例如165-195°C范圍的溫度保持范圍在例如1-60分鐘例如2-30分鐘或3-12分鐘的時(shí)期。可以應(yīng)用強(qiáng)酸例如硫酸的添加以去除半纖維素。這增強(qiáng)了纖維素的可消化性。
還考慮了其他技術(shù)。纖維素溶劑處理已顯示將約90%纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。還已顯示當(dāng)木素纖維素結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，酶促水解可以得到極大增強(qiáng)。堿H2O2、臭氧、有機(jī)溶劑(organosolv)(使用在含水的醇中的(A1)2S04、FeCl3、路易斯酸)、甘油、二卩惡燒、苯酹或乙二醇屬于已知的破壞纖維素結(jié)構(gòu)且促進(jìn)水解的溶劑(Mosier等人BioresourceTechnology 96 (2005)，第 673-686 頁(yè))。
用堿例如NaOH、Na2CO3和/或氨等的堿性化學(xué)預(yù)處理也根據(jù)本發(fā)明加以考慮。使用氨的預(yù)處理方法在例如 W02006110891、W0200611899、W0200611900、W02006110901 (其在此引入作為參考)中描述。
濕氧化技術(shù)涉及氧化劑的使用，例如基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預(yù)處理的例子包括用DMSO (二甲亞砜)等處理?；瘜W(xué)預(yù)處理一般進(jìn)行1-60分鐘，例如5-30分鐘，但取決于待預(yù)處理的材料可以進(jìn)行更短或更長(zhǎng)的時(shí)期。[0025]合適預(yù)處理方法的其他例子由下述描述Schell等人(2003)Appl.Biochemand Biotechn.第 105-108 卷，第 69-85 頁(yè)，Mosier 等人 BioresourceTechnology96 (2005) 673-686, Ahring 等人在 W02006032282 和 W0200160752 中，F(xiàn)oody 等人在W02006034590中，和Ballesteros等人在美國(guó)公開(kāi)號(hào)20020164730中，所述參考文獻(xiàn)在此全部引入作為參考。
術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”指促進(jìn)自含木素纖維素材料分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的任何機(jī)械(或物理)處理。例如，機(jī)械預(yù)處理包括多個(gè)類(lèi)型的研磨、照射、汽蒸/蒸汽爆炸、濕氧化和其他水熱處理。
機(jī)械預(yù)處理包括粉碎(大小的機(jī)械減少)。粉碎包括干磨、濕磨和振動(dòng)球磨。機(jī)械預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高壓意指在300-600psi范圍中、優(yōu)選400-500psi例如約450psi的壓力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，高溫意指在約100-300°C范圍中、優(yōu)選約140-235°C的溫度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，機(jī)械預(yù)處理是分批工藝，蒸汽槍水解儀系統(tǒng)(steam gun hydrolyzer system),其使用如上定 義的高壓和高溫。Sunds Hydrolyzer (可從Sunds Defibrator AB (瑞典)獲得)可以用于此。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械兩種預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。需要時(shí)，化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理可以連續(xù)或同時(shí)進(jìn)行。
相應(yīng)地，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)含木素纖維素材料實(shí)施化學(xué)和機(jī)械兩種預(yù)處理，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，機(jī)械預(yù)處理在蒸汽爆炸預(yù)處理前進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理作為稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步驟進(jìn)行。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(或AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。
