專利名稱:一種低成本的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無血清培養(yǎng)基。具體而言，本發(fā)明涉及昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞在體外進(jìn)行繁殖和培養(yǎng)，該工作始于20世紀(jì)初，現(xiàn)在已經(jīng)成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的工具，并發(fā)展成為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。細(xì)胞培養(yǎng)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)上的應(yīng)用日益廣泛，減少了試驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)目，正符合3Rs理論，即對(duì)待動(dòng)物要有人性(refinement),減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量(reduction)和盡量找到使用動(dòng)物的替代方法(replacement)的要求。
另外，在最近10年里無脊椎動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)在細(xì)胞和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了越來越重要的作用，應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)載體，昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主的真核表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)，特別是成功表達(dá)了大量的具有很高醫(yī)藥價(jià)值的活性蛋白質(zhì)之后，備受人們青睞。
要讓細(xì)胞很好地生長(zhǎng)和繁殖，必須努力創(chuàng)造合適的條件，最好模擬細(xì)胞原來生長(zhǎng)的體內(nèi)環(huán)境，包括溫度、PH值、滲透壓和氧氣供應(yīng)情況。細(xì)胞體外培養(yǎng)需要合適的培養(yǎng)瓶或者特定的培養(yǎng)界面，但是細(xì)胞培養(yǎng)中最關(guān)鍵的因素是培養(yǎng)基。
大多數(shù)商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基的主要問題是需要向培養(yǎng)基提供大量的血清成分(一般5-20% )，由于血清的高價(jià)格和有限制的可獲得性，這就造成了一個(gè)顯著的限制因子。此外，在培養(yǎng)基中動(dòng)物血清或血清白蛋白的使用從生產(chǎn)的觀點(diǎn)上看也是有問題的，這是因?yàn)檠逯形磋b定的蛋白質(zhì)的存在可使得下游產(chǎn)品純化的努力復(fù)雜化，并且其中污染的動(dòng)物病毒可造成嚴(yán)重的安全問題。類似的，在這些材料中發(fā)現(xiàn)的未鑒定的蛋白質(zhì)也向較小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)努力中引入了多余的變量。更進(jìn)一步地，血清本身的質(zhì)量在每一批都有變化，這就引入了污染的危險(xiǎn)，這些危險(xiǎn)必須由科學(xué)家或生產(chǎn)工程師針對(duì)血清的每一變化來研究和解決。
目前已經(jīng)開發(fā)出用于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，例如2006年7月4日提交的JP20060185008中所述的無血清培養(yǎng)基。但這些培養(yǎng)基普遍存在的問題是成本過高，如前述培養(yǎng)基中含有多種小分子添加物，一些重組蛋白。再比如，2004年公開的公開號(hào)CN1498267A所述培養(yǎng)基含有高濃度維生素和酵母提取物，提高了成本。不利于大規(guī)模的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供低成本的昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。該目的可通過下文所述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基包含5 10g/L碳水化合物、40 60g/L氨基酸、50 100g/L無機(jī)鹽、0.01
0.lg/L維生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化學(xué)限定脂質(zhì)混合物。[0009]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基不含半胱氨酸。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基含有0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中所述的碳水化合物不包含蔗糖。


圖1:High Five細(xì)胞在SFMB培養(yǎng)基和Express Five培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。
圖2:High Five細(xì)胞在SFMB培養(yǎng)基和Express Five培養(yǎng)基中蛋白表達(dá)情況的柱形圖。
發(fā)明詳述
士音養(yǎng)基組成
大部分昆蟲細(xì)胞都利用葡萄糖、果糖或麥芽糖作為主要碳源和能源，在多數(shù)培養(yǎng)基中，葡萄糖作為碳源能被迅速利用，雖然在桿狀病毒感染后昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)也會(huì)消耗部分蔗糖，但它在培養(yǎng)基中所 起主要作用是調(diào)節(jié)滲透壓。本發(fā)明的培養(yǎng)基中所含碳水化合物含量在8 10g/L，且不含蔗糖，有利于發(fā)酵過程中對(duì)滲透壓的控制?？捎糜诒景l(fā)明的碳水化合物包括，但不限于，2000-3000mg/L的麥芽糖，8000-10000mg/L的無水葡萄糖。
