專利名稱:一種以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲醇酵母表達(dá)抗血栓藥物重組巴曲酶的發(fā)酵工藝。背景技術(shù)：
隨著血栓栓塞性疾病患者的增加，抗血栓藥物的研制已成為熱點(diǎn)之一。人們一方面采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有藥物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，以期獲得更為優(yōu)良的溶栓藥物。另一方面，積極的尋找一些安全性好、療效好、副作用小的天然來源的溶栓藥物。
在E.coli中表達(dá)某些蛋白已經(jīng)是較為常規(guī)的生產(chǎn)藥用蛋白的基本手段，但是在對(duì)蛇毒類凝血酶實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在E. coli中表達(dá)蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用 RT-PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒類凝血酶基因I^allas，以表達(dá)載 #pET-24a(+)構(gòu)建T-7啟動(dòng)子控制下的表達(dá)質(zhì)粒pET-Pallas，轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3), 并用0. 4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的 I^llas表達(dá)(潘華等，蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達(dá)研究，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)， 1999，31，79)。Fan等采用PCR法擴(kuò)增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒類凝血酶基因 Acutin，克隆到表達(dá)載體pET-Ma，在E. coli BL21DE(3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(dá)(Fan C. Y.等，Biochemistry and Molecular Biology International, 1999，47，217)。但它們的表達(dá)效率普遍較低，沒有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。
采用基因工程的手段生產(chǎn)富含多對(duì)二硫鍵的蛋白一直是一個(gè)技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有六對(duì)二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因?yàn)槎蜴I配對(duì)錯(cuò)誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然對(duì)包涵體的變性復(fù)性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實(shí)際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率。另外，蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核細(xì)胞不能對(duì)所表達(dá)的外原蛋白進(jìn)行糖基化，而糖基對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和酶活性都起穩(wěn)定作用。因此空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。而真核表達(dá)系統(tǒng)除能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率外，還能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的糖基化，雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保證了表達(dá)產(chǎn)物的活性。
蛇毒類凝血酶現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床并取得明顯的臨床效果，但仍有很多問題未解決一是蛇毒類凝血酶制劑作為一種生物制品，存在抗原性，偶有過敏反應(yīng)出現(xiàn)，且多次應(yīng)用后易產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而降低制劑的療效；二是蛇毒的來源有限，不利于大規(guī)模生產(chǎn)， 同時(shí)價(jià)格較高，不利于其廣泛應(yīng)用；三是類凝血酶是從蛇毒中純化得到的，純度難以控制， 從而增加了毒副作用。解決這些問題的辦法是借助基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行表達(dá)，但這些必須在對(duì)蛇毒類凝血酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)作更深入的研究后方可進(jìn)行。
成熟的巴曲酶分子是由231個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，理論計(jì)算出其分子量為25. 5KD，等電點(diǎn)為7.39，國外從Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其實(shí)際分子量為42KD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，其分子內(nèi)有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)=Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr^此外，Bothrops atrox的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29. IKD到42KD不等，這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個(gè)半胱氨酸，根據(jù)已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結(jié)果，推測這12個(gè)半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42, Cys74-Cys230, CyS118-Cys184、CyS15°-CyS163、CySm-CyS199六個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的形成(Itoh n. et al. The J. of BiologicalChemistry,262，3132，1987)。
考慮到進(jìn)口蛇毒原料成本較高，同時(shí)，巴西矛頭蝮蛇是稀有的保護(hù)蛇種，蛇毒產(chǎn)量有限。因此，我們采用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組巴曲酶，我們首先構(gòu)建了表達(dá)天然巴曲酶的基因工程菌種，但發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵表達(dá)時(shí)，目的蛋白有嚴(yán)重的降解現(xiàn)象，這就極大地影響了巴曲酶的產(chǎn)量。
因此，我們對(duì)巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變，避免其對(duì)發(fā)酵液中所表達(dá)的巴曲酶的降解，同時(shí)還不影響巴曲酶的凝血活性，這將極大地提高巴曲酶的產(chǎn)量，更好地滿足研究和臨床應(yīng)用的需要。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是由于分子內(nèi)二硫鍵多，還有糖基化修飾等，所以采用基因工程手段生產(chǎn)這種蛋白有很大的技術(shù)難度。這也是一直沒有重組產(chǎn)品問世的主要原因之一。