如在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)預(yù)處理”指任何促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素自含木素纖維素材料分離和/或釋放的生物學(xué)預(yù)處理。生物學(xué)預(yù)處理技術(shù)可以涉及應(yīng)用木質(zhì)素溶解微生物(參見(jiàn)例如，Hsu, T. -A. , 1996, Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol Production and Utilization, Wyman, C. E.,編輯，Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212 ；Ghosh, P.和 Singh, A. ,1993, Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomass, Adv.AppI.Microbiol.39 :295-333 ；McMillan, J. D. ,1994，Pretreatinglignocellulosic biomass a review,于 EnzymaticConversion of Biomass for FuelsProduction, Himmel, M. E. , Baker, J. 0.和 Overend, R. P.,編輯，ACS Symposium Series566, American Chemical Society, Washington, DC,第 15 章；Gong, C. S. , Cao, N. J. , Du,J.和 Tsao, G. T. , 1999, Ethanol production from renewable resources,于 Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T.,編輯，Springer-Verlag BerlinHeidelberg, Germany, 65 :207-241 ；01sson, L.和 Hahn-Hagerdal, B. , 1996, Fermentationof lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18 312-331 ;以及 Vallander, L.和 Eriksson, K. -E. L. , 1990, Production of ethanol fromlignocellulosic materials State of the art, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol. 42 63-95)。
預(yù)處理的含木素纖維素材料的洗滌
當(dāng)預(yù)處理含木素纖維素材料時(shí)，可產(chǎn)生對(duì)酶抑制性的降解產(chǎn)物。洗滌預(yù)處理的含木素纖維素材料以去除酶的抑制劑可以改善酶促水解。
抑制劑是木素纖維素降解產(chǎn)物，包括木質(zhì)素降解產(chǎn)物、纖維素降解產(chǎn)物和半纖維素降解產(chǎn)物。木質(zhì)素降解產(chǎn)物可以在實(shí)質(zhì)上是酚類(lèi)的。半纖維素降解產(chǎn)物包括來(lái)自糖(例如己糖和/或戊糖)的呋喃，所述糖包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，包括寡糖。認(rèn)為對(duì)酶抑制性的化合物包括在PCS液中存在的木寡糖(XOOs)或XOO和可溶性木質(zhì)素的復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)用洗滌溶液洗滌從預(yù)處理的含木素纖維素材料中去除對(duì)酶抑制性的可溶性化合物。洗滌溶液優(yōu)選是水性洗滌溶液。洗滌溶液可以是基本上純的水溶液，或具有顯著量的添加劑例如去污劑和/或有機(jī)溶劑的水，以改善對(duì)酶抑制性的化合物的提取和/或可溶性。
水解
在發(fā)酵前和/或與發(fā)酵同時(shí)，將預(yù)處理且洗滌的含木素纖維素材料酶促水解，以將纖維素和半纖維素分解成糖和/或寡糖。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水解可以作為分批補(bǔ)料工藝進(jìn)行，其中將預(yù)處理的含木素纖維素材料(底物)逐步補(bǔ)料給例如含酶的水解溶液。預(yù)處理的含木素纖維素材料可以在一個(gè)或多個(gè)不同批次中，作為一個(gè)或多個(gè)不同的連續(xù)流或作為一個(gè)或多個(gè)不同批次和一個(gè)或多個(gè)不同的連續(xù)流的組合供應(yīng)給含酶水解溶液。水解自始至終的干固體濃度是至少20 %、更優(yōu)選至少25 %、至少26 %、至少27 %、至少28 %、至少29 %或甚至至少30 %。
根據(jù)本發(fā)明，使用至少酶內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4);纖維二糖水解酶(EC3. 2. I. 91)和P -葡糖苷酶(EC 3. 2. I. 21)水解預(yù)處理的含木素纖維素材料。