不同種類的昆蟲細(xì)胞對(duì)氨基酸有不同的要求，其中有14種是必需氨基酸，細(xì)胞本身不能合成，必須由培養(yǎng)基提供。Sf9細(xì)胞被認(rèn)為是甘氨酸和半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的。不過最近的文章表明，如果細(xì)胞是在上一代的早期(47 53h)繼代，sf9細(xì)胞可以在無胱氨酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在這種情況下，細(xì)胞會(huì)消耗更多的蛋氨酸來合成半胱氨酸。另有研究表明，在銨離子存在的條件下，Sf9細(xì)胞和Sf21細(xì)胞也可以在無谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。然而，Mendonqa 等(Laura A.Palomares and Octavio T.Ramirez.Theeffect of dissolved oxygen tension and the utility of oxygen uptake rateininsect cell culture.Cytotechnology.1996, (22) 225-237)指出缺少谷氨酸胺會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，幾乎所有的昆蟲細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺都有較高的要求。因此，昆蟲細(xì)胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培養(yǎng)基中攝取有效，所以各類培養(yǎng)基中都含有較高濃度的谷氨酰胺。然而，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)基中的谷氨酰胺濃度控制在較低濃度，例如0.45-0.6g/L時(shí)，也能達(dá)到良好的培養(yǎng)效果。本培養(yǎng)基含有40 60g/L氨基酸，且不含有半胱氨酸，同時(shí)含有l(wèi)_2g/L谷氨酰胺，有效降低了成本。可用于本發(fā)明的氨基酸包括，但不限于，300-500mg/L的天門冬氨酸，200-600mg/L的蘇氨酸，100-300mg/L的絲氨酸，200-300mg/L的谷氨酸，100-150mg/L的甘氨酸，400-600mg/L 的丙氨酸，1000-1500mg/L 的纟顏氨酸，300-600mg/L 的蛋氨酸，300-500mg/L 的異亮氨酸，700-1000mg/L的亮氨酸，2500_3000mg/L的苯丙氨酸，1200-1800mg/L的賴氨酸，400-700mg/L 的組氨酸，1200-1800mg/L 的精氨酸，900_1200mg/L 的脯氨酸，1800-3200mg/L的天門冬氨酸，450-600mg/L的谷氨酰胺，180-220mg/L的羥脯氨酸，160-260mg/L的胱氨酸以及300-400mg/L的酪氨酸。
維生素對(duì)促進(jìn)昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞貼附有積極作用。一般認(rèn)為，泛酸、異己酸、乙酸及核黃素等對(duì)細(xì)胞的存活是有利的，而膽堿、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促進(jìn)細(xì)胞增殖。本培養(yǎng)基含有0.01 0.lg/L維生素?？捎糜诒景l(fā)明的維生素包括，但不限于 0.001-0.006mg/L 生物素，0.080-0.120mg/L D-泛酸鈣，0.160-0.200mg/L 煙酸，0.0040-0.010mg/L 對(duì)氨基苯甲酸，0.002-0.010mg/L 鹽酸吡哆醇，0.0003-0.0OlOmg/L維生素BI，0.1-0.06mg/L維生素B12，0.2-0.4mg/L核黃素；以及含于10000X濃縮液的200.0-400mg/L 氯化膽堿。
在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度略高，這是因?yàn)槔ハx細(xì)胞要在高于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的滲透壓中生長(zhǎng)，并且各無機(jī)鹽離子之間需要平衡，其中Na+/K+比例在某些細(xì)胞系中有嚴(yán)格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+等能促進(jìn)細(xì)胞貼附和增加產(chǎn)量，其中Al3+和Zn2+還可以促進(jìn)病毒的感染和復(fù)制。本培養(yǎng)基含有50 100g/L無機(jī)鹽?？捎糜诒景l(fā)明的無機(jī)鹽包括，但不限于，2000-3000mg/L 的 CaCl2, 3000-4000mg/L 的 MgSO4, 500-800mg/L 的 KCl，150-200mg/L 的 NaHCO3,1500_2000mg/L 的 NaCl，400_600mg/L 的 NaH2PO4 ；含于10000X 濃縮液的 0.01-0.03mg/L CoC12_6H20，0.10-0.20mg/L CuC12_2H20，0.01-0.02mg/LMnCl2-4H20，0.02-0.20mg/L ZnCl2,以及 0.08-0.30mg/L((NH4)6Mo7024_4H20)。
酵母提取物(yeaSt0late，YL)是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分，YL是維生素和嘌呤的主要來源，本發(fā)明中可包含，例如，12-20g/L的酵母提取物。
本發(fā)明的無血清完全培養(yǎng)基任選地包含蛋白胨成分，該蛋白胨也補(bǔ)償了基本培養(yǎng)基中游離氨基酸的減少，還提供了對(duì)血清或白蛋白的替代物。使用前，蛋白胨部分經(jīng)本領(lǐng)域公知的超濾或類似步驟預(yù)先純化，去除任何殘留的蛋白酶、內(nèi)毒素或其他可潛在地干涉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)聞分子量成分。
本發(fā)明的無血清完全培養(yǎng)基還包含其它成分，例如，20_40ml/L的化學(xué)限定脂質(zhì)混合物(100X, invetrogen)。
昆蟲細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)過程中，無血清培養(yǎng)基成本因素突出。若采用商業(yè)化培養(yǎng)基，往往超過一般企業(yè)負(fù)荷。故開發(fā)低成本高效能昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基具有廣泛前景。以往開發(fā)的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基或者成本較高，或者效果無法達(dá)到商業(yè)化培養(yǎng)基的水平。
本培養(yǎng)基所含成分種類少，含量低，配制簡(jiǎn)單，且能夠達(dá)到和商業(yè)化培養(yǎng)基同樣的效果。本培養(yǎng)基所含成分均為簡(jiǎn)單易得試劑，購買方便，成本低廉。對(duì)比成分組成類似的另一種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(公開號(hào):CN 1498267A)，氨基酸成分有所增加，維生素成分明顯減少，其他成分有所簡(jiǎn)化，脂質(zhì)體采用商業(yè)化產(chǎn)品，培養(yǎng)基生產(chǎn)配制更加方便，如果所有成分均采用Invitrogen及Sigma公司產(chǎn)品，則成本大約降低約50%。具有良好的商業(yè)化前景。
培養(yǎng)某制各
制備培養(yǎng)基的方法并不是關(guān)鍵性的。例如，培養(yǎng)基可以通過下面所述方法制得，即將所有成分及附加物先以各自的合適濃度溶解于水，然后加壓使溶液通過一個(gè)薄膜濾器過濾而制得無菌的培養(yǎng)基。如上文提到的，當(dāng)為了表達(dá)重組蛋白或病毒產(chǎn)物而培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基中的蛋白胨成分將優(yōu)選地預(yù)先純化以使以后的純化更容易，例如通過預(yù)過濾，隨后用具有比需收集的任何重組體或病毒產(chǎn)物小的分于量界限的膜進(jìn)行超濾。
細(xì)胞培養(yǎng)
用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的方法也不是關(guān)健性的.以與常規(guī)培養(yǎng)基大約相同的條件用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。 通常，在本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞是在一定溫度范圍并在對(duì)所選擇的特定細(xì)胞系合適的條件下培養(yǎng)的。
實(shí)施例[0029]本發(fā)明培養(yǎng)基命名為SFMB。下列實(shí)施例用于闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和
方面，不應(yīng)該解釋為限制了它的范圍。實(shí)施例中所用成分中氨基酸購自JRH，無機(jī)鹽、維生
素購自百靈威公司和Sigma,其它成分購自Invitrogen和Sigma。其中所用商業(yè)化培養(yǎng)基
為Express Five,購自Invitrogen公司。細(xì)胞株Sf9和High Five購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞密度通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法確定。蛋白表達(dá)量通過
ELISA或者純化后確定。
實(shí)施例1
無血清培養(yǎng)基的制備
利用在表I中所列的成分和量制備了本發(fā)明無血清培養(yǎng)基的特定實(shí)施方案，標(biāo)記
為 SFMB。
1.稱量
按照下表(1-9)稱取原料，部分溶解后制成濃縮液。
表I氨基酸(I)
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基包含5 10g/L碳水化合物、40 60g/L氨基酸、50 100g/L無機(jī)鹽、0.01 0.lg/L維生素、12_20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化學(xué)限定脂質(zhì)混合物， 其中，所述的培養(yǎng)基不含半胱氨酸，和 所述的氨基酸包括0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。
2.權(quán)利要求
1的無血清培 養(yǎng)基，其中所述的碳水化合物不包含蔗糖。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種昆蟲無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基包含5～10g/L碳水化合物、40～60g/L氨基酸、50～100g/L無機(jī)鹽、0.01～0.1g/L維生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化學(xué)限定脂質(zhì)混合物，本發(fā)明的培養(yǎng)基較目前的商用無血清培養(yǎng)基具有更低的成本。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基與商用無血清培養(yǎng)基可達(dá)到相近的細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N5/07GKCN101988047 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010174652
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2010年5月13日
發(fā)明者滕小諾, 徐龍飛, 蔡建華, 毛晨 申請(qǐng)人:維亞生物科技(上海)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),