專(zhuān)利名稱(chēng)：T－20融合蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及T-20融合蛋白、其制備方法及用途。具體而言，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了T-20融合蛋白在甲醇酵母中的表達(dá)，并建立了蛋白質(zhì)純化的方法，使得大批量、低成本的生產(chǎn)成為可能，為T(mén)-20融合蛋白的臨床應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
HIV-1入侵宿主細(xì)胞有兩個(gè)重要步驟受體識(shí)別和膜融合。HIV-1首先識(shí)別宿主細(xì)胞表面的特異受體蛋白并與之相結(jié)合，然后病毒和宿主細(xì)胞表面發(fā)生了復(fù)雜構(gòu)象變化，導(dǎo)致HIV-1膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜相融合，使得HIV-1核心顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞的原生質(zhì)中。
與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒類(lèi)似，HIV-1的膜糖蛋白以多蛋白前體分子的形式在宿主細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成。編碼膜糖蛋白前體的env基因位于病毒基因組的后半?yún)^(qū)，表達(dá)產(chǎn)物為一段88kD的多肽鏈。這一多肽鏈在合成過(guò)程中進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔并被糖基化，使分子量達(dá)到160kD，因而被稱(chēng)為gp160。gp160以單一跨膜肽段錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并在合成后不久形成三聚體。
在高爾基復(fù)合體中，gp160三聚體的糖基被修飾成更為復(fù)雜的形態(tài)，并且每個(gè)gp160分子均被宿主細(xì)胞的蛋白水解酶切斷。形成分子量分別為120kD和41kD的兩個(gè)成熟蛋白質(zhì)，分別稱(chēng)為gp120和gp41，gp120包圍在gp41三聚體表面，以非共價(jià)鍵相互結(jié)合形成gp120/gp41復(fù)合體。另外，gp120與gp41之間還可能形成二硫鍵，使復(fù)合結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固。
成熟的gp120/gp41三聚體通過(guò)高爾基復(fù)合體分泌的大囊泡到達(dá)宿主細(xì)胞質(zhì)膜，參與對(duì)HIV-1病毒顆粒的包裹。
HIV-1入侵的第一步是gp120與細(xì)胞表面的CD4受體分子相結(jié)合。gp120與CD4的結(jié)合區(qū)域主要是C4區(qū)，C3區(qū)和C5區(qū)也參予了與CD4的結(jié)合。Smith等(Smith D H，Byrn R A，Marsters S A，et al.Science，1987；2381704)還發(fā)現(xiàn)可溶性CD4(sCD4)也能與gp120結(jié)合，使gp120從病毒膜上脫落下來(lái)，從而中和HIV-1的感染。但由于中和反應(yīng)在大多數(shù)HIV-1株系中不能發(fā)生，因而sCD4不能作為一種治療藥物。
HIV-1的細(xì)胞入侵還需要共受體的參與。很早就發(fā)現(xiàn)，HIV-1不能入侵整合了人CD4的小鼠細(xì)胞。但將人的CD4-細(xì)胞與小鼠CD4+細(xì)胞融合以后，HIV-1則能進(jìn)入雜交細(xì)胞。另外，特定的HIV-1株只能感染某幾類(lèi)人CD4+細(xì)胞，但不能感染其他類(lèi)型的人CD4+細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明HIV-1的入侵還需要人類(lèi)細(xì)胞表面的其他具有組織特異性的輔助因子。共受體與gp120的相互作用非常復(fù)雜。一般認(rèn)為，gp120在與CD4結(jié)合以后，經(jīng)過(guò)構(gòu)象變化而形成了共受體的結(jié)合位點(diǎn)。Atchison等(Atchison R E，Gosling J，Monteclaro F S，et al.Science，1996；2741924)的分析表明，HIV-1入侵需要gp120與共受體形成一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而決不僅僅是簡(jiǎn)單的位點(diǎn)結(jié)合。這種結(jié)構(gòu)一旦形成，就使gp120與gp41脫離，從而啟動(dòng)了HIV-1入侵宿主細(xì)胞的下一過(guò)程膜融合。
HIV-1不僅能使其膜宿主細(xì)胞膜融合，而且能介導(dǎo)被感染細(xì)胞與周?chē)腃D4+細(xì)胞發(fā)生融合，形成合胞體。直接參與病毒-細(xì)胞融合或合胞體形成的是gp41的膜外側(cè)區(qū)域。該區(qū)域從N端起依次為融膜肽(fusion peptide)、螺旋段1(H1)、免疫環(huán)區(qū)(IM)、螺旋段2(H2)。1997年，在Cell和Nature雜志上分別發(fā)表了gp41膜外側(cè)主要區(qū)域(H1和H2)晶體結(jié)構(gòu)的X射線(xiàn)測(cè)定結(jié)果。在晶體結(jié)構(gòu)中，三段H1螺旋平行排列于中央形成核心，三段H2螺旋反平行地圍繞在周?chē)?，形成螺旋六元束。這證實(shí)gp41以三聚體存在。
T-20取自病毒的膜蛋白gp41膜外區(qū)域C末端序列，共有36個(gè)氨基酸，它是艾滋病病毒的膜融合抑制劑。臨床試驗(yàn)表明，單獨(dú)或復(fù)合用藥，對(duì)艾滋病都具有明顯的治療作用。491名來(lái)自北美和巴西的志愿者參加T-20的臨床試驗(yàn)，在此以前，平均每人已經(jīng)使用12種抗艾滋病藥物，他們平均的病毒載量是100,000/μl，T細(xì)胞計(jì)數(shù)為80/μl。實(shí)驗(yàn)中，每人使用3到5種藥物治療。一組只使用上市的藥物，一組使用上市藥加T-20。6個(gè)月后，使用T-20的受試者中37％的病毒載量降到檢測(cè)不到的水平(低于400/μl)，而對(duì)照組只有16％。使用T-20的受試者中20％的病毒載量降到低于50/μl，而對(duì)照組只有7％。T-20的受試者的T細(xì)胞平均增長(zhǎng)了76/μl，而對(duì)照組只增長(zhǎng)了32/μl。另有504名來(lái)自歐洲和澳大利亞的志愿者也參加了臨床實(shí)驗(yàn)，在此以前，所有的受試者都曾經(jīng)使用藥物治療，并且最后失敗，他們平均的T細(xì)胞數(shù)為98/μl。6個(gè)月后，使用加入T-20治療的受試者中28％的病毒降到檢測(cè)不到的水平(低于400/μl)，而對(duì)照組只有14％。T-20的受試者的T細(xì)胞數(shù)平均增長(zhǎng)了65/μl，而對(duì)照組只增長(zhǎng)了38/μl。
T-20抑制膜融合的機(jī)理還不是很清楚。根據(jù)gp41和流感病毒融合蛋白紅細(xì)胞凝集素具有相似性，有人于1993年提出了“發(fā)夾前體中間體理論”，即HIV在發(fā)生膜融合時(shí)，H1螺旋卷曲結(jié)構(gòu)從H2螺旋三員束中被拉出，而成為游離狀態(tài)，T-20趁機(jī)結(jié)合于H1，阻止了以后發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成和膜融合。但近期的研究發(fā)現(xiàn)，H1并不存在T-20的特異性結(jié)合位點(diǎn)，在H2區(qū)域也存在T-20結(jié)合區(qū)；同時(shí)，T-20還具有膜反應(yīng)性，C末端辛基修飾的T-20可以更好的完成膜定位，表現(xiàn)出更高的抑制效應(yīng)，因此T-20的抑制效應(yīng)可能還和膜反應(yīng)性有關(guān)。
Fc指包括抗體的非抗原結(jié)合部分序列的分子或序列，優(yōu)選人源，可以來(lái)自任何一種同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。Fc與T-20的融合蛋白相比T-20具有更高的穩(wěn)定性，而且在體內(nèi)的半衰期更長(zhǎng)。
而甲醇酵母表達(dá)體系是近幾年發(fā)展起來(lái)的高效表達(dá)系統(tǒng)，相比于大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系而言，甲醇酵母表達(dá)體系具有很好的表達(dá)可控制、可分泌表達(dá)、蛋白易于純化、表達(dá)量高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。
我們將T-20和Fc基因同時(shí)克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化甲醇酵母，篩選到了高表達(dá)菌株，然后摸索了發(fā)酵、純化工藝，實(shí)現(xiàn)了T-20融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供T-20與Fc的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用甲醇酵母表達(dá)T-20融合蛋白并分離純化制備T-20融合蛋白的生產(chǎn)方法。該方法包括(a)將編碼T-20與Fc的融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于大腸桿菌、甲醇酵母、CHO或昆蟲(chóng)表達(dá)載體，得到T-20融合蛋白重組表達(dá)載體；(b)將步驟(a)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌，篩選獲得表達(dá)T-20融合蛋白的工程菌；(c)在適合所述融合蛋白表達(dá)的條件下發(fā)酵培養(yǎng)步驟(b)中的工程菌；(d)從步驟(c)的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中純化分離出所述融合蛋白。
該方法還包括，在所述步驟(a)之前，以化學(xué)合成獲得的T-20基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，并以RT-PCR方法獲得Fc基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供獲得的T-20融合蛋白的藥物制劑。
本發(fā)明還提供了上述藥物制劑用于預(yù)防和治療艾滋病的用途。
本發(fā)明中所述的T-20融合蛋白指T-20或其變體、片段與Fc或其變體、片段融合的蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述T-20融合蛋白為R1-L-R2形式。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明T-20融合蛋白為R1-R2形式。其中R1為Fc蛋白、其變體或片段，R2為T(mén)-20蛋白、其變體或片段，L為接頭。所述T-20蛋白、或其變體、片段選自以下(a)SEQ ID NO1所示的T-20序列；(b)氨基酸序列X-Y，其中X，Y為圖1所示的包括位置1-36的任何殘基，并且X＜Y，特別是1-36；所述Fc蛋白選自以下(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亞部分(A)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的編號(hào)采用SEQ ID NO2的編號(hào)i.一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；ii.一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的絲氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴(lài)氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴(lài)氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；x.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除補(bǔ)體Clq結(jié)合位點(diǎn)；xi.亞部分i-x的組合；所述接頭選自以下(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4間的整數(shù)；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4間的整數(shù)；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；
(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；以及(h)亞部分(a)-(g)的任何組合。
本發(fā)明還提供一種編碼T-20與Fc融合蛋白的核酸序列，眾所周知，一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，本發(fā)明分別提供一種編碼T-20蛋白的核酸序列(SEQ ID NO3)和編碼Fc蛋白的核酸序列(SEQ ID NO4)，但在某些實(shí)施方案中，可以根據(jù)實(shí)際需要對(duì)核酸密碼子進(jìn)行突變，特別是選用甲醇酵母偏愛(ài)密碼子，但編碼獲得的T-20融合蛋白的氨基酸序列不變。
本發(fā)明中所指的甲醇酵母包括巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)、pichiamathonolica等能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母。本發(fā)明中使用的表達(dá)載體可以選用各種已知的載體，如商業(yè)化的載體pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。將重組表達(dá)載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，利用合適的條件篩選重組子，可以誘導(dǎo)表達(dá)T-20融合蛋白。
本發(fā)明中，工程菌在合適的條件下發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟經(jīng)篩選的工程菌株活化后接入培養(yǎng)液(例如BMGY、YPD培養(yǎng)液)中制備種子液，培養(yǎng)過(guò)夜后接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)，發(fā)酵條件控制為pH4.0-8.0，優(yōu)選pH4.5-7.0，最佳為pH5.0，溫度28℃-37℃，最佳為30℃，溶氧控制在30％以上。培養(yǎng)4-24小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)料，加入甘油或葡萄糖等，當(dāng)菌體OD值達(dá)到高密度(OD600為15-200)，加入誘導(dǎo)劑(如甲醇)誘導(dǎo)表達(dá)，控制pH3.0-7.0，優(yōu)選pH3-4.0，最佳為pH3.0，誘導(dǎo)12-84小時(shí)結(jié)束。
本發(fā)明中，從發(fā)酵產(chǎn)物中純化分離出T-20融合蛋白包括以下要點(diǎn)收集發(fā)酵產(chǎn)物，T-20融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物存在于培養(yǎng)液或菌體中；如表達(dá)產(chǎn)物在菌體中，則需破菌；經(jīng)多步純化獲得產(chǎn)物(包括Protein A親和柱層析、離子柱層析、反向?qū)游?、透析、超濾或凝膠過(guò)濾等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC檢驗(yàn)，獲得純度大于95％的T-20融合蛋白。
已確證，T-20在臨床應(yīng)用上是安全有效的。因此，該融合蛋白是安全的并適宜于藥物使用。
采用本發(fā)明方法制得的T-20融合蛋白，顯示出體外抗融合活性。本發(fā)明制備T-20融合蛋白的方法簡(jiǎn)單，回收率高，并且不損傷蛋白活性，操作性強(qiáng)。
含有本發(fā)明方法所獲得的多肽和常規(guī)載體及助劑組成的藥物制劑，包含僅有用本發(fā)明方法所獲得的多肽的藥物制劑，或以本發(fā)明方法所獲得的多肽作為活性成分與傳統(tǒng)的輔劑和添加物一起組成的藥物制劑，包括注射針劑、口服制劑、含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物。
注射針劑含有本發(fā)明活性多肽，優(yōu)選以無(wú)菌凍干物儲(chǔ)存。在給藥前與合適的等滲溶液混合，等滲溶液包括傳統(tǒng)的適于注射或注入的等滲水系統(tǒng)，其中含有用于注射液的普通添加物如穩(wěn)定劑和促溶劑，優(yōu)選生理鹽水或通過(guò)緩沖液調(diào)成的等滲溶液。
口服制劑含有本發(fā)明活性多肽，包括按知方法制備的固體組合物、液體組合物及噴霧組合物。該組合物為含有本發(fā)明活性多肽與至少一種常用的惰性稀釋劑混合。該組合物在實(shí)際一般情況下，也可加入惰性稀釋劑之外的其他添加物如潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂)、懸浮劑、崩解劑(如甘醇酸纖維素鈣)、穩(wěn)定劑(例如乳糖)、助溶劑(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味劑、芳香劑以及防腐劑等。
含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物含有本發(fā)明活性多肽，包括本發(fā)明的活性多肽與普通添加物如惰性稀釋劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、潤(rùn)滑劑等混合，并用已知方法制備的噴劑、搽劑、栓劑、藥膏等。
T-20融合蛋白可以用于預(yù)防和治療艾滋病，如單獨(dú)使用及同AZT、DDC、DDI、D4T、3TC、那韋拉品(Nevirpine)、地拉韋啶(Delavirdine)、額發(fā)文那韋(Efavinavor)、Sequanavir、來(lái)頓那韋(Ritonavir)、印第那韋(Indinavir)、納爾芬那韋(Nelfinavir)、安皮樂(lè)那韋(Amprenavir)等組成的任意組合使用。


圖1顯示本發(fā)明重組質(zhì)粒1的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示本發(fā)明T-20融合蛋白在甲醇酵母中的表達(dá)。
圖3顯示本發(fā)明T-20融合蛋白的抗融合活性。
圖4顯示本發(fā)明重組質(zhì)粒2的構(gòu)建示意圖。
圖5顯示本發(fā)明重組質(zhì)粒3的示意圖。圖中“Ampicillin”表示氨芐抗性基因，“αfactor”表示“α因子”。
圖6顯示本發(fā)明重組質(zhì)粒4的示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1表達(dá)載體為pPICZαC的工程菌構(gòu)建本例利用Invitrogen公司的EasySelectTM Pichia表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)T-20融合蛋白。利用pPICZαC為表達(dá)載體，將T-20基因與Fc基因克隆于α因子信號(hào)肽基因后。
1.1基因的克隆與重組質(zhì)粒1的構(gòu)建(圖1)設(shè)計(jì)并合成T-201，T-202，T-203，T-204，F(xiàn)c1，F(xiàn)c2(SEQ ID NO5、6、7、8、9、10)，以T-201、T-202，T-203，T-204為引物，PCR擴(kuò)增T-20基因序列，其中5’端和3’端分別引入Kpn I和Xba I位點(diǎn)。以Fc1、Fc2為引物，以從外周血淋巴細(xì)胞中抽提的總RNA為模板合成的第一鏈cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Fc基因，5’端和3’端分別引入Cla I和Eco RI位點(diǎn)。PCR條件為94℃1分鐘，52℃1分鐘，72℃1分30秒，共35輪循環(huán)。PCR產(chǎn)物回收后克隆至pGEM-T載體中，得到重組質(zhì)粒pGEM-T-T-20和pGEM-T-Fc，經(jīng)測(cè)序確定為T(mén)-20和Fc的基因序列。
用Cla I和Eco RI切開(kāi)表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC，然后與Cla I和Eco RI處理后的Fc基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’(購(gòu)自Invitrogen公司)，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上。篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒，然后用Kpn I和Xba I切開(kāi)重組質(zhì)粒，與Kpn I和Xba I處理后的Fc基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒1。經(jīng)DNA序列分析與設(shè)計(jì)序列相同。
1.2重組質(zhì)粒1轉(zhuǎn)化宿主菌X-33大量抽提重組質(zhì)粒1，用Sac I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的X-33宿主菌，涂布在含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
1.3表達(dá)篩選從轉(zhuǎn)化子中挑選20個(gè)單克隆，分別接種到25ml的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600到5.0，離心收集菌體，懸浮到150ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每24小時(shí)加入1.5ml甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE，看到在27kd左右有明顯的表達(dá)條帶，為T(mén)-20融合蛋白，篩選高表達(dá)菌株為工程菌(圖2)。
1.4抗融合活性測(cè)定T-20融合蛋白具有抗融合活性，能減少合胞體的形成，可以通過(guò)測(cè)定合胞體的形成量檢測(cè)其活性。HIV感染的Hela細(xì)胞H1-J.C53細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)24小時(shí)，EDTA處理細(xì)胞使其洗脫備用。未感染H1-J.C53細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)24小時(shí)后加入不同稀釋度T-20 DMEM溶液，最終濃度為0-100μM不等，共浴20分鐘。然后加入處理后的HIV感染細(xì)胞，每孔50個(gè)左右，陰性對(duì)照只加培養(yǎng)基，37℃于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)。固定細(xì)胞，用0.5％結(jié)晶紫染色，立體解剖顯微鏡對(duì)合胞體計(jì)數(shù)，合胞體越少，表示T-20抗融合能力越強(qiáng)。不加T-20的合胞體數(shù)量為100％。試驗(yàn)結(jié)果表明，T-20融合蛋白具有良好的抗融合能力(圖3)。
實(shí)施例2表達(dá)載體為pPIC9的工程菌的構(gòu)建本例使用Invitrogen公司Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)T-20融合蛋白。
2.1重組質(zhì)粒2的構(gòu)建(圖4)設(shè)計(jì)并合成引物T-205、T-206、Fc3、Fc4(SEQ ID NO11、12、13、14)，引物Fc3中引入XhoI酶切位點(diǎn)和酵母α信號(hào)肽切割位點(diǎn)(KEX2酶識(shí)別位點(diǎn))，F(xiàn)c4引物引入Sna BI，T-205引物和T-206分別引入Sna BI和Not I位點(diǎn)。以pGEM-T-Fc為模板，以Fc3、Fc4為引物，PCR擴(kuò)增Fc基因，電泳回收基因片段，用XhoI和Sna BI酶切處理并回收。同時(shí)用XhoI和Sna BI酶切pPIC9質(zhì)粒，電泳回收后與XhoI和Sna BI處理的Fc基因片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自Invitrogen公司)，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒pPIC9-T-20。然后以pGEM-T-T-20為模板，以T-205、T-206為引物，PCR擴(kuò)增T-20基因，電泳回收基因片段，用Sna BI和Not I酶切處理并回收。同時(shí)用Sna BI和Not I酶切pPIC9-Fc質(zhì)粒，電泳回收后與Sna BI和Not I處理后的T-20基因片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒2。DNA序列分析證明基因序列正確。
2.2重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化宿主菌GS115大量抽提重組質(zhì)粒2，用SalI線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的GS115宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
2.3表達(dá)篩選從MD平板上選20個(gè)單克隆分別接種到3ml MGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時(shí)后加入27ml MM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)72小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，篩選高表達(dá)的菌株為工程菌株。
實(shí)施例3表達(dá)載體為pMETαA的工程菌的構(gòu)建本例使用Invitrogen公司Pichia methonolica表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)T-20融合蛋白。
3.1重組質(zhì)粒3的構(gòu)建用Xho I和Not I雙酶切實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒2，回收T-20和Fc融合蛋白基因片段，與Xho I和Not I酶切處理的pMETαA質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒3(圖5)。
3.2重組質(zhì)粒3轉(zhuǎn)化宿主菌PMAD11大量抽提重組質(zhì)粒3，用Apa I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的PMAD11宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
3.3表達(dá)篩選從MD平板上挑選20個(gè)單克隆分別接種到50ml的BMDY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為6.0，離心收集菌體，重新懸浮到5ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每24小時(shí)補(bǔ)加50ul的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)，取樣SDS-PAGE，篩選高表達(dá)菌株為工程菌。
實(shí)施例4表達(dá)載體為pGAPZαA的工程菌的構(gòu)建本例使用Invitrogen公司的連續(xù)表達(dá)載體pGAPZα載體表達(dá)T-20融合蛋白。
4.1重組質(zhì)粒4的構(gòu)建用Xho I和Not I雙酶切實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒2，回收T-20和Fc融合蛋白基因片段，與Xho I和Not I酶切處理的pGAPZαA質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒4(圖6)。
4.2重組質(zhì)粒1轉(zhuǎn)化宿主菌X-33大量抽提重組質(zhì)粒1，用Avr II線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
4.3表達(dá)篩選從轉(zhuǎn)化子中挑選20個(gè)單克隆，分別接種到50ml的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)表達(dá)72小時(shí)，取樣SDS-PAGE，篩選高表達(dá)菌株為工程菌。
實(shí)施例5工程菌的發(fā)酵將自存的實(shí)施例1中獲得的工程菌株接種于BMGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，作為種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入微量元素的溶液，發(fā)酵溫度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌體生長(zhǎng)24小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甘油，同時(shí)將pH下調(diào)到3.0。菌體OD達(dá)到200時(shí)開(kāi)始加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。起始甲醇添加量控制為每升每小時(shí)1-2ml，隨后逐漸增大每升每小時(shí)至15-20ml，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量保持溶氧值大于30％，必要時(shí)通入純氧。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后收獲培養(yǎng)液，離心收集上清，4.0℃保存。
實(shí)施例6發(fā)酵產(chǎn)物的純化將實(shí)施例5獲得的發(fā)酵液用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6，用MWCO20KD的超濾膜濃縮至原體積的1/5，上樣至Protein A Sepharose FF親和層析柱，目的蛋白結(jié)合后，用280nm紫外檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)下，用0.1mol/L pH7.6的磷酸鹽緩沖液沖洗至基線(xiàn)。用0.1mol/L pH3.5的乙酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.0左右。取樣分析，SDS-PAGE顯示蛋白純度大于95％。
序列表<110>上海富純中南生物技術(shù)有限公司<120>T-20融合蛋白、其制備方法及用途<130>034168<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>T-20蛋白的氨基酸序列<400>1Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>2<211>232<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(232)<223>Fc蛋白的氨基酸序列<400>2Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>3<211>228<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>T-20蛋白的編碼序列<400>3tacaccagcc tgatccactc cctgattgaa gaatctcaga accagcaaga aaagaacgaa 60atgtggtcgg actaggtgag ggactaactt cttagagtct tggtcgttct tttcttgctt120caagaactgc tggagctgga taaatgggca tctctgtgga actggtttta atgagttctt180gacgacctcg acctatttac ccgtagagac accttgacca aaattact 228<210>4<211>1398<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>Fc蛋白的編碼序列<400>4gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg acttgaggac120gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg180ccccctggca gtcagaagga gaaggggggt tttgggttcc tgtgggagta ctagagggcc240acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc300tggggactcc agtgtacgca ccaccacctg cactcggtgc ttctgggact ccagttcaag360aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag420ttgaccatgc acctgccgca cctccacgta ttacggttct gtttcggcgc cctcctcgtc480tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat540atgttgtcgt gcatggcaca ccagtcgcag gagtggcagg acgtggtcct gaccgactta600ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc660ccgttcctca tgttcacgtt ccagaggttg tttcgggagg gtcgggggta gctcttttgg720atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg780
tagaggtttc ggtttcccgt cggggctctt ggtgtccaca tgtgggacgg gggtagggcc 840gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 900ctactcgact ggttcttggt ccagtcggac tggacggacc agtttccgaa gatagggtcg 960gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1020ctgtagcggc acctcaccct ctcgttaccc gtcggcctct tgttgatgtt ctggtgcgga 1080cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1140gggcacgacc tgaggctgcc gaggaagaag gagatgtcgt tcgagtggca cctgttctcg 1200aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260tccaccgtcg tccccttgca gaagagtacg aggcactacg tactccgaga cgtgttggtg 1320tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgaa tgtgcgtctt ctcggagagg 1380gacagaggcc catttact1398<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>14tacgtattta cccggagaca gggagaggct cttctgc 3權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生T-20融合蛋白的方法，該方法包括(a)將編碼T-20與Fc的融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于大腸桿菌、甲醇酵母、CHO或昆蟲(chóng)表達(dá)載體，得到T-20融合蛋白重組表達(dá)載體；(b)將步驟(a)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌，篩選獲得表達(dá)T-20融合蛋白的工程菌；(c)在適合所述融合蛋白表達(dá)的條件下發(fā)酵培養(yǎng)步驟(b)中的工程菌；(d)從步驟(c)的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中純化分離出所述融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(a)之前，以化學(xué)合成獲得的T-20基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，并以RT-PCR方法獲得Fc基因。
3.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述T-20融合蛋白為R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1為Fc蛋白、其變體或片段，R2為T(mén)-20蛋白、其變體或片段，L為接頭。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述T-20蛋白、或其變體、片段選自以下(a)SEQ ID NO1所示的T-20序列；(b)氨基酸序列X-Y，其中X，Y為圖1所示的包括位置1-36的任何殘基，并且X＜Y，特別是1-36；
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Fc蛋白選自以下(A)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；(B)亞部分(A)的氨基酸序列，在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有取代或缺失的不同氨基酸，其中的編號(hào)采用SEQ ID NO2的編號(hào)i.一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；ii.一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基；iii.缺失或用丙氨酸取代位置5的絲氨酸；iv.缺失或用谷氨酰胺取代位置20的谷氨酸；v.缺失或用丙氨酸取代位置130的谷氨酸；vi.缺失或用丙氨酸取代位置105的賴(lài)氨酸；vii.缺失或取代位置107的賴(lài)氨酸；viii.缺失N端1-17位的氨基酸序列；ix.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除Fc受體結(jié)合位點(diǎn)；x.取代或缺失一個(gè)或多個(gè)殘基以消除補(bǔ)體Clq結(jié)合位點(diǎn)；xi.亞部分i-x的組合。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述接頭選自以下(a)ala-(ala)n-ala，n可以是1-4間的整數(shù)；(b)gly-(gly)n-gly，n可以是0-4間的整數(shù)；(c)gly-pro-gly；(d)gly-gly-pro-gly-gly；(e)val；(f)tyr-val；(g)ser-gly-(gly)6-gly；(h)亞部分(a)-(g)的任何組合。
7.一種T-20融合蛋白，其特征在于，它為R1-L-R2和R1-R2形式，其中R1為Fc蛋白、其變體或片段，R2為T(mén)-20蛋白、其變體或片段，L為接頭。
8.編碼權(quán)利要求7所述的T-20融合蛋白的核苷酸序列。
9.含有權(quán)利要求8所述的T-20融合蛋白的藥物制劑。
10.T-20融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療艾滋病的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及T－20融合蛋白(T－20多肽和免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白)在多種甲醇酵母菌株中的表達(dá)、大規(guī)模培養(yǎng)及分離純化技術(shù)。最后得到的高純度重組T－20融合蛋白藥物制劑可用于艾滋病治療。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1580265SQ03142139
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者倪健, 羅鵬, 楊武劍, 鄭穎 申請(qǐng)人:上海富純中南生物技術(shù)有限公司