可以在水解過(guò)程中應(yīng)用的另外的酶在下文“酶”部分中描述，并且包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、內(nèi)切或外切半乳聚糖酶、及其兩種或更多種的混合物。
用于水解的一種或多種酶能夠?qū)⑾礈斓念A(yù)處理的含木素纖維素材料直接或間接轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖，其可以發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。
根據(jù)本發(fā)明，將酶的量分成至少兩個(gè)劑量，其中第一個(gè)在水解步驟起始時(shí)應(yīng)用，而一個(gè)或多個(gè)剩余劑量隨后在水解過(guò)程中應(yīng)用。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將酶的量分成大致相等大小的兩個(gè)劑量，前一半在水解步驟起始時(shí)應(yīng)用，而在應(yīng)用剩余劑量前，將漿料溫育約12-48小時(shí)，優(yōu)選約18-36小時(shí)，更優(yōu)選約20-30小時(shí)。水解繼續(xù)另外的48-72小時(shí)。
同樣考慮了其中將酶的量分成大致相等和/或不同大小的幾個(gè)劑量且在水解過(guò)程中以大致有規(guī)律和/或無(wú)規(guī)律的間隔應(yīng)用的實(shí)施方案。酶甚至可以在水解或至少水解的前一半過(guò)程中作為連續(xù)添加的稀釋酶制備物應(yīng)用。
水解即工藝步驟(c)+ (e)的完整持續(xù)時(shí)間優(yōu)選在72-120小時(shí)之間。
不受理論束縛，認(rèn)為來(lái)自使用分次酶劑量的積極效果是因?yàn)橐话愣悦冈谒獠襟E過(guò)程中是滅活的，所述酶尤其是纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II以及程度較低的內(nèi)切葡聚糖酶。這是為何在其中作用于酶的剪切力更強(qiáng)的高干固體濃度下觀(guān)察到積極效果的原因。通過(guò)使用分次酶投入且延遲一個(gè)或多個(gè)劑量向溫育中加入，在水解的隨后階段中的剩余酶活性得到增加。
酶促處理在可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地測(cè)定的條件下在合適的水環(huán)境中進(jìn)行。優(yōu)選地，水解在25V -70°C之間、優(yōu)選在40°C -60°C之間、尤其是約50°C的溫度進(jìn)行。該工藝優(yōu)選在3-8范圍中的pH、優(yōu)選pH 4-6、尤其是約pH 5進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將水解產(chǎn)物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
考慮水解和發(fā)酵可以同時(shí)(SHHF工藝)或連續(xù)(SHF工藝)進(jìn)行。
發(fā)酵
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖例如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的至少一種發(fā)酵生物發(fā)酵預(yù)處理的(且水解的)含木素纖維素材料。
發(fā)酵優(yōu)選進(jìn)行8-96小時(shí)之間、優(yōu)選12-72、更優(yōu)選24-48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵在20-40°C之間、優(yōu)選26-34°C、特別是約32°C的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH是pH 3-6、優(yōu)選約pH 4-5。
優(yōu)選用于乙醇發(fā)酵的是屬于物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，優(yōu)選針對(duì)高水平乙醇即高達(dá)例如約10、12或15體積％乙醇或更多，例如20體積％乙醇有抗性的菌株。
根據(jù)本發(fā)明考慮的是同時(shí)水解和發(fā)酵(SHF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，不存在用于水解的單獨(dú)保留階段，意指一種或多種水解酶和發(fā)酵生物一起加入。當(dāng)發(fā)酵與水解同時(shí)進(jìn)行時(shí)，溫度優(yōu)選在26°C _35°C之間、更優(yōu)選在30°C _34°C之間、例如約32°C。根據(jù)本發(fā)明可以應(yīng)用包括在不同溫度的至少兩個(gè)保留階段的溫度程序。
在預(yù)處理的含木素纖維素材料的洗滌過(guò)程中，溶解的糖可以在再循環(huán)的水性洗滌溶液中累積。溶解的糖將包含來(lái)自半纖維素降解的C5糖，例如木糖。這些糖可以用合適的發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵生物能夠?qū)5糖轉(zhuǎn)化成所需發(fā)酵產(chǎn)物。這種C5發(fā)酵可以分開(kāi)進(jìn)行，或者可以將在再循環(huán)的水性洗滌溶液中累積的溶解的糖加入水解的含木素纖維素材料中，用于組合的C6和C5發(fā)酵。此類(lèi)發(fā)酵優(yōu)選用能夠發(fā)酵C6糖(例如葡萄糖)和C5糖(例如木糖)兩者的至少一種生物進(jìn)行?？商娲兀l(fā)酵可以用各自最佳化以利用C6或C5糖的至少兩種單獨(dú)的生物進(jìn)行，或者在一個(gè)發(fā)酵步驟中在允許兩種生物發(fā)酵的條件下，或者作為至少兩個(gè)發(fā)酵步驟，各自在允許所述生物之一發(fā)酵的條件下。
本發(fā)明的工藝可以作為分批、分批補(bǔ)料或作為連續(xù)工藝進(jìn)行。優(yōu)選地，發(fā)酵步驟作為連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行。
回收
在發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物可以與發(fā)酵肉湯分離。肉湯可以進(jìn)行蒸餾以提取發(fā)酵產(chǎn)物，或發(fā)酵產(chǎn)物可以通過(guò)微濾或膜過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵肉湯中提取。可替代地，發(fā)酵產(chǎn)物可以通過(guò)汽提(stripping)進(jìn)行回收?；厥辗椒ㄊ潜绢I(lǐng)域眾所周知的。
發(fā)酵產(chǎn)物
本發(fā)明的工藝可以用于產(chǎn)生任何發(fā)酵產(chǎn)物。尤其考慮的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如HjPCO2);抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素、B12、￠-胡蘿卜素)；和激素。
還考慮的產(chǎn)物包括可消費(fèi)的醇工業(yè)產(chǎn)品，例如啤酒和葡萄酒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物是醇，尤其是乙醇。根據(jù)本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇可以?xún)?yōu)選是燃料酒精/乙醇。然而，在乙醇的情況下，它還可以用作飲用乙醇。
發(fā)酵牛物
術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”指適合于產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物的任何生物，包括細(xì)菌和真菌生物。根據(jù)本發(fā)明尤其合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻抢缙咸烟侵苯踊蜷g接發(fā)酵，即轉(zhuǎn)化成所需發(fā)酵產(chǎn)物。還適合的是能夠?qū)5糖例如木糖轉(zhuǎn)化成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物。發(fā)酵生物的例子包括真菌生物，尤其是酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomyces spp.)菌株，特別是釀酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株；畢赤酵母屬(Pichia)菌株，特別是樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis),例如樹(shù)干畢赤酵母CBS 5773 ;假絲酵母屬(Candida)菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)或博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)菌株。其他考慮的酵母包括發(fā)酵 單胞菌屬(Zymomonas);漢遜酵母屬(Hansenula),特別是異常漢遜酵母(H. anomala)；克魯維酵母屬(Klyveromyces),特別是脆壁克魯維酵母(K. fragilis);和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),特別是粟酒裂殖酵母(S. pombe)菌株。
商購(gòu)可得的酵母包括例如ETHANOL RED 酵母(可從Fermentis/Lesaffre，USA獲得)，F(xiàn)ALI (可從 Fleischmann’ s Yeast, USA 獲得)，SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鮮酵母(可從Ethanol Technology，WI，USA 獲得)，BI0FERM AFT 和 XR(可從NABC-North AmericanBioproducts Corporation, GA, USA獲得)，GERT STRAND (可從瑞典Gert Strand AB獲得)，和 FERMI0L (可從 DSM Specialties 獲得)。ANQI YEAST (可從 Anqi yeast (CHIFENG) CO.，LTD，中國(guó)獲得)。