雖然研究者對(duì)天然巴曲酶的性質(zhì)有比較多的了解，但是，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究一直進(jìn)展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對(duì)巴曲酶基因的CDNA和基因組 DNA 測序工作(Nobuyuki Itoh etal J. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 J. Biol. Chem. ,263 :7628-7631,1988) MaedaM等采用基因重組方法，在Ε. coli中，采用融合表達(dá)系統(tǒng)，以包涵體(InclusionBody)的形式表達(dá)出該成份，據(jù)報(bào)道得到了所謂有生物學(xué)活性巴曲酶(MaedaM. etal, J Biochem(Tokyo)，109(4) :632-637,1991)，而且還為此申請(qǐng)了專利 (Pat, No. :JP2124092，1990)。但沒有后續(xù)報(bào)道。
采用基因工程的手段生產(chǎn)富含多對(duì)二硫鍵的蛋白一直是一個(gè)技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有六對(duì)二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因?yàn)槎蜴I配對(duì)錯(cuò)誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然對(duì)包涵體的變性復(fù)性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實(shí)際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率。另外，蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核細(xì)胞不能對(duì)所表達(dá)的外原蛋白進(jìn)行糖基化，而糖基對(duì)蛋白的空間結(jié)構(gòu)和酶活性都起穩(wěn)定作用。因此空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。而真核表達(dá)系統(tǒng)除能保證較高的二硫鍵配對(duì)正確率外，還能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的糖基化，雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保證了表達(dá)產(chǎn)物的活性。
Weon-Kyoo You等報(bào)道了用甲醇酵母表達(dá)Batroxobin，獲得了每升發(fā)酵液產(chǎn) 13. 16mg 有活性的 Batroxobin (Weon-Kyoo You 等，F(xiàn)EBS Letters，2004，571，67)。
上海萬興生物制藥有限公司申請(qǐng)了基因工程表達(dá)Batroxobin的專利(公開號(hào)CN1534093A，2004)，在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達(dá)，但在大腸桿菌中表達(dá)的 Batroxobin均為無活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)每毫升發(fā)酵液20克氏單位(20KU/ml)，這一產(chǎn)量已初步具備生產(chǎn)意義。上述研究結(jié)果表明利用基因工程方法生產(chǎn)蛇毒類凝血酶是可行的，但要用真核表達(dá)系統(tǒng)。[0014]本公司也申請(qǐng)了相關(guān)專利，申請(qǐng)?zhí)?00710011566.4(—種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶及用途)，產(chǎn)量達(dá)每毫升發(fā)酵液90克氏單位。可完全用于抗血栓藥物的生產(chǎn)開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是對(duì)定點(diǎn)突變巴曲酶的高密度連續(xù)發(fā)酵工藝的研究，其目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶的發(fā)酵方法，研究結(jié)果表明，該方法可大幅提高發(fā)酵效率，使目的產(chǎn)物的表達(dá)量得到顯著提高。
本發(fā)明具體提供了一種以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵及甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段，所述酵母菌是相對(duì)于天然的巴曲酶的第45 位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬闹亟M定點(diǎn)突變巴曲酶，具體為
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201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P
本發(fā)明提供的一種以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，其特征在于，酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵的碳源為甘油，PH = 5. 0-5. 5 ；甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段的pH = 6. 8-7. 0，溫度為25°C，甲醇濃度為0. 5%。進(jìn)行甘油和甲醇混合補(bǔ)料誘導(dǎo)和表達(dá)時(shí)，其誘導(dǎo)時(shí)菌體OD高于300，誘導(dǎo)階段維持3小時(shí)士0. 5小時(shí)，菌體高密度表達(dá)，最高達(dá)到0D600。當(dāng)菌體活性不再增長時(shí)，進(jìn)行放料補(bǔ)料，開始連續(xù)培養(yǎng)；其中補(bǔ)料為鹽培養(yǎng)基。放料補(bǔ)料后，OD 值應(yīng)保持在300-350之間。
本發(fā)明所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶能夠通過以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)獲得，同時(shí)具有較高的生物活性。它可以通過將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得，優(yōu)選通過甲醇酵母菌以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。
本發(fā)明所述重組定點(diǎn)突變巴曲酶，在甲醇酵母菌中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)時(shí)，可以依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，再將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因重組到甲醇酵母菌表達(dá)載體 pPICZa中。并轉(zhuǎn)化到KM7IH酵母菌種。
通過優(yōu)化發(fā)酵條件，確定了酵母菌最優(yōu)發(fā)酵表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了高活性的重組定點(diǎn)突變巴曲酶。結(jié)果表明，定點(diǎn)突變基因工程巴曲酶較從蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產(chǎn)率達(dá)到每毫升發(fā)酵液高于90KU。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
挑YPD平板培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)的單菌落于搖瓶中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接到 1. 5升繼續(xù)培養(yǎng)過夜，直接接種到30升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基15升為鹽培養(yǎng)基，溶氧保存30 %， 轉(zhuǎn)數(shù)700-800rpm。碳源耗盡后進(jìn)行甘油流加補(bǔ)料。[0029]在OD值達(dá)到300-350時(shí)，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，在2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)甲醇加到0. 2%。 當(dāng)甲醇開始利用時(shí)，甲醇濃度逐漸提高到0. 5% 1%，并逐漸降低培養(yǎng)溫度到25°C，pH調(diào)至6. 8 7. 0，發(fā)酵過程中要維持罐壓在0. 04-0. 06MPa之間，空氣流量在0. 2-0. 25VVM之間，轉(zhuǎn)速維持在700 800rpm之間。
當(dāng)OD接近600，活性達(dá)90U時(shí)，進(jìn)行放料、補(bǔ)料，放料補(bǔ)料后，OD值應(yīng)在300-350左
右。培養(yǎng)基裝量為15L左右，然后進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。通過連續(xù)培養(yǎng)，每批產(chǎn)量都可大幅提高， 放料補(bǔ)料次數(shù)越多，產(chǎn)量越高。按照放料補(bǔ)料一次，可提高70%左右，達(dá)到4. OX 106KU。
采用同類產(chǎn)品活性的測定方法進(jìn)行體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為取人一枸櫞酸抗凝血漿0. anl，加入直徑Icm的試管中，置37°C水浴中保溫3分鐘，加入37°C預(yù)熱的樣品溶液0. anl，立即混勻計(jì)時(shí)，于40秒開始，檢查血漿凝固情況，記錄初凝時(shí)間，同時(shí)測定3 管，3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄 60士20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0. 2ml人-枸櫞酸抗凝血漿在60 秒凝固的酶量，定義為一個(gè)KU。
實(shí)施例2
挑YPD平板培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)的單菌落于搖瓶中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)18小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接到
1.5升繼續(xù)培養(yǎng)過夜，直接接種到30升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基15升為鹽培養(yǎng)基，溶氧保存30 %， 轉(zhuǎn)數(shù)700-800rpm。碳源耗盡后進(jìn)行甘油流加補(bǔ)料。
按invitrogin的發(fā)酵方法進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵。其它誘導(dǎo)200小時(shí)以上。當(dāng)發(fā)酵液中蛋白活性不再增加時(shí)，將發(fā)酵液離心收集上清，蛋白活性達(dá)到90KU/ml，產(chǎn)量達(dá)到
2.34X 106KU。經(jīng)微濾除菌，采用疏水柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術(shù)，得到純度達(dá)97%以上的活性蛋白。
實(shí)施例3
種子液在1. 5L酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵M小時(shí)后，轉(zhuǎn)到30L發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。13. 5L 鹽培養(yǎng)基，組成如下=H3PO4, 27ml/L ；CaSO4 · 2H20,0. 9g/L ；K2SO4,18g/ L ；MgSO4 · 7H20,15g/L ；Κ0Η，4· 13g/L ；甘油 40g/L ；4. 4ml/L 微量礦物質(zhì)溶液。
在發(fā)酵過程中，用NH4OH調(diào)pH值，使其維持在5. 0。30°C通氧劇烈攪拌(IOOOrpm) 發(fā)酵，添加消泡劑。發(fā)酵M小時(shí)后，加入含12ml/L微量礦物質(zhì)的50%甘油，溶氧濃度為 30%，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。當(dāng)碳原饑餓30分鐘后，加入甲醇誘導(dǎo)。剛開始的5小時(shí)加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母適應(yīng)甲醇，100%甲醇含12ml/L微量礦物質(zhì)溶液，其溶氧量在30%以上。繼續(xù)發(fā)酵活性不再增加，凝血活性達(dá)到43KU/ml，產(chǎn)量達(dá)到1. 12X 106KU。
權(quán)利要求
1.一種以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵及甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段，所述酵母菌是相對(duì)于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬闹亟M定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵的碳源為甘油，PH =5. 0-5. 5 ；甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段的pH = 6. 8-7. 0，溫度為25°C，甲醇濃度為0. 5%。
2.按照權(quán)利要求
1所述以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，其特征在于，進(jìn)行甘油和甲醇混合補(bǔ)料誘導(dǎo)和表達(dá)，其誘導(dǎo)時(shí)菌體OD高于300，誘導(dǎo)階段維持3小時(shí)士0. 5小時(shí)，菌體高密度表達(dá)，最高達(dá)到0D600。
3.按照權(quán)利要求
1所述以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，其特征在于，當(dāng)菌體活性不再增長時(shí)，進(jìn)行放料補(bǔ)料，開始連續(xù)培養(yǎng)；放料補(bǔ)料后，OD值應(yīng)保持在300-350之間。
4.按照權(quán)利要求
3所述以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，其特征在于，所述補(bǔ)料為鹽培養(yǎng)基。
專利摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種以重組甲醇酵母發(fā)酵制備巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵及甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段，所述酵母菌是相對(duì)于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬闹亟M定點(diǎn)突變巴曲酶，其特征在于，酵母菌的分批發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵的碳源為甘油，pH＝5.0-5.5；甲醇誘導(dǎo)表達(dá)巴曲酶階段的pH＝6.8-7.0，溫度為25℃，甲醇濃度為0.5％。研究結(jié)果表明，該方法可大幅提高發(fā)酵效率，使目的產(chǎn)物的表達(dá)量得到顯著提高。
文檔編號(hào)C12N9/60GKCN102242101SQ201010166684
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月10日
發(fā)明者姜大威, 孟威, 徐梅, 楊宇, 王宏英, 王建華, 薛百忠, 薛雁 申請(qǐng)人:遼寧諾康醫(yī)藥有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan