專利名稱：Cc10蛋白的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及CC10蛋白的表達和制備方法，及其在治療哺乳動物肺部相關疾病、哮喘、腫瘤以及腎臟疾病等方面的應用。
背景技術：
CC10(Clara cell 10kDa protein，Clara細胞10kDa蛋白)，又稱為UGB(Uteroglobin，子宮球蛋白)、CCSP、CC16，主要由肺泡II型Clara細胞分泌，分基本型和類固醇誘導型兩類，是分泌球蛋白家族(secretoglobins，SCGBs)成員。和其他家族成員類似，CC10通過鏈間的二硫鍵形成二聚體，蛋白中主要是α螺旋結構。
人CC10基因位于11號染色體q12.3-q13.1區(qū)，全長4.1kb，含有3個外顯子，2個內含子。CC10蛋白前體共91個氨基酸，其中21個為信號肽，成熟蛋白70個氨基酸。其中3位的半胱氨酸與另一蛋白的69位形成二硫鍵，同時69位半胱氨酸與對應蛋白的3位形成二硫鍵，從而形成了由兩個鏈間二硫鍵相連的二聚體。形成的二聚體比較穩(wěn)定，對酸、酶都有很好的耐受性。CC10蛋白是良好的谷氨酰胺轉移酶(Transglutaminase，TG)的天然蛋白底物，體外試驗中，TG能催化CC10蛋白通過相互交聯(lián)形成高分子的聚合物。
CC10具有免疫調節(jié)、抗炎、抗纖維化和抗腫瘤等生物學活性。體外研究表明，CC10是分泌型磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)的強抑制劑(Am.J.Respir.Crit.Care Med.152290)，而PLA2與炎性介質的產生密切相關，PLA2可溶解肺泡表面卵磷脂，是感染性疾病誘發(fā)ARDS的關鍵因素；CC10還可抑制細胞釋放花生四烯酸，花生四烯酸經脂氧化酶及環(huán)氧化酶作用，生成白三烯、血栓素、前列腺素等炎性介質，介導炎性細胞的趨化、激活以及細胞外基質浸潤。
CC10可以抑制甲酸蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(Formyl methionine-leucine-phenylalanine，FMLP)誘導的中性粒細胞和單核細胞的趨化作用(Cell Mol.LifeSci.55771)；CC10還抑制在體外IL-2刺激的人外周血淋巴細胞釋放TNF-α、IL-1β以及IL-8等炎性細胞因子(J.of Immunology 2001，1673025)；CC10還能夠結合細菌的細胞膜，從而抑制毒素在肺部積累，減輕肺部損傷；疏緩肺部平滑肌和肺部血管，改善肺功能。
研究表明，CC10基因缺陷小鼠對多種損傷因素均敏感，如100％濃度的氧吸入、臭氧吸入、病毒或細菌感染等，并且更容易演變成急性呼吸窘迫綜合癥樣的肺泡改變；進一步研究表明，當CC10基因缺陷小鼠氣管內感染腺病毒或假單胞桿菌時，局部的中性粒細胞明顯增加，在肺臟勻漿中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平表達也增高(Am.J.Respir.Cell Biol.17147)。
一些間接性的證據也提示CC10是肺臟炎癥的重要保護性機制，如肺部出現炎癥反應時，相應肺臟產生CC10增多；吸煙導致CC10的產生減少，血清中CC10含量相應降低；CC10基因定位于染色體11q13區(qū)，基因學研究表明該區(qū)與超敏和支氣管超反應性相關，并且在哮喘患者中發(fā)現CC10不同的等位基因(Am.J.Respir.Crit.Care Med.160930)；在新生兒呼吸窘迫綜合癥和多種因素導致的急性呼吸窘迫綜合癥的情況下，局部或全身CC10水平異常。
目前，CC10蛋白在臨床上的應用已經取得了很大的進展，CC10已經被美國FDA批準用于治療新生兒呼吸窘迫綜合癥(Neonatal respiratory distresssyndrome，nRDS)，這些新生兒不能產生天然CC10，容易發(fā)展成嚴重肺部感染。在支氣管-肺發(fā)育不良癥(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)上也已完成II期臨床。
在美國，CC10正在被嘗試用于治療成人呼吸窘迫綜合癥，其適應癥范圍還可擴大到特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺炎、哮喘等。此外，CC10在腎臟疾病及癌癥治療方面也有一定作用。天然CC10在保護腎臟功能方面至關重要。許多糖尿病及慢性高血壓的患者逐漸喪失腎功能，最后需要透析或腎移植，實驗室結果表明， 血液中的天然CC10可以抵制腎臟衰竭，重組CC10可能對腎臟疾病的減緩有一定作用。
CC10通過TG交聯(lián)到細胞膜上，從而保護了胚泡、精子等細胞上的抗原位點，防止引起不必要的免疫反應。在體外試驗中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA932915)，CC10能通過特異性受體，抑制人滋養(yǎng)層細胞和NIH 3T3細胞穿透人工基底膜，證明它在正常懷孕過程中防止絨膜癌的產生有重要作用。最新研究表明，CC10可以抑制腫瘤細胞的生長和代謝，有鑒于此，重組CC10可以和其他化療藥物聯(lián)合使用，用于癌癥治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于提供用大腸桿菌或甲醇酵母表達CC10蛋白并分離純化制備CC10蛋白的生產方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有所獲得的CC10蛋白的藥物制劑。
本發(fā)明還提供上述CC10蛋白在制備預防和治療哺乳動物肺部相關疾病、哮喘、腫瘤以及腎臟疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明生產CC10蛋白的方法包括(a)將編碼CC10蛋白的核苷酸序列可操作地連于大腸桿菌或酵母表達載體，得到CC10蛋白重組表達載體；(b)將步驟(a)中的重組表達載體轉入宿主菌，篩選獲得表達CC10蛋白的工程菌；(c)在適合CC10蛋白表達的條件下發(fā)酵培養(yǎng)步驟(b)中的工程菌；(d)從步驟(c)的發(fā)酵培養(yǎng)產物中純化分離出所述CC10蛋白。
通常，在進行上述步驟(a)之前，根據文獻報道，按照大腸桿菌偏愛密碼子設計CC10的基因片段，同時設計引物，并引入適當的內切酶位點，然后采用PCR方法將基因拼接全長，從而獲得CC10蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明所述的CC10蛋白包括其變體，所述變體有1-5個添加、缺失或置換。本發(fā)明CC10蛋白或其變體可選自(a)SEQ ID NO1所示的CC10蛋白序列；(b)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met的序列；(c)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met-Ala-Ala的序列。
本發(fā)明所述的CC10蛋白還包括CC10蛋白本身與免疫球蛋白Fc或白蛋白融合產生的蛋白。眾所周知，與免疫球蛋白或白蛋白融合可以延長蛋白的半衰期，從而提高蛋白的活性。
本發(fā)明提供一種編碼CC10蛋白的核酸序列。眾所周知，一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，本發(fā)明分別提供了一種編碼CC10蛋白的核酸序列(SEQ IDNO2)，但在某些實施方案中，可以根據實際需要對核酸密碼子進行突變，特別是選用宿主菌偏愛密碼子，但所產生的CC10蛋白的氨基酸序列不變。
本發(fā)明中所指的大腸桿菌可以是各種菌株如DH5α、BL21(DE3)、K802等，本發(fā)明宿主菌優(yōu)選BL21(DE3)。而選用的表達載體可以是pBV220、pET11a、pET32a(+)等本領域已知的載體。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌pET表達載體，最佳為pET32a(+)。
本發(fā)明中所指的甲醇酵母包括巴德氏畢赤酵母(pichia pastoris)、pichiamathonolica等能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母。本發(fā)明中使用的表達載體可以選用各種已知的載體，如商業(yè)化的載體pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。將重組表達載體通過化學轉化、電轉化或原生質體轉化等方法轉入宿主細胞，利用合適的條件篩選重組子，可以誘導表達重組蛋白。
本發(fā)明中，當工程菌為大腸桿菌時，發(fā)酵培養(yǎng)包括以下步驟經篩選的工程菌株活化后接入培養(yǎng)液(如LB)中制備種子液，培養(yǎng)過夜后接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵用培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基(例如M9+LB)，發(fā)酵條件控制為pH4.0-8.0，優(yōu)選pH7.0，溫度28℃-37℃，優(yōu)選為30.0，溶氧控制在30％以上。培養(yǎng)3-6小時后開始補料，加入甘油或葡萄糖等，當菌體OD值達到高密度(OD600為3-200)，加入誘導劑〔如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或甲醇〕誘導表達，控制pH5.0-7.0，優(yōu)選pH6.0，誘導2-8小時結束。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施例中，工程菌為大腸桿菌，發(fā)酵pH較佳為6.0-8.0，更佳為7.0；當菌體OD600為3-20、優(yōu)選3-15時，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，工程菌為甲醇酵母，發(fā)酵時的pH控制為5.0-8.0，優(yōu)選為7.0，當菌體OD600達到15-200時，加入誘導劑甲醇進行誘導。
本發(fā)明中，從發(fā)酵產物中純化分離出CC10蛋白或CC10融合蛋白包括以下要點收集發(fā)酵產物，目標蛋白表達產物存在于培養(yǎng)液或菌體中；如表達產物在菌體中，則需破菌；經多步純化獲得產物(包括親和柱層析、離子柱層析、反向層析、透析、超濾或凝膠過濾等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC檢驗，獲得純度大于95％的目標蛋白。
本發(fā)明提供的CC10蛋白生產方法可以使CC10蛋白表達量占到全菌蛋白的15％左右，純化得率超過30％。比文獻報道的5％左右的表達量要高3倍。
本發(fā)明首次提出CC10可以有效地治療嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)，根據有關報道，10％的SARS患者病情進行性惡化，發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥，需要呼吸機的維持治療，急性呼吸窘迫綜合癥的死亡率極高，約80％。SARS的另一致命原因是因為感染誘發(fā)了過激的免疫反應，以致身體對肺組織出現自我排斥現象所致，故利用CC10抑制細胞免疫反應，抑制炎癥反應和過敏性反應以及組織纖維化?？梢詼p輕SARS感染癥狀，減少肺部纖維化，提高疾病的治愈率。
CC10治療SARS的依據在于(1)SARS患者并發(fā)ARDS時，需高濃度氧的正壓通氣治療，有可能引起氧中毒而進一步影響肺功能。在給新生小豬100％氧濃度正壓通氣造成的氧中毒和氣壓性損傷的模型中，rhCC10可使肺順應性恢復至正常水平，對肺功能具有明顯的保護作用。(2)在SARS相關ARDS病人肺泡灌洗液中，白細胞尤其是中性粒細胞計數顯著偏高。在新生兔子和羊羔的的呼吸窘迫綜合征模型中，rhCC10可抑制單核細胞和中性粒細胞的浸潤，同時降低肺組織和循環(huán)中IL-8的濃度，后者是引起ARDS發(fā)生的最直接的細胞因子。(3)CC10抑制磷酸酯酶A2的活性，而PLA2與炎性介質的產生密切相關，PLA2還溶解肺泡表面卵磷脂，導致ARDS的產生。(4)在內毒素誘導離體灌注大鼠肺臟氣道收縮的模型中，CC10對抗內毒素所引起的氣道阻力增加，同時降低了體液中炎性細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6的水平。(5)在呼吸道合胞病毒感染導致的小鼠肺炎模型中，rhCC10除表現出有效的抗炎作用外，它還可以促進病毒顆粒的清除，選擇性地抑制Th2細胞因子反應，而對Th1無影響，因此對機體的抗病毒免疫無抑制。
已確證，CC10蛋白在臨床應用上是安全有效的。因此，該蛋白是安全的并適宜于藥物使用。
本發(fā)明的藥物制劑，是含有本發(fā)明蛋白的藥物制劑，或者是以本發(fā)明蛋白為活性成分、與傳統(tǒng)的輔劑和添加物一起組成的藥物制劑，包括注射針劑、口服制劑、含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物。
注射針劑含有本發(fā)明活性蛋白，優(yōu)選以無菌凍干物儲存。在給藥前與合適的等滲溶液混合，等滲溶液包括傳統(tǒng)的適于注射或注入的等滲水系統(tǒng)，其中含有用于注射液的普通添加物如穩(wěn)定劑和促溶劑，優(yōu)選生理鹽水或通過緩沖液調成的等滲溶液。
口服制劑含有本發(fā)明活性蛋白，包括按知方法制備的固體組合物、液體組合物及噴霧組合物。該組合物為含有本發(fā)明活性蛋白與至少一種常用的惰性稀釋劑混合。該組合物在實際一般情況下，也可加入惰性稀釋劑之外的其他添加物如潤滑劑(例如硬脂酸鎂)、懸浮劑、崩解劑(如甘醇酸纖維素鈣)、穩(wěn)劑(例如乳糖)、助溶劑(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味劑、芳香劑以及防腐劑等。
含服制劑及肺部、氣道、鼻腔給藥制劑及其他非腸道給藥組合物含有本發(fā)明活性多肽，包括本發(fā)明活性蛋白與普通添加物如惰性稀釋劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、潤滑劑等混合，并用已知方法制備的噴劑、搽劑、栓劑、藥膏等。
CC10蛋白可以用于治療SARS，還可用于防治其他肺部急性感染(病毒或者細菌性)、成人呼吸窘迫綜合癥、肺纖維化、慢性阻塞性肺炎、哮喘、腫瘤以及腎臟疾病等。


圖1重組質粒1的構建示意圖。
圖2為重組質粒2的構建示意圖。
圖3為CC10融合表達電泳圖。
圖4為重組質粒3的構建示意圖。
圖5為重組質粒4示意圖。圖中，“Ampicillin”為氨芐抗性基因。
圖6為重組質粒5示意圖。
圖7表示CC10抑制豬胰腺磷脂酶A2的劑量圖。
圖8表示內毒素對離體灌注通氣肺組織的氣道阻力影響。
圖9表示CC10對內毒素誘導氣道阻力增加的百分率。
圖10表示支氣管肺泡灌洗液中TNFα的含量，單位為pg/ml。
圖11表示支氣管肺泡灌洗液中IL-6的含量，單位為pg/ml。
圖12表示肺循環(huán)灌注液中IL-1β的含量，單位為pg/ml。
具體實施例方式
實施例1表達載體為pET11a的CC10工程菌的構建本例利用Novagen公司的pET表達系統(tǒng)表達CC10蛋白。
1.1基因的全合成與重組質粒1的構建(圖1)設計并合成基因片段P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO3，4，5，6，7，8)，其中P1引物引入NdeI位點，同時在Met后引入兩個Ala以增加表達量，P6引物引入了BamHI、HindIII、NotI位點。首先以P3、P4為模板，P2、P5為引物，進行第一次PCR反應，然后以此產物為模板，以P1、P6為引物進行第二次PCR，得到250bp左右的PCR產物。用膠回收方法回收PCR產物，用NdeI和BamHI位點將基因片段克隆到pET11a載體中，獲得重組質粒1，經測序證實序列正確。
1.2質粒的轉化與工程菌的篩選將重組質粒1轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司)，用氨芐青霉素抗性篩選，得陽性克隆，為CC10的表達工程菌〔pET11a-CC10/BL21(DE3)〕。
將經篩選的CC10工程菌劃線在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16小時。挑選生長良好的單菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含Amp 100μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜菌以1∶20接種于LB培養(yǎng)液(含Amp 100μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)。當OD600達0.6～0.8時，加IPTG至終濃度0.5mM，誘導6小時。菌液經5000rpm，5min離心。去培養(yǎng)基上清，沉淀菌體加入上樣緩沖液，100℃水浴3min，離心后上SDS-PAGE電泳(濃縮膠5％，分離膠15％)，染色、脫色、掃描分析。因CC10基因長219bp，蛋白含73個氨基酸，理論分子量約為8.1KD。
實施例2表達載體為pET32a(+)的CC10融合表達工程菌的構建2.1重組質粒2的構建(圖2)設計并合成引物7(SEQ ID NO9)，引物7引入腸激酶識別位點相應DNA序列，同時引入KpnI酶切位點。以pET11a-CC10為模板，以P7、P6為引物，PCR擴增CC10基因，電泳回收基因片段，用KpnI和HindIII處理，電泳回收得到KpnI和HindIII處理后的基因片段。
用KpnI和HindIII切開表達質粒pET32a(+)，然后與KpnI和HindIII處理后的基因片段連接，轉化大腸桿菌DH5α(購自Invitrogen公司)，涂布在帶氨芐青霉素的LB平板上。篩選轉化子得到重組質粒2。
2.2CC10在大腸桿菌中的融合表達將重組質粒2轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司)，用氨芐青霉素抗性篩選，得陽性克隆，為CC10的表達工程菌(pET32a(+)-CC10/BL21(DE3))。
將經篩選的CC10工程菌劃線在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16小時。挑選生長良好的單菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含Amp 100μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜菌以1∶20接種于LB培養(yǎng)液(含Amp 100μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)。當OD600達0.6～0.8時，加IPTG至終濃度0.5mM，誘導6小時。菌液經5000rpm，5min離心。去培養(yǎng)基上清，沉淀菌體加入上樣緩沖液，100℃水浴3min，離心后上SDS-PAGE電泳(濃縮膠5％，分離膠15％)，染色、脫色、掃描分析。因Trx-CC10融合基因長714bp，融合蛋白含228個氨基酸，理論分子量約為25KD。SDS-PAGE結果表明在20KD和31KD之間有明顯表達條帶(圖3)，與預期相符，融合蛋白占菌體總蛋白25％左右。篩選高表達的菌株為工程菌株。
實施例3表達載體為pPIC9的CC10工程菌的構建本例使用Invitrogen公司Pichia pastoris表達系統(tǒng)表達CC10蛋白。
3.1重組質粒3的構建(圖4)設計并合成引物P8(SEQ ID NO10)，引物P8中引入XhoI酶切位點和酵母α信號肽切割位點(KEX2酶識別位點)。以pET11a-CC10為模板，以P8、P6為引物，PCR擴增CC10基因，電泳回收基因片段，用XhoI和NotI酶切處理并回收。同時用XhoI和NotI酶切pPIC9質粒，電泳回收后與XhoI和NotI處理后的CC10基因片段連接，然后轉化大腸桿菌DH5α(購自Invitrogen公司)，篩選轉化子得重組質粒3(pPIC9-CC10)。DNA序列分析證明基因序列正確。
3.2重組質粒3轉化宿主菌GS115大量抽提重組質粒3，用SalI線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的GS115宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
3.3表達篩選從MD平板上選20個單克隆分別接種到3ml MGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時后加入27ml MM培養(yǎng)基進行誘導，表達72小時，取樣進行SDS-PAGE檢測，篩選高表達的菌株為工程菌株。
實施例4表達載體為pMETαA的CC10蛋白工程菌的構建本例使用Invitrogen公司Pichia mathonolica表達系統(tǒng)表達CC10蛋白。
4.1重組質粒4的構建用XhoI和NotI雙酶切實施例3中的重組質粒3，回收CC10蛋白基因片段，與XhoI和NotI酶切處理的pMETαA質粒連接，轉化大腸桿菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉化子得重組質粒4(圖5)。
4.2重組質粒4轉化宿主菌PMAD11大量抽提重組質粒4，用ApaI線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的PMAD11宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
4.3表達篩選從MD平板上挑選20個單克隆分別接種到50ml的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為6.0，離心收集菌體，重新懸浮到5ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導表達，每24小時補加50ul的甲醇，誘導表達72小時，取樣SDS-PAGE，篩選高表達菌株為工程菌。
實施例5表達載體為pGAPZαA的CC10蛋白工程菌的構建本例使用Invitrogen公司的連續(xù)表達載體pGAPZα載體表達CC10蛋白。
5.1重組質粒5的構建用XhoI和NotI雙酶切實施例4中的重組質粒4，回收CC10蛋白基因片段，與XhoI和NotI酶切處理的pGAPZαA質粒連接，轉化大腸桿菌TOP10F′，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉化子得到重組質粒5(圖6)。
5.2重組質粒5轉化宿主菌X-33大量抽提重組質粒5，用AvrII線性化，然后用無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉化制備好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉化子。
5.3表達篩選從轉化子中挑選20個單克隆，分別接種到50ml的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)表達72小時，取樣SDS-PAGE，篩選高表達菌株為工程菌。
實施例6在大腸桿菌中的發(fā)酵將實施例1獲得的工程菌株斜面上取一環(huán)菌種接入LB培養(yǎng)液中，30℃200rpm搖瓶培養(yǎng)12-16小時后按10％接種量接入M9+LB培養(yǎng)液中，30℃250rpm搖瓶培養(yǎng)6小時。將種子液按1∶20接入量加入裝有m9+LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30℃，400rpm培養(yǎng)，通氣量0.2vvm，控制pH值7.0，溶解氧(DO)30％以上，培養(yǎng)至4-6小時，DO值開始上升時開始補加葡萄糖，至OD600約為5時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，誘導3.5小時停止發(fā)酵。
實施例7酵母工程菌的發(fā)酵將實施例3中獲得的工程菌株接種于BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時后，作為種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為加了微量元素的基礎培養(yǎng)基溶液，發(fā)酵溫度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌體生長24小時后開始補加甘油，同時將pH下調到3.0。菌體OD600達到200時開始加入甲醇誘導表達。起始甲醇添加量控制為每升每小時1-2ml，隨后逐漸增大每升每小時至15-20ml，通過調節(jié)攪拌速度和通氣量保持溶氧值大于30％，必要時通入純氧。連續(xù)誘導培養(yǎng)72小時后收獲培養(yǎng)液，離心收集上清，4.0℃保存。
實施例8CC10蛋白的純化8.1發(fā)酵產物的預處理將實施例6中得到的發(fā)酵產物(8000g)離心10min收集菌體，把菌體按1∶5(g∶ml)的比例重懸于破菌緩沖液(20mM PB，1mM EDTA，pH7.5)中，用高壓勻漿法破菌，破菌后10000rpm(18000g)離心30min，收集上清液備用。
將實施例7中得到的發(fā)酵上清液用磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH至7.5，通過分子量為3000的超濾膜濃縮體積至原先的1/5。
8.2Sephacryl S-100柱層析Sephacryl S-100柱(Phamacia)用平衡緩沖液(50mM Gly-HCl，pH3.5)充分平衡，把上述離心上清液過柱，流速為3ml/min。用平衡緩沖液洗脫，分步收集洗脫峰(5ml/管)，用SDS-PAGE分析洗脫峰成分，把含CC10蛋白的組分合并收集備用。
8.3SP-Sepharose HP柱層析SP-Sepharose HP柱(Phamacia)用平衡緩沖液(50mM Gly-HCl，pH3.5)充分平衡，把上述離心收集液過柱，并用平衡緩沖液洗至基線平穩(wěn)，然后用線性的鹽梯度(B液50mM Gly-HCl，0.5M NaCl，pH3.5)洗脫(0-80％B，40ml，40min)。分步收集洗脫峰，用SDS-PAGE分析洗脫峰成分，把含CC10蛋白的組分合并收集備用。
8.4Superdex 75柱層析Superdex 75柱(Phamacia)用平衡緩沖液(50mM乙酸銨，pH6.0)充分平衡，把上述收集液過柱，流速1.5ml/min。用平衡緩沖液洗脫，分步收集洗脫峰，用SDS-PAGE分析洗脫峰成分，把純的CC10蛋白組分合并收集。用RP-HPLC分析(C-18柱)純度大于95％。
實施例9CC10抑制磷脂酶A2的活性測定采用Cayman化學公司提供的PhospholipaseA2 Assay Kit檢測，其原理是底物二庚酰基磷脂酰膽堿(diheptanoyphosphatidylcholdine，一種磷脂)的1，2-二硫代類似物被PLA2水解后產生硫醇，與顯色劑DNTB結合而顯色。在檢測板的各滴定孔內加入5ul檢測緩沖液，10ul顯色劑DNTB，陽性對照孔內加入標準品10ul PLA2，將實施例8獲得的CC10溶于0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，取不同的摩爾濃度，與豬胰腺來源的2nM的磷脂酶A2(購自Sigma)在37℃共孵育25分鐘，混合液中取10ul樣品加入測定孔中，每孔加入200ul底物溶液啟動反應，記錄開始加入的精確時間。用封板膠覆蓋反應孔，小心振動板子混勻，于405nm測定至少5個時間點的OD值。選取OD值在1.2內(反應呈線性)的兩個時間點計算酶活性，結果表明純化的重組CC10蛋白可以明顯地抑制PLA2活性(見圖7)。
實施例10CC10抑制內毒素誘導離體灌注大鼠肺臟氣道收縮的研究10.1離體灌注通氣的大鼠肺臟準備將雄性Sprague-Dawley大鼠(210-320g)麻醉，然后后分離肺臟，經肺動脈用含有12.5mM HEPES、5.0mM葡萄糖和2％牛血清白蛋白組份V的Krebs-Ringer緩沖液持續(xù)維持10cmH2O靜水壓。首次輸入50ml緩沖液替換原有的血液，用蠕動泵將流入和流出連接起來，肺臟實現用總體積100ml的可再循環(huán)緩沖液進行體外灌注，通過調節(jié)泵壓，使靜水壓維持在10cmH2O，肺動脈壓由血壓傳感器測量并紀錄到示波器上，調整流出端高度使左側動脈壓為0cmH2O。灌注液的pH值由CO2控制在7.32到7.45之間，溫度保持37℃。
將離體的肺臟懸掛在氣管上，置于37℃、潮濕的人工胸腔中，施行負壓通氣，每分鐘80次。呼吸機和真空泵連接人工胸腔，產生相對于外周的浮動性負壓(-1到-10cmH2O)。用壓差傳感器測量胸腔壓力，用連接在一個壓差傳感器上的呼吸速度描記管測量空氣流速。用溫暖的室內氣體進行通氣，每5分鐘通過將吸氣末壓力降到-14cmH2O，激活一次深呼吸。胸腔壓力(P)和空氣流速(F)可用以計算任何時間(t)的氣道阻力(R)，計算公式為Rt＝Pt/Ft。
10.2 CC10對內毒素誘導增加氣道阻力的影響實驗分三組LPS，CC10+LPS，CC10。內毒素LPS(20mg/kg)溶于1ml僅僅不含有牛血清白蛋白的Krebs-Ringer緩沖液中，輸注到流入肺動脈的管中，繼續(xù)灌注120min，記錄壓力和流速，分析內毒素是否增加氣道阻力，結果見圖8，發(fā)現隨著時間的延長，內毒素組的氣道阻力逐漸增加。為了判斷CC10的作用，在LPS輸注前，輸注溶于0.8ml生理鹽水中的實施例8的CC10(20mg/kg)的溶液，并循環(huán)30min以保證內循環(huán)狀態(tài)穩(wěn)定，然后如前所述，灌注LPS，記錄壓力和流速，計算氣道阻力，結果表明CC10對抗內毒素所引起的氣道阻力增加(圖9)。
10.3測量細胞因子和CC10含量在實驗開始后，灌注液每60min取樣一次，實驗最終進行支氣管肺泡灌洗，得到灌洗液，用夾心ELISA法(試劑盒購自R&D Systems)檢測灌注液和支氣管肺泡灌洗液中的細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6以及IFNγ，用MultiskanMk3(Thermo Labsystems)讀數、定量，發(fā)現CC10降低了體液中炎性細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6的水平，而IFNγ的含量無明顯的抑制，結果見圖10、11、12。
采用競爭ELISA方法進行CC10的定量，用兔多克隆的抗CC10抗體(購自DAKO)以1∶2500倍稀釋，包被ELISA條板，室溫過夜，棄去上清，PBS洗板3次后加入溶于PBS的5％蔗糖和1％BSA，封閉3小時，然后棄去封閉液，室溫干燥至少3小時。用活化的辣根過氧化物酶標記CC10分子，取110μl不同稀釋度的CC10標準液、樣本或者對照與110μl CC10-HRP混合，復孔每100ul加到抗體包被板中，PBS洗板3次后加入OPD顯色液，然后加入1N H2SO4終止反應，490nm處檢測每孔光密度值，根據標準曲線計算樣本或對照的CC10含量。
序列表<110>上海富純中南生物技術有限公司<120>CC10蛋白的制備及應用<130>034168<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>70<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(70)<223>CC10蛋白的氨基酸序列<400>1Glu Ile Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val Ile Glu Thr Leu Leu Met Asp1 5 10 15Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu Phe Ser Pro Asp Gln20 25 30Asp Met Arg Glu Ala Gly Ala Gln Leu Lys Lys Leu Val Asp Thr Leu35 40 45Pro Gln Lys Pro Arg Glu Ser Ile Ile Lys Leu Met Glu Lys Ile Ala50 55 60Gln Ser Ser Leu Cys Asn65 70<210>2<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>CC10蛋白的核苷酸序列<400>2gaaatctgcc cgtctttcca gcgtgttatc gaaaccctgc tgatggacac cccgtccagc 60ctttagacgg gcagaaaggt cgcacaatag ctttgggacg actacctgtg gggcaggtcg120tacgaagcag ctatggaact gttctctccg gaccaggaca tgcgtgaagc aggtgctcag180atgcttcgtc gataccttga caagagaggc ctggtcctgt acgcacttcg tccacgagtc240ctgaagaaac tggttgacac cctgccgcag aaaccgcgtg aatccatcat caaactgatg300gacttctttg accaactgtg ggacggcgtc tttggcgcac ttaggtagta gtttgactac360
gagaagatcg ctcagtctag cctgtgcaac taactcttct agcgagtcag atcggacacg420ttgatt 426<210>3<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atacatatgg ctgctgaaat ctgcccgtct ttccagcgtg ttatcgaaac cctgctg 57<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gttatcgaaa ccctgctgat ggacaccccg tccagctacg aagcagctat ggaactgttc60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5acgaagcagc tatggaactg ttctctccgg accaggacat gcgtgaagca ggtgctcagc60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ggattcacgc ggtttctgcg gcagggtgtc aaccagtttc ttcagctgag cacctgcttc60
<210>7<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7agactgagcg atcttctcca tcagtttgat gatggattca cgcggtttct gc 52<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8gccggatcct ctagaagctt agttgcacag gctagactga gcgatcttct ccatc 55<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ctgggtaccg acgacgacga caaggaaatc tgcccgtctt tccag 45<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10tctctcgaga aaagagaaat ctgcccgtct ttccag 3權利要求
1.一種產生CC10蛋白的方法，該方法包括(a)將編碼CC10蛋白的核苷酸序列可操作地連于大腸桿菌或酵母表達載體，得到CC10蛋白重組表達載體；(b)將步驟(a)中的重組表達載體轉入宿主菌，篩選獲得表達CC10蛋白的工程菌；(c)在適合CC10蛋白表達的條件下發(fā)酵培養(yǎng)步驟(b)中的工程菌；(d)從步驟(c)的發(fā)酵培養(yǎng)產物中純化分離出所述CC10蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在進行所述步驟(a)之前，根據大腸桿菌偏愛密碼子設計CC10基因片段，采用PCR將基因片段拼接成全長CC10基因。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CC10蛋白包括其變體，所述變體有1-5個添加、缺失或置換。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述CC10蛋白、其變體選自以下(a)SEQ ID NO1所示的CC10蛋白序列；(b)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met的序列；(c)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met-Ala-Ala的序列。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組表達載體為大腸桿菌pET表達載體，宿主菌為BL21(DE3)；所述發(fā)酵步驟包括用基礎培養(yǎng)基，在pH 4.0-8.0、溫度28℃-37℃、溶氧控制在30％以上的條件下發(fā)酵，培養(yǎng)4-8小時后開始補料，加入甘油或葡萄糖，當菌體OD600為3-20時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達，此時控制pH5.0-7.0，誘導2-8小時；所述純化步驟包括用親和層析收集融合蛋白，然后用腸激酶酶切去除前導蛋白，再通過離子交換層析、分子篩層析得到純CC10蛋白。
6.權利要求1所產生的CC10蛋白的用途，其特征在于，用于制備預防或治療肺部相關疾病、哮喘、腫瘤以及腎臟疾病的藥物。
7.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述肺部相關疾病包括病毒性或細菌性肺部急性感染、新生兒呼吸窘迫綜合癥、成人呼吸窘迫綜合癥、支氣管-肺發(fā)育不良癥、肺纖維化、慢性阻塞性肺炎。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述肺部急性感染為SARS。
全文摘要
本發(fā)明涉及用基因工程方法在大腸桿菌或甲醇酵母中表達CC10蛋白，經過發(fā)酵和分離純化，得到重組CC10蛋白的生產方法。本發(fā)明還涉及將CC10蛋白用于治療嚴重急性呼吸道綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)。此外，CC10蛋白還可用于治療成人呼吸窘迫綜合癥、嬰幼兒呼吸窘迫綜合癥及慢性支氣管－肺發(fā)育不良、特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺炎、哮喘、多種腫瘤以及腎臟疾病等。
文檔編號A61P11/06GK1580261SQ0314207
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權日2003年8月6日
發(fā)明者倪健, 張婷婷, 楊武劍, 羅鵬, 劉定燮 申請人:上海富純中南生物技術有限公司