酶
盡管在本發(fā)明的工藝的背景中未具體提及，但應(yīng)當(dāng)理解酶(以及其他化合物)以
“有效量”使用。
纖維素酶如本文使用的術(shù)語(yǔ)“纖維素酶”應(yīng)理解為包含纖維二糖水解酶(EC3. 2. I. 91)，例如纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II，以及內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4)和@ -葡糖苷酶(EC 3. 2. I. 21)。纖維素酶在水解步驟中應(yīng)用。
為了有效，纖維素和半纖維素的消化需要協(xié)同作用的幾個(gè)類(lèi)型的酶。至少3個(gè)類(lèi)別的酶對(duì)于將纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖是必需的隨機(jī)切開(kāi)纖維素鏈的內(nèi)切葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4);從纖維素鏈末端切割纖維二糖單位的纖維二糖水解酶(EC 3. 2. I. 91)，和將纖維二糖和可溶性纖維糊精轉(zhuǎn)化成葡萄糖的P -葡糖苷酶(EC 3. 2. I. 21)。在涉及纖維素生物降解的這3個(gè)類(lèi)別的酶中，纖維二糖水解酶是用于降解天然結(jié)晶纖維素的關(guān)鍵酶。術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶I”在本文中定義為纖維素I，4-0 -纖維二糖糖苷酶(也稱(chēng)為外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶或I，4-P -纖維二糖水解酶)活性，如在酶類(lèi)別EC 3. 2. I. 91中定義的，其通過(guò)從鏈的非還原端釋放纖維二糖，催化纖維素和纖維四糖中的1，4-P-D-葡糖苷鍵水解。術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶II活性”的定義是相同的，除了纖維二糖水解酶II從鏈的還原端攻擊外。
內(nèi)切葡聚糖酶(EC編號(hào)3.2. 1.4)催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-P-D-糖苷鍵、在混合的￠-1,3葡聚糖例如谷類(lèi)
3-D-葡聚糖或木糖葡聚糖和含有纖維質(zhì)部分的其他植物材料中的3_1，4鍵的內(nèi)水解。審定名稱(chēng)是內(nèi)切-1，4-P-D-葡聚糖4-葡聚糖(glucano)水解酶，但在本說(shuō)明書(shū)中使用縮寫(xiě)術(shù)語(yǔ)內(nèi)切葡聚糖酶。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素酶活性可以衍生自真菌來(lái)源，例如木霉屬(Trichoderma)菌株，優(yōu)選里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株；腐質(zhì)霉屬(Humicola)菌株，例如特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子菌屬 (Chrysosporium)菌株,優(yōu)選 Chrysosporium Iucknowense 菌株。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素酶制備物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性(GH61A)的多肽，優(yōu)選公開(kāi)于W02005074656中的多肽。纖維素酶制備物可以進(jìn)一步包含P _葡糖苷酶，例如公開(kāi)于US 60/832,511中的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維素酶制備物還包含CBH II,優(yōu)選土生梭孢殼(Thielavia terrestris)纖維二糖水解酶II CEL6A。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維素酶制備物還包含衍生自里氏木霉的纖維素酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素酶制備物是在實(shí)施例I中使用且公開(kāi)于WO 2008/151079中的纖維素酶制備物，所述纖維素酶制備物包含衍生自里氏木霉的纖維素分解酶，公開(kāi)于W02005074656中具有纖維素分解增強(qiáng)活性(GH61A)的多肽，和公開(kāi)于WO 2008/151079中的煙曲霉(Aspergillusfumigatus) ^ -葡糖苷酶。
纖維素酶可以是商購(gòu)可得的產(chǎn)品，例如CELLUCLAST 、I. 5L或CELLUZYME 或 Cellic Ctec (都來(lái)自 Novozymes A/S、丹麥)或 ACCELLERASE 1000 或 ACCELLERASE 1500 (都來(lái)自 Genencor Int.)。
纖維素酶可以以0. 1-100FPU/克干固體(DS)、優(yōu)選0. 5-50FPU/克DS、尤其是1-20FPU/克DS的范圍投入。
纖維素酶可以以0. I-IOOOOmg酶蛋白(EP) /kg干固體(DS)、優(yōu)選0. 5_5000mgEP/kg DS、尤其是l-2500mg EP/kg DS的范圍投入。
半纖維素酶:半纖維素可以通過(guò)半纖維素酶和/或酸水解進(jìn)行分解，以釋放其五和六碳糖組分。
可以使用適合于在水解半纖維素中使用的任何半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶、內(nèi)切或外切半乳聚糖酶、及它們中兩種或更多種的混合物。優(yōu)選地，用于在本發(fā)明中使用的半纖維素酶是外切作用的半纖維素酶，并且更優(yōu)選地，半纖維素酶是這樣的外切作用的半纖維素酶，其具有在低于PH 7、優(yōu)選pH 3-7的酸性條件下水解半纖維素的能力。適合于在本發(fā)明中使用的半纖維素酶組合物的例子包括 VISC0ZYME 和 ULTRAFL0 (可從 NovozymesA/S，丹麥獲得)。
用于在本發(fā)明中使用的木聚糖酶￠0 3. 2. I. 8)優(yōu)選是內(nèi)切-I，4- P -木聚糖酶，并且優(yōu)選屬于糖苷水解酶家族10或11(GH10或GH11)。GHlO或GHll在Cantarel等人(2008)于 Nucl. Acids Res. 2009 37 D233-D238 中和在 www. cazy. org 上定義。
木聚糖酶可以是任何來(lái)源的，包括哺乳動(dòng)物、植物或動(dòng)物來(lái)源；然而，優(yōu)選木聚糖酶是微生物來(lái)源的。特別地，木聚糖酶可以是可衍生自絲狀真菌或酵母的那種。優(yōu)選地，木聚糖酶衍生自絲狀真菌例如曲霉屬菌種(Aspergillus sp.)、芽孢桿菌屬菌種(Bacillussp.)、腐質(zhì)霉屬菌種(Humicola sp.)、毀絲霉屬菌種(Myceliophotora sp. )、Poitrasia 屬菌種、根毛霉屬菌種(Rhizomucor sp.)或木霉屬。木聚糖酶優(yōu)選是GHlO木聚糖酶。
最優(yōu)選的是衍生自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)且作為木聚糖酶II公開(kāi)于TO 1994/021785中的木聚糖酶。
在本發(fā)明的工藝中應(yīng)用的用于處理使用過(guò)的洗滌溶液的木聚糖酶優(yōu)選是固定的木聚糖酶。如果使用非固定的木聚糖酶，那么它以0.001-1. Og/kg DS底物的量、優(yōu)選以0. 005-0. 5g/kg DS底物的量、且最優(yōu)選0. 05-0. 10g/kg DS底物加入。
木聚糖酶還可以以0.001-1. Og/kg DS底物的量、優(yōu)選以0.005-0. 5g/kg DS底物的量、且最優(yōu)選0.05-0. 10g/kg DS底物在本發(fā)明的水解步驟中加入。
阿魏酸酯酶3. I. 1.73)催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基自酯化的糖的水解，其通常為阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖。合適的阿魏酸酯酶可以得自絲狀真菌 (例如，木霉屬、亞灰樹(shù)花菌屬(Meripilus)、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium))或細(xì)菌(例如芽孢桿菌屬)菌株，例如得自黑曲霉(Aspergillus niger),例如由Faulds等人1994，Microbiology, 140，第 779-787 頁(yè)描述的 FAEIII 阿魏酸酯酶。
阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. I. 55)催化a -L-阿糖胞苷中的末端非還原a -L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。
半乳聚糖酶3. 2. I. 89)，阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-I，4-3-半乳糖苷酶，催化阿拉伯半乳聚糖中的1，4-D-半乳糖苷鍵的內(nèi)水解。
果膠酶(EC 3. 2. I. 15)催化果膠酸鹽和其他聚半乳糖醛酸中的l，4_a -D-半乳糖醒酸(galactosiduronic)鍵的水解。
木糖葡聚糖酶催化木葡聚糖的水解。
半纖維素酶可以以有效水解半纖維素的量加入，例如以約0. 001-0. 5重量％干固體(DS)的量，更優(yōu)選約0. 05-0. 5重量％ DS0
材料與方法
酶
纖維素酶制備物包含衍生自里氏木霉的纖維素分解酶，公開(kāi)于W02005074656中具有纖維素分解增強(qiáng)活性(GH61A)的多肽，和公開(kāi)于W02008/151079中的煙曲霉P -葡糖苷酶。所述纖維素酶制備物公開(kāi)于W02008/151079中。
實(shí)施例I
將玉米秸桿在205°C使用蒸汽爆炸預(yù)處理5分鐘。將所得到的PCS (預(yù)處理的玉米秸桿)使用自來(lái)水洗滌，以去除可溶性抑制劑。分批補(bǔ)料水解用經(jīng)洗滌的PCS分別以15%、20%和30% TS(總固體)進(jìn)行。經(jīng)洗滌的PCS的所有分批補(bǔ)料以12.6% TS起始，并且需要PCS的1、3或4個(gè)額外載量以達(dá)到15%、20%或30%的指定最終13。纖維素酶制備物在0小時(shí)以6mg EP/g纖維素的酶劑量加入，或分成相等兩半，并且一半在0小時(shí)加入，而另一半在24小時(shí)加入。水解在50°C和pH 5. 0進(jìn)行96小時(shí)。
每24小時(shí)抽取全部漿料的樣品，并且通過(guò)HPLC測(cè)定糖濃度。結(jié)果顯示于表I中。葡萄糖當(dāng)量轉(zhuǎn)化計(jì)算為在PCS中的總葡萄糖潛力(potential)中產(chǎn)生的纖維二糖和葡萄糖的百分比。
權(quán)利要求
1.一種用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生水解產(chǎn)物的工藝，其包括如下步驟， (a)預(yù)處理含木素纖維素材料； (b)形成包含水、預(yù)處理的含木素纖維素材料和纖維素水解酶的漿料， (C)溫育所述漿料， (d)加入更多水解酶，和 (e)溫育所述漿料，以產(chǎn)生水解產(chǎn)物， 其中所述漿料具有至少25%的干固體濃度。
2.權(quán)利要求
I的工藝，其中在步驟⑷前，將所述步驟(c)的漿料溫育約12-48小時(shí)，優(yōu)選約18-36小時(shí)，更優(yōu)選約20-30小時(shí)。
3.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中所述步驟(c)+ (e)的持續(xù)時(shí)間是約72-120小時(shí)。
4.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中所述纖維素水解酶包含纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II和內(nèi)切葡聚糖酶中的一種或多種。
5.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中將所述步驟(e)的水解產(chǎn)物發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
6.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其包括同時(shí)水解和發(fā)酵。
7.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其進(jìn)一步包括包含回收所述發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。
8.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。
9.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中所述含木素纖維素材料源于選自下述的材料玉米秸桿，玉米纖維，硬木材例如白楊木和樺木，軟木材，谷類(lèi)稻草例如麥秸，柳枝稷，稻殼，市政固體廢物，工業(yè)有機(jī)廢物，辦公室用紙或其混合物。
10.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中所述步驟(a)中的預(yù)處理是使用有機(jī)酸和/或無(wú)機(jī)酸進(jìn)行酸預(yù)處理，優(yōu)選硫酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物。
11.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中將所述步驟(a)中的含木素纖維素材料用O.1-2. O重量％的酸，優(yōu)選硫酸，進(jìn)行酸預(yù)處理。
12.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中將所述步驟(a)中的含木素纖維素材料在高溫和/或高壓下進(jìn)行機(jī)械預(yù)處理。
13.前述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的工藝，其中將所述步驟(a)中的含木素纖維素材料通過(guò)蒸汽爆炸、稀酸蒸汽爆炸和/或濕氧化進(jìn)行預(yù)處理。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及包含纖維素水解酶的分次劑量的生物質(zhì)工藝。
文檔編號(hào)C12P7/06GKCN102803498SQ201080058472
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年12月21日
發(fā)明者W.韓, 李冬敏, M.劉 申請(qǐng)人:諾維信公司, 中糧集團(tuán)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan