專利名稱:一種卷煙煙氣總粒相物致突變性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種卷煙煙氣總粒相物致突變性的檢測(cè)方法，屬于煙草及卷煙煙氣安 全性評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
Ames試驗(yàn)是一種檢測(cè)外源化合物短期致DNA突變的實(shí)驗(yàn)方法，其基本原理是利用 外源化合物誘導(dǎo)組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變的特性來(lái)檢測(cè)外源化合物的致突 變能力。它是國(guó)際上公認(rèn)的化學(xué)致突變劑檢測(cè)的常規(guī)方法，也是近二十年食品毒理檢測(cè)以 及環(huán)境化學(xué)誘變劑檢測(cè)等的主要方法之一。該試驗(yàn)?zāi)莒`敏檢測(cè)出卷煙煙氣總粒相物誘發(fā)的 潛在遺傳危害，并且結(jié)果較為可靠，因此成為國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)煙草制品毒性的首選方法之一。
目前Ames試驗(yàn)平板摻入法最權(quán)威的當(dāng)屬食品毒理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明根據(jù)食品毒 理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上的操作步驟以及給定的藥品的參數(shù)，用于卷煙煙氣總粒相物的致突變檢測(cè)。 食品標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)[1]中組氨酸濃度為17. 435mg/250ml，頂層培養(yǎng)基數(shù)量為2. 0ml，頂層保溫溫 度45°C。但根據(jù)上述反應(yīng)體系無(wú)法檢測(cè)出卷煙煙氣總粒相物的致突變性，其自發(fā)回變菌落 數(shù)也很少，有時(shí)甚至沒(méi)有。而國(guó)外文獻(xiàn)[2-4]和專利報(bào)道文獻(xiàn)[8]的方法卻是采用預(yù)培養(yǎng) 法，缺點(diǎn)是增加操作步驟，費(fèi)時(shí)間。食品毒理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上陽(yáng)性物2-氨基芴和疊氮鈉濃度分 別為10ug/皿、1. 5ug/皿，對(duì)于陽(yáng)性物來(lái)說(shuō)，使用劑量偏高，對(duì)操作人員的安全性風(fēng)險(xiǎn)增高。 食品毒理檢測(cè)中樣品的濃度為0. lug-5mg/皿，一般選4-5個(gè)劑量。對(duì)于卷煙煙氣總粒相物 來(lái)說(shuō)，這個(gè)劑量范圍不合適，太寬，無(wú)法反應(yīng)出卷煙煙氣總粒相物的劑量-反應(yīng)關(guān)系。
重要參考文獻(xiàn)
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服食品毒理評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中Ames試驗(yàn)在檢測(cè)卷煙煙氣總粒相物致 突變性中的不足之處，而提供一種卷煙煙氣總粒相物致突變性的檢測(cè)方法。
本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的經(jīng)?；A(chǔ)上改進(jìn)而成。本發(fā)明根據(jù)影響Ames試驗(yàn)結(jié)果的幾 個(gè)重要因素，結(jié)合卷煙煙氣總粒相物這個(gè)特殊混合物，對(duì)組氨酸的濃度、頂層培養(yǎng)基所加的 量以及保持頂層培養(yǎng)基不會(huì)凝固的溫度進(jìn)行改進(jìn)，具體為
a.組氨酸的量為20-25mg/ml、頂層數(shù)量為2. 5ml、頂層保溫溫度43°C ；
b.卷煙煙氣總粒相物的致突變性的劑量范圍為25-500ug/皿，在這個(gè)劑量范圍 內(nèi)，能很好地檢測(cè)出劑量-反應(yīng)關(guān)系；
c.降低陽(yáng)性物的劑量，減少保護(hù)操作人員的健康風(fēng)險(xiǎn)；TA98菌株陽(yáng)性物采用2-氨 基芴，劑量低于10ug/皿，為1-lOug/皿；TA100菌株陽(yáng)性物采用疊氮鈉，劑量低于1. 5ug/ 皿，為 0. 15-1. 5ug/ 皿。
本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)改進(jìn)上述反應(yīng)體系以后確定了卷煙煙氣總粒相物的濃度，根據(jù)卷煙 煙氣總粒相物的濃度檢測(cè)致突變性結(jié)果見表2。
表1平板摻入法測(cè)定陽(yáng)性物(2-氨基芴和疊氮鈉)對(duì)TA98和TA100菌株的致突
變性結(jié)果
表2 10個(gè)不同卷煙煙氣總粒相物致突變性結(jié)果
本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)和預(yù)培養(yǎng)法相比，優(yōu)點(diǎn)在于操作步驟簡(jiǎn)化，縮短試驗(yàn)時(shí) 間，效果一致，細(xì)菌回復(fù)突變明顯，煙氣總粒相物在25-500ug/皿的劑量范圍內(nèi)，能檢測(cè)出致突變性，并呈現(xiàn)很好的劑量反應(yīng)關(guān)系。
具體實(shí)施方式
1.卷煙煙氣總粒相物(TPM)的制備
將卷煙在恒溫恒濕箱中平衡48小時(shí)，選取重量和吸阻一致的卷煙。按國(guó)標(biāo)方法， 分別在吸煙機(jī)上抽吸20支卷煙，劍橋?yàn)V片按10mgTPM/ml加入DMS0浸泡，超聲波提取20分 鐘，最后用濾紙過(guò)濾，分裝到凍存管中，保存于-70°C超低溫冰箱中備用。
2.菌株的鑒定
本實(shí)驗(yàn)室菌株鑒定遵照食品毒理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定操作步驟文獻(xiàn)[1]，鑒定合格 以后用于實(shí)驗(yàn)。菌株采用市場(chǎng)購(gòu)買的MOLTOX AMES ASSAY STDisc TA98和TA100兩種菌株。
3.底層培養(yǎng)基的配制
遵照食品毒理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟文獻(xiàn)[1]配制底層培養(yǎng)基。
4.頂層培養(yǎng)基配制
本方法配制的組氨酸濃度為20-25mg/250ml ；頂層培養(yǎng)基量為2. 5ml。將頂層培養(yǎng) 基分裝在10ml小試管中，120°C、20min常規(guī)高壓滅菌后放入43°C水浴鍋中保溫。頂層培養(yǎng) 基在43°C水浴中保溫不凝固。其它試劑濃度及配制方法同食品毒理檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟文獻(xiàn) [1]。
4.受試物配制
將放置在超低溫冰箱中的TPM取出，放置室溫使其融化，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)大量樣品檢 測(cè)發(fā)現(xiàn)選擇了 25、50、75、100、125、250、500呢/皿為檢測(cè)卷煙煙氣總粒相物的最佳劑量。 TPM母液濃度為10mg/ml，7個(gè)劑量分別取母液量為2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5、25、50ul/皿， 每個(gè)濃度做5個(gè)平板。陽(yáng)性對(duì)照，有活化系統(tǒng)時(shí)TA98陽(yáng)性對(duì)照為1-lOug/皿2-氨基芴； 無(wú)活化系統(tǒng)時(shí)TA100陽(yáng)性對(duì)照為0. 15-1. 5ug/皿疊氮鈉。陰性對(duì)照為溶劑對(duì)照(DMS0)，濃 度為50ul/皿。
5.受試物平板摻入
吸取不同體積的受試物與0. lml菌液，加入0.5ml 10% S9混合液；之后，取已滅 菌并在43°C水浴中保溫的頂層培養(yǎng)基(2. 5ml)，迅速在渦旋振蕩器上混勻，倒入底層平板 培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，37°C培養(yǎng)48h。
6.計(jì)數(shù)菌落及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
將平板放在菌落計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)而評(píng)價(jià)卷煙煙氣總粒相物的致
突變性。
權(quán)利要求
一種卷煙煙氣總粒相物致突變性的檢測(cè)方法，在Ames試驗(yàn)平板摻入法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，其特征在于a.組氨酸的量為20-25mg/ml、頂層數(shù)量為2.5ml、頂層保溫溫度43℃；b.卷煙煙氣總粒相物的致突變性的劑量范圍為25--500ug/皿；c.TA98菌株的陽(yáng)性物為2-氨基芴，采用的劑量為1-10ug/皿；TA100菌株的陽(yáng)性物為疊氮鈉，采用的劑量為0.15-1.5ug/皿。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種卷煙煙氣總粒相物致突變性的檢測(cè)方法，屬于煙草及卷煙煙氣安全性評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明在Ames試驗(yàn)平板摻入法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，其改進(jìn)點(diǎn)在于a.組氨酸的量為20-25mg/ml、頂層數(shù)量為2.5ml、頂層保溫溫度43℃；b.卷煙煙氣總粒相物的致突變性的劑量范圍為25-500μg/皿；c.TA98菌株的陽(yáng)性物為2-氨基芴，采用的劑量為1-10μg/皿；TA100菌株的陽(yáng)性物為疊氮鈉，采用的劑量為0.15-1.5μg/皿。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于操作步驟簡(jiǎn)化，縮短試驗(yàn)時(shí)間，效果一致，細(xì)菌回復(fù)突變明顯，陽(yáng)性物劑量降低，所選擇的煙氣總粒相物劑量范圍合時(shí)，能檢測(cè)出煙氣總粒相物的致突變性。
文檔編號(hào)C12Q1/02GKCN101851658SQ201010154088
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月23日
發(fā)明者倪紅梅, 夭建華, 李雪梅, 米其利, 繆明明, 黃海濤 申請(qǐng)人:云南煙草科學(xué)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan