專利名稱:一種棘胸蛙微衛(wèi)星dna標(biāo)記ⅱ及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種棘胸蛙的DNA分子遺傳標(biāo)記及其用途。
技術(shù)背景
微衛(wèi)星(又稱為簡單重復(fù)序列，SSR)是由1-6個核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列相對保守，根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計引物，可用PCR 擴增出微衛(wèi)星位點的序列。由于微衛(wèi)星中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同，因而擴增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核生物基因組中，而且隨機分布，具有高度多態(tài)性，選擇上中性，共顯性等特點，是十分有效的遺傳標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域。如用微衛(wèi)星標(biāo)記分析苧麻品種的親緣關(guān)系 (Zhou 等，2005，Progress in Natural Science，15 137-142)、用微衛(wèi)星 DNA 標(biāo)記進行豬品種分類的專利申請“適于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標(biāo)記”(公開號CN1370834A)、用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進行家蠶分子連鎖遺傳分析的專利申請“家蠶的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用”(公開號CN 1970792A)。
棘胸蛙(Paa spinosa David)，屬兩棲綱、無尾目、蛙科。棘胸蛙個體大，肉質(zhì)細嫩潔白，味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，素有“百蛙之王”的美稱。由于人為捕殺和自然環(huán)境的惡化，野生棘胸蛙資源遭到嚴(yán)重破壞，開展棘胸蛙人工養(yǎng)殖既有助于保護野生資源，又能滿足市場需求?，F(xiàn)在，棘胸蛙是我國重要的養(yǎng)殖蛙類之一，但是由于其基礎(chǔ)研究薄弱，要實現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)殖還有許多亟待解決的問題，其中包括需要一套有效的分子標(biāo)記對其進行遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)資源調(diào)查、標(biāo)記輔助育種等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，利用這些分子標(biāo)記能對棘胸蛙進行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，該微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記II的核苷酸序列為SEQ ID NO :4，該微衛(wèi)星編號為Ι^ρ19。
作為本發(fā)明的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的改進棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II引物為下列引物對，其中的核苷酸序列為5' -3'，
Psp 19 正向TCACAATCGACGTAATGG
反向ACACACAGAGGGTCACACT。
本發(fā)明還同時提供了棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的用途，其特征是用于對棘胸蛙進行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查或輔助育種。
實現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選及測序，確定了 8個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記I^spie、Pspl7,Pspl8, Pspl9、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。
本發(fā)明旨在分離克隆微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，建立棘胸蛙的微衛(wèi)星DNA的技術(shù)體系并利用這些分子標(biāo)記進行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。因此，本發(fā)明提供了 8個棘胸蛙微衛(wèi)星位點的DNA序列及擴增上述8個棘胸蛙微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，8個棘胸蛙微衛(wèi)星位點用于棘胸蛙種質(zhì)資源研究，遺傳關(guān)系分析，標(biāo)記輔助選種和標(biāo)記輔助育種，重復(fù)性好，多態(tài)性高，是一種可靠有效的分子標(biāo)記。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
圖1是本發(fā)明涉及的13個棘胸蛙自然種群的structure聚類圖(K = 3)。
具體實施方式
實施例1、棘胸蛙(CA)n微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建
依次進行以下步驟
1)、用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(廣西龍勝)基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因組DNA，酶切產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。
2)、將堿基互補的寡核苷酸Sau3AI Oligo A :5' -GGCCAGAGACCCCMGCTTCG-3‘和 Oligo B 5' -pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3‘(上海生工合成，HPLC 級純化，200pmol/ μ 1)各取10 μ 1輕輕蝸旋混勻，在PCR儀上80°C變性10分鐘，然后在室溫下使寡核普酸鏈緩慢退火復(fù)性約1小時，加入60 μ 1高純水制備成濃度為25ρπι01/μ 1帶有Sau3AI酶切識別位點的接頭。
3)、將上述步驟1)所得的酶切產(chǎn)物和步驟2)所得的接頭用T4DNA連接酶連接，將所得的連接液用維特潔公司的清潔試劑盒純化，去除鹽離子、蛋白和多余的接頭片段，溶解于50 μ 1 TE緩沖液中；得連接產(chǎn)物。
4)、用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(CA)15與步驟幻所得的連接產(chǎn)物DNA片段雜交。具體操作為在總體積100 μ 1雜交液(6 X SSC, 0. 1% SDS)中加入500ng連接產(chǎn)物和 IOOpmol生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針，并在95°C下變性10min，60°C雜交1小時。
5)、在步驟 4)所得物中加入 100 μ 1(10 μ g/μ 1)磁珠(Dynabeads Μ480，購自 Dynal Biotech公司)，并在室溫放置30分鐘。
6)、在磁力架上吸附磁珠，棄上清。磁珠用400 μ 1洗滌緩沖液(6 X SSC, 0. 1 % SDS) 在60°C下洗滌15分鐘，然后在室溫下分別用2XSSC和IXSSC溶液洗滌兩次，并棄上清。
7)、在步驟6)所得物中加入50 μ 1無菌水，在90°C下保溫10分鐘，小心吸取上清， 上清液即為含有(CA)n重復(fù)序列的單鏈DNA片段。以O(shè)ligoA為引物，以單鏈DNA片段為模板進行PCR擴增獲得雙鏈目的片段。
25 μ IPCR 反應(yīng)體系包含大約 IOOng 單鏈 DNA 片段，20mm Tris-HCI (pH8. 3)， IOOmmKCI, 3mm MgCl2, dNTP # 1000 ym,3pmol Oligo A, 0. 8units Taq polymerase (Shanghaipromega)0[0025]PCR循環(huán)程序設(shè)置為95°C預(yù)變性3分鐘，接著5個循環(huán)包括95°C變性30s，60°C 退火30s，72°C延伸45s，然后進行另外30個循環(huán)的92°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 55s，最后于72°C下延伸10分鐘。檢測PCR產(chǎn)物并使用維特潔公司的純化試劑盒純化，產(chǎn)物溶解于30 μ 1 TE緩沖液中。
8)、將步驟7)所得的擴增產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受細胞，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選。
實施例2、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物設(shè)計
依次進行以下步驟
1)、挑取實施例1所得的白色菌落并接種到:3ml LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒。
2)、以質(zhì)粒 DNA 為模板，采取三引物法(Gardner 等，1999，Journal of Heredity, 90,301-304)篩選含有(CA)n微衛(wèi)星序列的陽性克隆。
3)、將陽性克隆測序，分析是否含有(CA)n重復(fù)序列，以及是否有足夠的側(cè)翼序列用于引物設(shè)計。
4)、根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩側(cè)的保守序列，用primer premier5. 0軟件設(shè)計引物， 引物長度一般在16-22堿基之間，選擇擴增的目標(biāo)片段在150-350bp之間。
實施例3、棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記穩(wěn)定性和多態(tài)性檢測
用上述實施例2所得的微衛(wèi)星標(biāo)記擴增32個來自同一自然種群的棘胸蛙個體 (浙江)，確定了 8個多態(tài)性豐富，適于棘胸蛙遺傳多樣性檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記(表1)。具體操作過程如下
1)、用經(jīng)典的酚-氯仿法抽提32個棘胸蛙個體的DNA作為模板。
2)、設(shè)計的引物合成后對引物正確性和可行性進行實驗驗證，用溫度梯度PCR擴增多個模板。15 μ 1的PCR反應(yīng)體系中含大約50ng基因組DNA，IOmm Tris-HCI (pH8. 3), 50mm KCI, 1. 5mm MgCl2, dNTP # 500 μ m，lpmol弓|_，0. 5units Taq polymerase (Shanghai promega)。根據(jù)實驗結(jié)果確定哪些引物能夠擴增出穩(wěn)定的目的條帶，以及確定最佳退火溫度(見表一)。最終篩選出8個位點，分別命名為Ι^ρ16、Ι^ρ17、Ι^ρ18、Ι^ρ19、Ι^ρ20、 Psp21、Psp22、Psp23。
3)、分別用上述8個位點的8對引物(引物序列見表1)擴增這若干個棘胸蛙個體的DNA。其中任意一條SSR引物的5’端被加上一段沒有遠紅外熒光標(biāo)記的M13序列，而另一條IRDye標(biāo)記的M13引物同時包含在這個反應(yīng)體系中。按上述步驟2)的反應(yīng)條件進行 PCR擴增。PCR產(chǎn)物在LI-C0R4300S遺傳自動分析儀上進行基因分型，配合使用內(nèi)置STR分子量標(biāo)準(zhǔn)(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和軟件SAGAct自動判讀條帶，輔以人工校正。
4)、使用軟件CERVUS 2. 0統(tǒng)計等位基因數(shù)目，多態(tài)信息含量(PIC)，觀測雜合度 (Observed heterozygosities, Ho)禾口期望雜合度(Expected heterozygosities, He)。哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)偏離測試和位點間的連鎖不平衡檢驗(Linkagedisequilibrium, LD)使用 GENEP0P 軟件 version3. 4 完成，之后輔以連續(xù)的 Bonefermni校正。使用MICR0-CHEKER軟件估算每個位點的無效等位基因情況。
最終確定了以下8個棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，分別是[0040]編號為I^pl6的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 1所示
編號為Ι^ρ17的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 2所示
編號為I^pl8的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 3所示
編號為I^pl9的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 4所示
編號為Psp20的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 5所示
編號為Psp21的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 6所示
編號為Psp22的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 7所示
編號為Psp23的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO 8所示。
表1、引物特性表引物序列，退火溫度，片段大小
權(quán)利要求
1.一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，其特征是該微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的核苷酸序列為 SEQ ID N0:4，該微衛(wèi)星編號為Pspl9。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，其特征是擴增所述棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的引物為下列引物對，其中的核苷酸序列為5' -3'，Pspl9 正向TCACAATCGACGTAATGG 反向ACACACAGAGGGTCACACT。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的用途，其特征是用于對棘胸蛙進行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查或輔助育種。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II，該微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的核苷酸序列為SEQ ID NO4，該微衛(wèi)星編號為Psp19。本發(fā)明還同時提供了該棘胸蛙微衛(wèi)星DNA標(biāo)記II的用途用于對棘胸蛙進行遺傳分析、種質(zhì)資源調(diào)查和輔助育種。
文檔編號C12N15/11GKCN101805734 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010162348
公開日2012年2月1日 申請日期2008年10月23日
發(fā)明者葉容暉, 成斌, 楊光, 鄭榮泉 申請人:浙江師范大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),