專利名稱:一種編碼甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因的制作方法
—種編碼甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及生物技術(shù)，特別涉及以甲型流感病毒NP和M2e為靶抗原的基因工程甲型流感病毒疫苗的研制技術(shù)。
背景技術(shù)流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒引起的嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病，接種疫苗是預(yù)防流感傳播最有效的措施。傳統(tǒng)流感疫苗主要依賴表面抗原血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)誘發(fā)中和抗體發(fā)揮保護(hù)作用
，但這兩種抗原高度變異，不能誘發(fā)亞型間交叉保護(hù)，更難以預(yù)防未知甲型流感毒株引發(fā)的流感大流行[2’3]。因此，使用新策略研發(fā)甲型流感病毒不同亞型間具有交叉保護(hù)作用的廣譜流感大流行疫苗已成為流感疫苗研究的重要領(lǐng)域。研究表明，使用甲型流感病毒HA和NA之外的抗原研制的流感疫苗，通過誘發(fā)殺傷性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxicity T lymphocytes,
CTL)或抗體依賴的細(xì)胞殺傷(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)等作用，能在動(dòng)物中產(chǎn)生明顯亞型間交叉保護(hù)。其中基于高度保守的甲型流感毒內(nèi)部抗原核殼蛋白(Nucleoprotein, NP)[4]與基質(zhì)蛋白2(Matrix 2, M2)[5]構(gòu)建的多種形式的疫苗，包括DNA疫苗[6_11]、病毒載體疫苗[12_14]、表位肽疫苗[15’16]、蛋白亞單位疫苗[17_2°]、多抗原聯(lián)合疫苗[21_23]及佐劑疫苗[24_28]等，可以在小鼠中產(chǎn)生高水平的亞型間交叉保護(hù)，甚至可以交叉保護(hù)高致病性禽流感病毒H5N1的攻擊。NP主要通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL，M2主要通過其胞外區(qū)(Extracellular domain ofM2,M2e)的ADCC發(fā)揮免疫保護(hù)作用，是較有發(fā)展前景的兩種抗原[29’3°]。由于NP和M2e抗原在自然感染中誘發(fā)的免疫保護(hù)均較弱，因而增強(qiáng)這類抗原制備的疫苗的免疫強(qiáng)度，提高其交叉免疫保護(hù)效果，是這類疫苗研制中需要解決的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)有提高這類疫苗免疫效果的技術(shù)路線較為復(fù)雜，顯示出較好免疫保護(hù)效果的疫苗均為聯(lián)合疫苗，都使用兩種不同類型疫苗分別進(jìn)行初免和加強(qiáng)，生產(chǎn)成本高，免疫程序復(fù)雜，不適于疫苗大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛使用。聯(lián)合疫苗中的病毒載體疫苗會(huì)產(chǎn)生針對(duì)載體的抗體，而載體抗體會(huì)影響疫苗再次使用。因此，研究出免疫保護(hù)效果好、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)、能廣泛使用和再次使用的疫苗是廣譜流感大流行疫苗研究迫切需要解決的問題。多抗原疫苗和聯(lián)合疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通常能顯示出更為有效的交叉免疫保護(hù)[21_28]，提示如果聯(lián)合使用NP與M2e兩種抗原作疫苗，同時(shí)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)這兩種抗原的有效免疫反應(yīng)，將可能獲得更為有效的免疫保護(hù)效果；原核表達(dá)系統(tǒng)具有基因工程操作簡(jiǎn)單、表達(dá)效率高、發(fā)酵工藝成熟、產(chǎn)量大、成本低等特點(diǎn)，如果這兩種抗原能在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)，則可以克服當(dāng)前廣譜流感疫苗研制路線中生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、成本高等缺陷[31’32]；另外，如果原核系統(tǒng)表達(dá)的NP與M2e抗原能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效免疫保護(hù)，則使用原核表達(dá)的NP與M2e抗原制備的廣譜流感大流行蛋白亞單位疫苗將會(huì)明顯簡(jiǎn)化免疫程序，并易于廣泛使用和再次使用。這些問題的解決將會(huì)極大促進(jìn)廣譜流感大流行疫苗的研發(fā)，對(duì)流感大流行的防空具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上分析，本發(fā)明目的是以甲型流感病毒抗原中具有廣譜交叉保護(hù)作用的保守抗原NP和M2e為疫苗靶抗原，將NP和M2e基因融合，按照大腸桿菌偏愛的密碼子對(duì)該融合基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以期在大腸桿菌中高效表達(dá)NP和M2e融合蛋白，使用純化的NP和M2e融合蛋白制備亞單位疫苗，期望大腸桿菌表達(dá)的NP和M2e融合蛋白制備的亞單位疫苗能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效免疫保護(hù)。如果這一目標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)，則能根本解決目前廣譜流感疫苗研制中存在的免疫效果差、生產(chǎn)成本高、免疫程序復(fù)雜、難于廣泛使用等問題。
實(shí)施原則本發(fā)明通過下列方法和原則實(shí)現(xiàn)①選擇甲型流感病毒抗原中具有廣譜交叉保護(hù)的NP和M2e為靶抗原，構(gòu)建NP和M2e融合基因；②按照大腸桿菌偏愛的密碼子序列，對(duì)NP和M2e融合基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化；③人工合成密碼子優(yōu)化的NP和M2e的融合基因?qū)⑷斯ず铣傻拿艽a子優(yōu)化的NP和M2e的融合基因插入原核表達(dá)載體進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)；⑤通過蛋白層析技術(shù)對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，使用純化的NP和M2e融合蛋白制備亞單位疫苗將蛋白亞單位疫苗免疫小鼠，通過異型流感病毒的攻擊確定NP和M2e融合蛋白亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明選擇甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)中具有廣譜交叉保護(hù)作用的NP和M2e為靶抗原，將野生型病毒NP和M2e基因融合，命名為匪2e融合基因，匪2e融合基因序列全長(zhǎng)1566脫氧核糖核苷酸，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)完整核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495 個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸；按照大腸桿菌偏愛的密碼子序列，對(duì)融合基因NM2e密碼子進(jìn)行優(yōu)化，密碼子優(yōu)化后的融合基因命名為匪2es，其編碼的氨基酸序列與優(yōu)化前的NM2e融合基因編碼的完全一致，G+C百分含量由優(yōu)化前的45. 8%提高至52.8%，密碼子適合指數(shù)CAI值由優(yōu)化前的O. 675提高至O. 968 ;人工合成密碼子優(yōu)化的匪2es融合基因，并將匪2es基因片段插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，在大腸桿菌中高效表達(dá)了 NM2e融合蛋白；通過離子交換和凝膠過濾層析技術(shù)，獲得純度約為90 %的NM2e融合蛋白；使用大腸桿菌表達(dá)的NM2e融合蛋白作為亞單位疫苗免疫小鼠，利用異型甲型流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行攻毒，對(duì)照組小鼠全部死亡，匪2e亞單位疫苗IOug免疫組58%小鼠存活，說明大腸桿菌表達(dá)的NM2e具有較好的免疫保護(hù)效果，具有重要的廣譜流感大流行疫苗開發(fā)前景。
主要優(yōu)點(diǎn)由于按照大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)密碼子對(duì)目的基因進(jìn)行了優(yōu)化，匪2e可以在大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)。由于疫苗中含有NP和M2e成分，匪2e融合蛋白亞單位疫苗免疫小鼠后可以同時(shí)誘發(fā)體液(M2e，ADCC)和細(xì)胞免疫反應(yīng)(NP，CTL)，能夠更有效地保護(hù)小鼠抵抗異型流感病毒的攻擊。由于NM2e融合蛋白亞單位疫苗使用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，疫苗生產(chǎn)工藝成熟、成本低、適合大規(guī)模生產(chǎn)。使用本項(xiàng)發(fā)明制備的廣譜甲型流感疫苗將會(huì)明顯簡(jiǎn)化疫苗免疫程序，易于廣泛使用和再次使用。


圖I :匪2e融合基因核苷酸序列和對(duì)應(yīng)氨基酸序列，本圖為甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)的NP和M2e融合的匪2e基因的核苷酸和氨基酸序列。匪2e融合基因序列全長(zhǎng)1566脫氧核糖核苷酸，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)完整核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸。陰影部分為M2e基因及其對(duì)應(yīng)氨基酸序列，陰影加斜體文字部分為翻譯起始密碼子ATG及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和終止密碼子TAA。
圖2 :匪2es融合基因核苷酸序列和對(duì)應(yīng)氨基酸序列，本圖為匪2e融合基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后的匪2es基因的核苷酸和氨基酸序列。匪2es基因序列是依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子序列對(duì)融合基因謹(jǐn)密碼子進(jìn)行優(yōu)化所得，G+C百分含量由優(yōu)化前的45. 8%提高至52. 8%，密碼子適合指數(shù)CAI值由優(yōu)化前的O. 675提高至O. 968，其編碼的氨基酸序列與優(yōu)化前的NM2e融合基因編碼的完全一致。匪2es融合基因序列全長(zhǎng)1566脫氧核糖核苷酸，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)完整核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸。陰影部分為密碼子化的M2e基因及其對(duì)應(yīng)氨基酸序列，陰影加斜體部分為翻譯起始密碼子ATG及其對(duì)應(yīng)氨基酸序列和終止密碼子TAA。
圖3 :重組質(zhì)粒pET30a_NM2e與pET30a-NM2es的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)圖，本圖為重組質(zhì)粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)示意圖。圖中pET_30a(+)是商品化的原核表達(dá)載體。
質(zhì)粒pET30a-NM2e 的構(gòu)建
經(jīng)PCR擴(kuò)增的匪2e基因片段(在PCR反應(yīng)中通過設(shè)計(jì)引物對(duì)M2e序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，pET30a-NM2e與pET30a-NM2es中M2e基因序列相同)經(jīng)過酶切、連接插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET30a_NM2e。
質(zhì)粒pET30a_NM2es 的構(gòu)建
人工合成完整匪2es基因片段后經(jīng)過酶切、連接插入到表達(dá)質(zhì)粒pET_30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET30a-NM2es。
質(zhì)粒pET30a_NM2e的結(jié)構(gòu)說明
該質(zhì)粒為原核表達(dá)質(zhì)粒pET_30a(+)經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后，與相同酶切處理的匪2ePCR擴(kuò)增片段連接而成，匪2e片段置于T7啟動(dòng)子下游，質(zhì)粒序列長(zhǎng)度為6，838bp。由于載體經(jīng)過了限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI的酶切作用，去除了載體所帶有的6XHis標(biāo)簽，因而外源基因NM2e為非融合性表達(dá)基因，它在表達(dá)時(shí)利用基因本身所帶有的起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，表達(dá)產(chǎn)物不含載體成分。
質(zhì)粒pET30a_NM2es的結(jié)構(gòu)說明
該質(zhì)粒為原核表達(dá)質(zhì)粒pET_30a(+)經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后，與相同酶切處理的人工合成的匪2es基因片段連接而成，匪2es片段置于T7啟動(dòng)子下游，質(zhì)粒序列長(zhǎng)度為6，838bp。同pET30a-NM2e的結(jié)構(gòu)相同，由于載體經(jīng)過限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI的酶切作用，去除了所帶的6XHis標(biāo)簽，外源基因匪2es為非融合性表達(dá)基因，它在表達(dá)時(shí)利用基因本身所帶有的起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，表達(dá)產(chǎn)物不含載體成分。
圖4 :重組質(zhì)粒pET30a_NM2e與pET30a-NM2es的酶切鑒定，本圖為對(duì)重組質(zhì)粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es進(jìn)行酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，利用NdeI和EcoRI對(duì)質(zhì)粒pET-30a(+)、pET30a-NM2e和pET30a_NM2es進(jìn)行了雙酶切鑒定。1、2和3道分別為質(zhì)粒pET-30a(+)、pET30a-NM2e和pET30a-NM2es的雙酶切鑒定結(jié)果，經(jīng)過雙酶切作用后pET30a-NM2e產(chǎn)生長(zhǎng)度為I. 6kb和5. 4kb兩個(gè)片段，分別對(duì)應(yīng)于外源基因片段NM2e和載體pET-30a(+) ；pET30a-NM2es經(jīng)過雙酶切作用后也產(chǎn)生了長(zhǎng)度為I. 6kb和5. 4kb兩個(gè)片段，對(duì)應(yīng)于外源基因片段NM2es和載體pET-SOaG^Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ-EcoTH I digest,分子量從大到小依次為 19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421 和 74bp。M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，其分子量從大到小依次為2000、1000、750、500、250和lOObp。
圖5 :重組蛋白匪2e在大腸桿菌BL21 (DE3)中的表達(dá)和溶解性質(zhì)的SDS-PAGE分析，本圖為重組蛋白匪2e在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)和溶解性質(zhì)的SDS-PAGE分析。將質(zhì)粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，在細(xì)菌培養(yǎng)至0D600 = O. 8時(shí)加入O. ImM IPTG，在25°C進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。圖中I道、
2道分別為 BL21 (DE3)-pET30a-NM2e、BL21 (DE3)-pET30a-NM2es 誘導(dǎo)前的全菌樣品，3 道、4道、5道分別為BL21(DE3)-pET30a-NM2e以O(shè). ImM IPTG 25°C誘導(dǎo)4h后的全菌、上清和沉淀樣品，6 道、7 道、8 道分別為 BL21 (DE3)-pET30a-NM2es 以 O. ImM IPTG 25°C誘導(dǎo) 4h 后的全菌、上清和沉淀樣品，9道為BL21 (DE3)-pET30a-NM2e未加誘導(dǎo)劑IPTG的全菌樣品。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為97. 4,66. 2,43. 0,31. O和20. IkDa0 NM2e以可溶性表達(dá)為主，匪2e基因表達(dá)的匪2e蛋白約占所有上清成分的10%，匪2es基因表達(dá)的匪2e蛋白占所有上清成分的20-30%，約為前者的2-3倍。
圖6 陰離子交換和凝膠過濾純化匪2e效果的SDS-PAGE凝膠電泳分析，本圖為利 用陰離子交換層析(DEAE-Fast Flow sepharose)和凝膠過濾層析(Superdex 200)純化NM2e的SDS-PAGE凝膠電泳分析。將pET30a_NM2es轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后在25°C以
O.ImMIPTG誘導(dǎo)10h，超聲破碎菌體離心后收獲上清樣品，利用陰離子交換和凝膠過濾進(jìn)行NM2e 的兩步純化。圖中 I 道為 BL21(DE3)-pET30a-NM2es在 25°C 以 0. ImM IPTG誘導(dǎo) 10h，超聲破碎菌體離心后收獲上清樣品，2道為經(jīng)過離子交換純化獲得的NM2e再經(jīng)分子篩純化所獲得的樣品，3道為離子交換純化獲得的NM2e樣品。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從大到小依次為97. 4,66. 2,43. 0,31. O和20. IkDa0經(jīng)過離子交換獲得的樣品中NM2e純度可達(dá)到70-80%,再經(jīng)凝膠過濾所獲得樣品中匪2e純度可達(dá)到90%。
圖7 :Western_blot鑒定NM2e結(jié)果，本圖為通過western-blot鑒定NM2e的結(jié)果。A圖為SDS-PAGE凝膠電泳圖，B圖和C圖為western-blot結(jié)果。B圖所用抗體為甲型流感病毒NP蛋白免疫小鼠血清,為本科室制備。C圖所用抗體為針對(duì)甲型流感病毒M2蛋白的小鼠單抗14C2，主要針對(duì)M2e，購自英國(guó)abeam公司。圖中I道為經(jīng)陰離子交換(DEAE-FastFlowsepharose)和凝膠過濾(Superdex 200)純化后所獲得的NM2e樣品，2道為將質(zhì)粒pET-30a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)收獲的全菌，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。A圖中M的分子量從大到小依次為97. 4,66. 2,43. 0,31. 0,20. IkDa ；B圖和C圖的M相同，分子量從大到小依次為175、83、62、47.5、32.5和25.01^^。經(jīng)陰離子交換(DEAE-Fast Flowsepharose)和凝膠過濾(Superdex 200)兩步純化的NM2e可以與甲型流感病毒NP蛋白免疫小鼠血清特異反應(yīng)，說明其中含有NP成分，同時(shí)它也可以與M2e特異的單抗反應(yīng)，說明其中含有M2e的成分，結(jié)果表明所純化的目的蛋白為NP和M2e的融合蛋白。
圖8 =ELISA檢測(cè)小鼠血清抗NP特異性IgG抗體，為利用ELISA檢測(cè)10 μ g NM2e誘發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生NP特異性IgG的結(jié)果。固代表NS組，曰代表匪2e組。以10 μ g匪2e經(jīng)肌注免疫BALB/C小鼠，間隔2周免疫I次，共免疫3次。每次免疫后10天眼眶取血測(cè)定血清抗NP IgG。利用純化的NP包被酶標(biāo)板(200ng/100 μ I/孔)，在第一次免疫后10天(相當(dāng)于免疫程序第2周)小鼠抗NP IgG滴度即可達(dá)到9. 6X 103，第二次和第三次檢測(cè)時(shí)其滴度均為8. 6 X IO5,而對(duì)照組僅保持在較低的水平，說明NM2e免疫小鼠后誘發(fā)了 NP特異性IgG，具有較強(qiáng)的免疫原性。[0023]圖9 =ELISA檢測(cè)NM2e免疫小鼠抗M2e特異性IgG抗體，為利用ELISA檢測(cè)IOygNM2e誘發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生M2e特異性IgG的結(jié)果。Ξ代表NS組，H代表NM2e組。以M2e全長(zhǎng)多肽包被酶標(biāo)板(200ng/100y I/孔)，對(duì)上述獲取血清進(jìn)行檢測(cè)，三次檢測(cè)結(jié)果分別為28，106和176，對(duì)照組未檢測(cè)到明顯的抗體，說明匪2e免疫小鼠后誘發(fā)產(chǎn)生了針對(duì)M2e的IgG，融合蛋白匪2e較好地保持了 M2e的免疫原性。
圖10 甲型流感病毒PR8攻擊匪2e免疫小鼠的存活率，為以10LD50甲型流感病毒PR8攻擊10 μ g NM2e免疫BALB/c小鼠后的存活率。以10 μ g NM2e三針免疫BALB/c小鼠，每次間隔2周，第三針免疫后10天，以10LD50甲型流感病毒PR8攻擊小鼠，對(duì)照NS免疫組全部死亡，而匪2e免疫組存活率為58%，說明匪2e具有有效的免疫保護(hù)作用。 具體實(shí)施方式
下面結(jié)合圖表對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
一、以編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2) NP蛋白和M2e多肽的基因序列為原始序列，設(shè)計(jì)和合成病毒自身密碼子編碼的NP蛋白和M2e多肽的融合基因匪2e
將甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)自身密碼子編碼的核殼蛋白NP的全基因1494個(gè)核苷酸序列的“3' ”端與M2e多肽的69個(gè)核苷酸序列的“5' ”連接，在M2e基因末端加上終止密碼子TAA，獲得融合基因匪2e，該基因序列全長(zhǎng)為1566bp，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸。匪2e融合基因及其編碼的氨基 酸序列見附圖I。二、按大腸桿菌偏愛的密碼子對(duì)匪2e融合基因的病毒自身密碼子進(jìn)行優(yōu)化并人工合成優(yōu)化后的融合基因NM2es。
根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性對(duì)匪2e融合基因的病毒自身密碼子進(jìn)行優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)或提高匪2e蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)的重要技術(shù)手段。我們依據(jù)CUTG數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌總體密碼子使用頻率的資料，參考?jí)A基變化對(duì)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，在保證NM2e蛋白質(zhì)序列不發(fā)生變化的前提下，調(diào)整了 G+C含量和分布，避開常用的酶切位點(diǎn)，對(duì)匪2e基因進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)，得到一條可能在大腸桿菌中高效表達(dá)匪2e融合蛋白的基因序列，命名為匪2e_synthesized,簡(jiǎn)稱為匪2es,并人工合成了這段基因。匪2es基因序列全長(zhǎng)為1566bp，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95 (H3N2)基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸，匪2es融合基因及其編碼的氨基酸序列見附圖2。匪2es基因與改造前的NM2e基因核苷酸數(shù)量相同，所編碼的氨基酸序列相同，但核苷酸的成分比例發(fā)生明顯變化，G+C含量由改造前的45. 8%提高至52. 8%，密碼子適合指數(shù)CAI值由O. 675升至O. 968。匪2e與匪2es融合基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見表I。該表是利用DAMBE軟件同時(shí)對(duì)匪2es與匪2e融合基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行的比對(duì)，上排為核苷酸序列，下排為氨基酸序列，表示核苷酸序列不同。陰影部分為編碼M2e的基因及氨基酸序列，陰影斜體文字部分分別為起始密碼子ATG及其翻譯的蛋氨酸(M)和終止密碼子TAA。
表I.匪2e與匪2es融合基因的核苷酸和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的人工合成的編碼甲型流感病毒核殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)M2e多肽的融合基因匪2es，其特征是匪2es基因序列全長(zhǎng)1566脫氧核糖核苷酸，編碼521個(gè)氨基酸，第I個(gè)至第1494個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95完整核殼蛋白NP的498個(gè)氨基酸，第1495個(gè)至1563個(gè)脫氧核糖核苷酸編碼甲型流感病毒A/京科/30/95基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)多肽M2e的23個(gè)氨基酸，密碼子按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化，G+C堿基含量由優(yōu)化前的45. 8%提高至52. 8%，密碼子適合指數(shù)CAI值由優(yōu)化前的0. 675提高至0. 968，其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。
2.權(quán)利要求
I所述的融合基因匪2es在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白所制備的基因工程廣譜甲型流感病毒疫苗和甲型流感病毒診斷試劑。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種編碼甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因，所屬技術(shù)領(lǐng)域：
為生物技術(shù)以及基因工程疫苗。本發(fā)明提供一種根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的人工合成的編碼甲型流感病毒核殼蛋白NP和基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)M2e多肽的融合基因NM2es，該基因可以在大腸桿菌中高效表達(dá)甲型流感病毒NP和M2e融合蛋白NM2e，使用純化的NM2e蛋白制備的蛋白亞單位疫苗免疫BALB/c小鼠，可以有效地保護(hù)小鼠抵御異型流感病毒的攻擊，NM2es基因可以用于廣譜甲型流感病毒基因工程疫苗和甲型流感病毒診斷試劑的研發(fā)。
文檔編號(hào)C12N15/70GKCN101899461 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010171774
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年5月14日
發(fā)明者王文玲, 王秀平, 阮力, 黃保英 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),