專(zhuān)利名稱(chēng)：一種可增強(qiáng)基因槍接種dna疫苗誘生細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生的細(xì)胞免疫應(yīng)答的新方法，及其用途。
背景技術(shù)：
DNA疫苗(DNA vaccine)又稱(chēng)基因疫苗(Gene vaccine)，其本質(zhì)為將外源性蛋白編碼基因片段克隆在真核質(zhì)粒DNA表達(dá)載體上，直接接種后可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源性蛋白并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于它可克服傳統(tǒng)疫苗的部分缺陷、能同時(shí)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞及體液免疫，并具有制備簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程疫苗亞單位疫苗之后的第三代疫苗，為未來(lái)疫苗的一個(gè)發(fā)展方向，近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注和深入研究。有研究報(bào)道，DNA疫苗在不同動(dòng)物中誘生免疫應(yīng)答的強(qiáng)度存在明顯的差異，在小鼠模型中效果較為肯定，在大動(dòng)物(如靈長(zhǎng)目動(dòng)物)和人體中免疫效果則不理想。研究DNA疫苗在不同種動(dòng)物差異的機(jī)制及如何使DNA疫苗在大動(dòng)物、人體內(nèi)更有效已成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。
已知，增強(qiáng)DNA疫苗免疫效率的策略主要包括篩選高免疫原性表位或使用多價(jià)表位，優(yōu)化表達(dá)載體、DNA疫苗的靶向?qū)?、使用佐劑、尋找最佳接種方式等。其中DNA疫苗接種的方式對(duì)其誘生的免疫應(yīng)答效果有著重要的影響。DNA疫苗接種方式按途徑可分為肌肉接種，皮膚接種與粘膜接種；按DNA的處理形式可分為包裹金顆粒-基因槍轟擊，鹽水溶解-注射器注射以及減毒沙門(mén)/志賀菌或腺病毒等為載體口服或吸入等接種方式。
基因槍接種DNA疫苗是將質(zhì)粒DNA包裹于金顆粒上，利用高壓惰性氣體的沖擊將金顆粒直接轟入細(xì)胞內(nèi)，因此它比注射器接種法有更高的轉(zhuǎn)染效率?；驑尳臃N只需注射器接種DNA用量的1/100～1/1000即可誘生相當(dāng)水平的抗體應(yīng)答(Fynan EF et al.Proc Natl AcadSci USA，1993；9011478-82)。有鑒于此，一般認(rèn)為基因槍接種方式能克服肌注接種DNA疫苗在大動(dòng)物和人體中的低效，目前DNA疫苗在人體中的實(shí)驗(yàn)已采用基因槍接種的方法。
有研究表明基因槍接種DNA疫苗誘生的免疫應(yīng)答類(lèi)型以Th2型為主而Th1型免疫應(yīng)答的水平極弱，而以注射器肌注或皮內(nèi)注射則主要誘生Th1型免疫應(yīng)答，(Pertmer TM et al.J Virol 1996；706119-25；Feltquate DM et al.J Immunol，1997；1582278-84)。而Th1型免疫應(yīng)答在清除病毒持續(xù)性感染、抗胞內(nèi)菌感染和抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，基因槍接種相應(yīng)DNA疫苗誘生低水平Th1型免疫應(yīng)答成為其應(yīng)用的障礙。
“CpG結(jié)構(gòu)”(CpG motif)為Krieg AM等提出的概念(Krieg AM，et al.Nature.1995，3746522546-549)即一些中間為未甲基化的CpG二核苷酸、兩側(cè)分別為兩個(gè)嘌呤(5’側(cè))和兩個(gè)嘧啶(3’側(cè))的特定寡核苷酸序列，如5’-AACGTT-3’、5’-GACGTC-3’、5’-AGCGCT-3’等。大量體外研究已發(fā)現(xiàn)，該特定結(jié)構(gòu)對(duì)哺乳動(dòng)物棉衣系統(tǒng)具有激活作用，能刺激Mφ，DC，NK，T及B淋巴細(xì)胞，并使之分泌IL-2、IL-6、IL-12及IFN-γ等，使免疫反應(yīng)向Th1型轉(zhuǎn)變(Stacey KJ，et al.J Immunol.1996，15752116-2122；Sparwasser T，et al.Eur J Immunol.1998，2862045-2054；Yamamoto S，et al.Jpn J Cancer Res.1998，797866-873；Bendigs S，et al.Eur J Immunol.1999，29(4)1209-1218)。Sato等(Sato Y，et al.Science.1996，2735273352-354)發(fā)現(xiàn)，卡那霉素抗性基因中不含有在氨芐青霉素抗性基因中存在的CpG結(jié)構(gòu)，相應(yīng)載體的免疫原性較弱，由此推測(cè)載體骨架中的CpG結(jié)構(gòu)的存在與否決定了DNA疫苗的免疫原性。他們進(jìn)一步在含有卡那抗性基因的載體中插入CpG結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)可提高該載體的免疫效果。袁正宏等(中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN 1382492A)公開(kāi)了在DNA疫苗載體中插入對(duì)人免疫系統(tǒng)有特異性刺激活性的CpG motifs能增強(qiáng)其特異性免疫原性。Weeratna等報(bào)道了接種蛋白疫苗HBsAg時(shí)使用CpG ODN作為佐劑比福氏不完全佐劑(FIA)和Titermax Gold等更強(qiáng)的誘生免疫應(yīng)答而毒性更小，而且當(dāng)CpG ODN與TH2型佐劑混合使用時(shí)能克服它們的TH2型佐劑的偏向。
基因槍接種DNA用量?jī)H為注射器接種用量的1/100乃至更少，前者含有的CpG motif的量也僅為后者的1/100乃至更少。這可能是導(dǎo)致基因槍接種DNA疫苗免疫應(yīng)答為T(mén)h2型偏向的原因之一。目前尚無(wú)增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗佐劑的新方法。
有報(bào)道CpG的識(shí)別受體Toll樣受體9(TLR9)位于細(xì)胞內(nèi)，CpG-ODN需要入胞才能激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ahmad-Nejad P et al.EurJ Immunol，2002；321958-68)。倘若用注射器于轟擊局部接種CpG-ODN則主要位于細(xì)胞外，尚需胞吞/胞飲等過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在CpG-ODN與質(zhì)粒DNA混合后用注射器接種的情形中，Weeratna等報(bào)道(Weeratna R et al.Antisense Nucleic Acid Drug Dev1998；8351-6)ODN與質(zhì)粒DNA可能會(huì)互相競(jìng)爭(zhēng)入胞受體，因而既可能導(dǎo)致表達(dá)的抗原量減少又可能使CpG作用受到抑制。
另外，CpG-ODN在基因槍接種DNA疫苗中的作用，也會(huì)因CpG-ODN與質(zhì)粒DNA的比例不同而受影響。已有研究使用CpG-ODN與質(zhì)粒DNA比例為50μg/1μg，但大量的CpG可強(qiáng)烈刺激細(xì)胞因子分泌而導(dǎo)致質(zhì)粒中抗原基因表達(dá)受到抑制(Tan Y et al.Hum Gene Ther1999；102153-61)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生的細(xì)胞免疫應(yīng)答的新方法，一種能增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生Th1免疫應(yīng)答的方法，及其實(shí)際用途。
本發(fā)明是能增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生Th1免疫應(yīng)答的佐劑策略。
本發(fā)明的技術(shù)方案是在基因槍接種質(zhì)粒DNA疫苗的同時(shí)導(dǎo)入一定比例的免疫刺激元件即合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作為佐劑。將質(zhì)粒DNA與寡核苷酸CpG DNA共同包裹于金顆粒表面，利用高壓惰性氣體轟擊，將其直接導(dǎo)入表皮層細(xì)胞內(nèi)。
所述的CpG-ODN與質(zhì)粒DNA比例為1∶1至10∶1。
為評(píng)價(jià)本發(fā)明即佐劑策略的效果，采用基因槍接種表達(dá)HBsAg的質(zhì)粒DNA疫苗pYQF-2CpG/HBs加CpG ODN和小鼠體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了加用CpG ODN佐劑后的特異性的體液免疫(檢測(cè)血清中抗HBsAg)和細(xì)胞免疫(抗原特異性的IFN-γ分泌能力和CTL活性)。結(jié)果表明，1)本發(fā)明在基因槍接種DNA疫苗的同時(shí)加用CpG ODN增加CpG motif的量能增強(qiáng)其誘生Th1型免疫應(yīng)答水平。2)將CpG-ODN與質(zhì)粒DNA共同沉淀在金顆粒上然后以基因槍轟擊導(dǎo)入的方式比基因槍接種質(zhì)粒DNA的同時(shí)局部用注射器接種CpG-ODN的方式或者CpG-ODN與質(zhì)粒DNA混合后用注射器接種的方式效果好，本發(fā)明方法可使其直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而更容易激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并避免了ODN與質(zhì)粒DNA對(duì)入胞受體的競(jìng)爭(zhēng)。
本發(fā)明通過(guò)下述方法和步驟實(shí)現(xiàn)本發(fā)明采用質(zhì)粒pYQF/s-2CpG(CN 1382492A)，帶有CMV啟動(dòng)子，含有BGH轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)及卡那霉素抗性基因。在多克隆位點(diǎn)插入HBVs蛋白基因，并在框架上插入了兩個(gè)合成的CpG結(jié)構(gòu)(上海生工公司)。質(zhì)粒用Qiagen Plasmid Maxi Kit大量制備、純化，溶于生理鹽水。所述CpG-ODN序列為5’-TCAAAACGTTGATG-3’，GpC-ODN對(duì)照序列為5’-TCAAAAGCTTGATG-3’。
本發(fā)明基因槍子彈采用亞精胺—氯化鈣包裹法將DNA包裹在直徑為1.0μm的金粉上(購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司)。將質(zhì)粒DNA與ODN混合，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，或者質(zhì)粒DNA單獨(dú)溶于ddH2O，加入到含金顆粒的亞精胺中混勻，再加入CaCl2使DNA沉淀于金顆粒上。乙醇洗滌后，加入無(wú)水乙醇混勻，將金顆粒-DNA乙醇溶液吸到基因槍塑料管中，空氣干燥制成子彈。
取6周齡BALB/c雌鼠(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)動(dòng)物免疫，分組，基因槍接種；肌注接種；皮內(nèi)接種，初次免疫后4周加強(qiáng)免疫，方法同前。
觀察基因槍轟擊后3小時(shí)或轟擊后立即皮膚活檢標(biāo)本其金顆粒的分布。
檢測(cè)免疫后抗HBsAg抗體及亞類(lèi)，ELISA法檢測(cè)靜脈血清其中抗體IgG及亞類(lèi)IgG1、IgG2a，間接法ELISA檢測(cè)IgG總血清滴度。
檢測(cè)免疫后細(xì)胞免疫功能，采用IFN-γELISA定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海茂元科技有限公司)檢測(cè)IFN-γ水平。進(jìn)行Calcein熒光標(biāo)記CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)熒光值。按下述公式計(jì)算殺傷率和特異性殺傷率，殺傷率＝(試驗(yàn)組的FI-自發(fā)釋放的FI)/(陽(yáng)性對(duì)照的FI-自發(fā)釋放的FI)×100％。
特異性殺傷率為P815-s的值減去P815的值。
經(jīng)方差分析和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明基因槍轟擊可使包裹DNA的金顆粒直接進(jìn)入上皮層細(xì)胞內(nèi)，在小鼠體內(nèi)證實(shí)基因槍接種質(zhì)粒DNA疫苗的同時(shí)共同導(dǎo)入CpG ODN/質(zhì)粒DNA比例為5-10/1的CpG ODN的佐劑策略能增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗的Th1型免疫應(yīng)答水平，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性，抗原特異的IFN-γ產(chǎn)生能力。本發(fā)明方法有利于克服基因槍接種DNA疫苗產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答水平低下的缺陷，是一種人體應(yīng)用基因槍接種DNA疫苗時(shí)有潛力的佐劑策略。


圖1為本發(fā)明實(shí)施實(shí)例所用DNA疫苗pYQF-CpG/HBs質(zhì)粒載體示意圖及全硫代修飾CpG-ODN與GpC-ODN對(duì)照序列。
圖2為基因槍轟擊后金顆粒在皮膚組織的分布其中，a、組織切片H&E染色光鏡觀察(放大240倍)；b、透射電鏡觀察(放大2850倍)。
圖3為基因槍轟擊后金顆粒在細(xì)胞的位置
其中，a、放大6500倍；b、放大11000倍。
圖4為免疫接種后抗HBs抗體應(yīng)答反應(yīng)其中，a.ELISA檢測(cè)免疫后8周血清(1∶100)中IgG、IgG1和IgG2a；b.免疫后小鼠IgG抗體滴度水平。
圖5為免疫接種后HBsAg特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)其中，a、加強(qiáng)免疫后四周HBsAg特異性CTL反應(yīng)。b、免疫接種后小鼠脾細(xì)胞經(jīng)HBsAg體外刺激IFN-γ釋放水平(pg/ml)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用亞精胺—氯化鈣包裹法將DNA包裹在直徑為1.0μm的金粉上，制備基因槍子彈。將10μg質(zhì)粒DNA與100μg或10μg ODN，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，混合或者10μg質(zhì)粒DNA單獨(dú)溶于100μl ddH2O，加入到含5mg金顆粒的100μl 0.1M亞精胺中混勻，再加入200μl 2.5M CaCl2使DNA沉淀于金顆粒上。乙醇充分洗滌后，加入100μl無(wú)水乙醇混勻，每10μl為一顆子彈。將金顆粒-DNA乙醇溶液吸到基因槍專(zhuān)用塑料管中，空氣干燥后即制成子彈。其中，每顆子彈攜有0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，10μg ODN(2.2×10-3μmol)；或0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，1μg ODN(2.2×10-4μmol)；或0.5mg金顆粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)。
取6周齡BALB/c雌鼠動(dòng)物免疫，隨機(jī)分為九組，每組6只小鼠。1)基因槍接種腹皮毛剃凈，用基因槍(新芝科技有限公司)以2.5MPa的壓力轟擊將金顆粒-DNA或金顆粒-DNA-CpG ODN導(dǎo)入小鼠腹部皮膚，局部可見(jiàn)2cm2左右的轟擊范圍。2)肌注接種戊巴比妥鈉(75mg/kg)麻醉后，用100u胰島素注射器于雙側(cè)脛前肌進(jìn)針，緩慢注入質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液，每側(cè)25μg/50ul。)皮內(nèi)接種小鼠背尾端皮毛剃凈，戊巴比妥鈉(75mg/kg)麻醉后，用100u胰島素注射器與脊柱平行進(jìn)針皮膚，皮內(nèi)可見(jiàn)鼓起皮丘。初次免疫后4周，用上述方法加強(qiáng)免疫，表1為實(shí)驗(yàn)分組、免疫方式與接種材料。
表1組別 接種方靶位接種材料A 基因槍皮內(nèi)、腹部皮膚1μg質(zhì)粒+1μg CpG-B 基因槍皮內(nèi)、腹部皮膚1μg質(zhì)粒+1μgC 基因槍皮內(nèi)、腹部皮膚1μg質(zhì)粒+10μgD 基因槍皮內(nèi)、腹部皮膚1μg質(zhì)粒+10μgE 基因槍皮內(nèi)、腹部皮膚1μg質(zhì)粒F 注射器肌注小腿脛外側(cè)1μg質(zhì)粒G 注射器肌注小腿脛外側(cè)50μg質(zhì)粒H 注射器皮內(nèi)、背部皮膚50μg質(zhì)粒I 注射器肌注小腿脛外側(cè)生理鹽水其中，每組6只BALB/c小鼠。質(zhì)粒DNA為PYQF-2CpG。1μg質(zhì)粒DNA含8.34×10-7mol分子；50μg質(zhì)粒DNA含4.17×10-5μmol分子；1μg ODN DNA含2.2×10-4μmol分子；10μg ODN DNA含2.2×10-3μmol分子。
觀察基因槍轟擊后金顆粒的分布轟擊后3小時(shí)局部皮膚活檢取材，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片(6μm)，H&E染色，光鏡放大240倍下拍照?；蜣Z擊后立即活檢取材制備成電鏡標(biāo)本，超薄切片(70-90nm)，uranyl acetate和lead citrate染色，透射電鏡觀察。
圖2、圖3顯示了基因槍轟擊后包裹DNA的金顆粒在組織細(xì)胞中的位置。結(jié)果表明，組織切片H&E染色光鏡觀察及透射電鏡顯示金顆粒主要位于上皮層內(nèi)，少數(shù)可深入到真皮的上層。金顆粒位于胞漿或直接進(jìn)入了胞核，金顆粒周?chē)鸁o(wú)明顯膜樣結(jié)構(gòu)，表明金顆粒是由高壓惰性氣體的轟擊直接進(jìn)入而非通過(guò)胞吞等過(guò)程進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。
免疫后抗HBsAg抗體及亞類(lèi)檢測(cè)免疫日始每隔2周從小鼠眼眶后眥靜脈叢采血，分離血清，ELISA法檢測(cè)其中抗體IgG及亞類(lèi)IgG1、IgG2a。將每組內(nèi)各小鼠血清等量混勻，作梯度稀釋?zhuān)g接法ELISA檢測(cè)IgG總血清滴度。圖4顯示了免疫接種后HBsAg特異性體液免疫水平。其中E組為基因槍接種1μg質(zhì)粒DNA(8.34×10-7μmol)的IgG2a水平為0.396±0.287遠(yuǎn)低于注射器肌肉或皮內(nèi)接種50μg質(zhì)粒DNA(4.17×10-5μmol)(G組2.915±0.117和H組2.269±0.307)。基因槍接種加入1或10μg對(duì)照GpC-ODN并不能增加IgG2a水平(B組0.29±0.153和D組0.354±0.184)。而基因槍接種加入CpG-ODN則能增加抗-HBs IgG2a水平(A組0.541±0.234和C組1.545±0.111)，其中C組為加用10μg CpG-ODN(2.2×10-3μmol)比E組的增高有統(tǒng)計(jì)顯著差異(p＜0.01)。加用CpG-ODN后抗-HBsAg總IgG也有所增強(qiáng)。監(jiān)測(cè)HBsAg-特異性抗體滴度，加強(qiáng)免疫后，C組IgG應(yīng)答反應(yīng)比A組或E組要更快早更強(qiáng)。接種后第14周，A組、C組、E組、G組及H組HBsAg特異性的IgG抗體滴度分別為1∶2400，1∶4800，1∶2400，1∶4800，1∶4800。
檢測(cè)免疫后細(xì)胞免疫功能每組隨機(jī)挑取2只小鼠，處死，無(wú)菌取脾臟，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整濃度為4×106/ml，備檢測(cè)細(xì)胞因子及CTL活性用。IFN-γ檢測(cè)為加HBsAg 10μg/ml，培養(yǎng)48小時(shí)收集上清，采用IFN-γ ELISA定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海茂元科技有限公司)檢測(cè)IFN-γ水平。Calcein熒光標(biāo)記CTL殺傷實(shí)驗(yàn)以70 Gy的γ射線滅活對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P815-s細(xì)胞制成刺激細(xì)胞。在脾細(xì)胞中加入刺激細(xì)胞，比例為20∶1，培養(yǎng)6天，加mIL-225u/ml維持。用Ficoll分離液純化刺激后效應(yīng)細(xì)胞，以無(wú)酚紅培養(yǎng)液重懸。以5~10uMcalcein AM(購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司)37℃水浴標(biāo)記對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P815-s，P815細(xì)胞，D-Hank’s液洗后以無(wú)酚紅培養(yǎng)液重懸制成標(biāo)記靶細(xì)胞。在96孔圓底培養(yǎng)板中按效/靶比例50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀釋效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記好的靶細(xì)胞。設(shè)完全釋放組其中加細(xì)胞裂解液，與自發(fā)釋放組其中加無(wú)酚紅培養(yǎng)液，孵育4.5小時(shí)后離心，將上清移入新板孔中，熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)熒光值。按下述公式計(jì)算殺傷率和特異性殺傷率，
殺傷率＝(試驗(yàn)組的FI-自發(fā)釋放的FI)/(陽(yáng)性對(duì)照的FI-自發(fā)釋放的FI)×100％。
特異性殺傷率為P815-s的值減去P815的值。
圖5顯示了免疫接種后HBsAg特異性細(xì)胞免疫水平。其中注射器肌肉或皮內(nèi)接種50μg質(zhì)粒DNA的G組和H組有較高水平的CTL活性，基因槍接種1μg質(zhì)粒DNA的E組或加入對(duì)照GpC-ODN的B組和D組CTL活性都很低。而基因槍接種加用10μg CpG-ODN的C組其CTL活性明顯提高。效/靶比為50/1時(shí)，A組、B組、C組、D組、E組、G組、H組和I組分別是7.89％，3.44％，21.84％，4.17％，4.02％，31.47％，33.15％和4.14％。
免疫后8周小鼠脾細(xì)胞在HBsAg刺激后IFN-γ的釋放能力檢測(cè)結(jié)果表明，E組抗原特異性IFN-γ釋放水平僅為236.4pg/ml。而G組和H組分別為2609.1pg/ml和1878.5pg/ml。加用GC-ODN的B組和D組IFN-γ水平?jīng)]有增高甚至反而有所下降，分別為95.0pg/ml和159pg/ml。而基因槍接種加用10μg CpG-ODN的C組其IFN-γ水平大大增高，為1046.2pg/ml。但僅加用1ug CpG-ODN的A組其IFN-γ水平為258.1pg/ml，比E組沒(méi)有明顯升高。
權(quán)利要求
1.一種可增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，其特征是在基因槍接種質(zhì)粒DNA疫苗的同時(shí)，導(dǎo)入免疫刺激元件作為佐劑，其比例為1∶1-10，將質(zhì)粒DNA與免疫刺激元件包裹于金顆粒表面，用高壓惰性氣體轟擊，直接導(dǎo)入表皮層細(xì)胞內(nèi)。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的免疫刺激元件是合成的寡核苷酸CpG-ODN。
3.按權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN與質(zhì)粒DNA疫苗比例為1∶1。
4.按權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN與質(zhì)粒DNA疫苗比例為1∶10。
5.按權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸CpG ODN在用于基因槍接種DNA疫苗時(shí)作為佐劑。
6.按權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征是所述的細(xì)胞免疫應(yīng)答是Th1型免疫應(yīng)答，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性和抗原特異的IFN-γ產(chǎn)生能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種可增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗誘生的Th1型免疫應(yīng)答的方法，本發(fā)明也涉及制備質(zhì)粒DNA－CpG寡聚核苷酸包裹金顆粒的方法。本發(fā)明在基因槍接種質(zhì)粒DNA疫苗的同時(shí)共導(dǎo)入一定比例的合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作為佐劑。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明能增強(qiáng)基因槍接種DNA疫苗的Th1型免疫應(yīng)答水平，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性，抗原特異的IFN－γ產(chǎn)生能力。本發(fā)明有利于克服基因槍接種DNA疫苗誘生低水平Th1型免疫應(yīng)答的缺陷，可用于腫瘤及病毒持續(xù)性感染等的治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1513559SQ03142099
公開(kāi)日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月6日
發(fā)明者袁正宏, 周曉輝 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué), 上海復(fù)旦悅達(dá)生物技術(shù)有限公司