專利名稱:一種紫芝發(fā)酵方法及制得的紫芝菌絲體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靈芝的發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種采用深層液體發(fā)酵的紫芝發(fā)酵方法及制得的紫芝菌絲體，該紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖具有高抗腫瘤活性。
背景技術(shù)：
靈芝[Gamoderma lucidum(Leys ex Fr. )Karst]為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬真 菌。靈芝味甘、性溫、無毒，可補(bǔ)心、肝、脾、肺、腎之氣，具滋補(bǔ)強(qiáng)身、扶正固本之功效。有效 成分主要有多糖類(即靈芝多糖)、三萜類(主要為靈芝酸)等。靈芝多糖的藥用價值主 要有抗癌、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成、消炎和輻射保護(hù)作用；靈芝酸的藥 用價值主要有護(hù)肝和排毒、降低膽固醇、抑制組織胺的釋放、抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)化等。中國 古代根據(jù)靈芝特征把靈芝分為赤芝、紫芝、黃芝、白芝、黑芝、青芝等六類。因為在自然界中 野生的靈芝十分稀少，遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。而人工栽培靈芝收獲時間長，占地面積大， 且靈芝的產(chǎn)量與質(zhì)量易受環(huán)境氣候及蟲害的影響。同人工栽培靈芝相比，發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝 有效成份由于生產(chǎn)周期短、勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)。目前使用和研究較多 的赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss. Ex Fr.)Karst·]。
然而，不同種類靈芝的發(fā)酵培養(yǎng)條件有所差異，所得到的有效成分及藥效方面也 有所不同。由于紫芝資源稀少，對其進(jìn)行上述研究更為重要。然而目前有報道的研究不多， 其中張衛(wèi)國等(張衛(wèi)國，趙云濤，劉欣.固體發(fā)酵9519紫芝菌絲體多糖分子量的分布；韶關(guān) 學(xué)院學(xué)報，2003 ;24 (6) 70-73)報道了紫靈芝固體發(fā)酵菌絲體多糖的分子量分布；公開號 CN1436842A的中國專利(
公開日期2003年8月20日)公開了一種高產(chǎn)多糖的紫芝及其 發(fā)酵生產(chǎn)工藝，主要采用半固態(tài)發(fā)酵方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、發(fā)酵周期短的采用深層液體發(fā)酵的 紫芝發(fā)酵方法，以及該發(fā)酵方法制得的具有抗腫瘤高活性的胞內(nèi)多糖的紫芝菌絲體。
本發(fā)明人通過諸多試驗，發(fā)現(xiàn)在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中，紫芝菌絲細(xì)胞能在反應(yīng)器 內(nèi)處于最適溫度、酸堿度和氧氣等環(huán)境下生長，不受外界環(huán)境的影響，菌絲生長分裂迅速， 能在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量菌絲體，成分與天然相當(dāng)甚至優(yōu)于天然，而且液體深層發(fā)酵成本低， 產(chǎn)量大，可實現(xiàn)規(guī)?；?、工業(yè)化。更令人驚奇的是，在對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離和藥效分 析后，發(fā)現(xiàn)采用深層液體發(fā)酵方法得到的紫芝菌絲體，其胞內(nèi)多糖具有較高抗腫瘤活性。本 發(fā)明重點(diǎn)篩選出了適合大多數(shù)紫靈芝菌株液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基和工藝條件。
因此，本發(fā)明紫芝發(fā)酵方法的技術(shù)方案為一種紫芝發(fā)酵方法，其包括將紫芝 [Ganoderma japonicum(Fr.) Lloyd 或 Ganoderma sinense Zhao, Xu etZhang]菌株依次進(jìn) 行PDA(土豆葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵， 其中一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有豆餅粉1 3%、葡萄糖1. 5 5%、無水硫酸鎂0. 1 0. 3%、磷酸二氫鉀0. 1 0. 4%的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有蔗糖2. 5 6%、蛋白胨0.2 0.6%、酵母膏0. 1 0.3%、無水硫酸鎂0. 1 0. 3%、磷酸二氫鉀0. 2 0.5%, pH5. 5-6. 5的液體培養(yǎng)基，所述的一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)；上述百分 比均為重量百分比。
根據(jù)本發(fā)明，所述的紫芝菌株可以是現(xiàn)市場上可以購買得到的菌株，例如中國科 學(xué)院微生物研究所分離的紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.) Lloyd]，中國普通微生物菌種 保藏中心保藏，保藏號CGMCC5. 69 ；
中國科學(xué)院微生物研究所分離的紫芝[Ganodermajaponicum(Fr. ) Lloyd]，中國農(nóng) 業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC，保藏號分別為ACCC50045、ACCC50468 ；
以及上海農(nóng)科院分離的紫芝(Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang)，上海農(nóng)科 院食用菌保藏中心，紫芝1號等。
其中，所述的PDA培養(yǎng)基的配方可以同常規(guī)，含有重量百分比為30 40%的土豆、 2 3%的葡萄糖、0. 2 0. 5%的麥芽提取物及1. 4 2. 0%的瓊脂；斜面培養(yǎng)條件也可以 采用靈芝菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，通常選用25°C培養(yǎng)6 7天。
而所述的振蕩培養(yǎng)優(yōu)選溫度在25 28°C，頻率為190-220rpm的搖瓶培養(yǎng)。
較佳地，所述的一級種子培養(yǎng)4 6天，發(fā)酵培養(yǎng)4 7天，發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為 5 15v/v%。
另外，本發(fā)明還提供一種紫芝菌絲體的制備方法，其包括將上述紫芝發(fā)酵方法制 得的發(fā)酵產(chǎn)物離心去除上清液得到菌絲體。
根據(jù)本發(fā)明，所述的離心速度優(yōu)選為4000rpm，離心次數(shù)通常為1 3次。
而本發(fā)明要提供的紫芝菌絲體，即由上述制備方法制得。
進(jìn)一步可將上述紫芝菌絲體采用常規(guī)的多糖提取方法進(jìn)行紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖 的提取。
較佳地，所述的提取方法包括下列步驟
①將菌絲體用水加熱至85 95°C進(jìn)行提??；
②將提取液濃縮后，加入乙醇，過濾所得沉淀即為紫芝胞內(nèi)粗多糖。
較佳地，步驟①中每次提取時菌絲體與水的重量體積比為1:3 5(g/ml)，提取次 數(shù)為1 3次，每次提取時間0. 5 3小時。
較佳地，步驟②中提取液通過減壓濃縮至原體積的1/6 1/3，加入3 5倍量 85 95%的乙醇。
更佳地，本發(fā)明提取方法還可將步驟②中得到的沉淀再溶于水，過濾，棄去水不溶 物，將濾液干燥，得到初步純化的紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖。
由本發(fā)明上述制備方法制得的紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖中，胞內(nèi)粗多糖中多糖含量為 18 50% (w/w)，初步純化的胞內(nèi)多糖中多糖含量為39 75% (w/w) 0在對小鼠體內(nèi)抗腫 瘤試驗中，口服本發(fā)明紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖對小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌具有較強(qiáng)的抑 瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。
具體實施方式
下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
實施例1紫芝菌絲體的制備[0026]將紫芝菌株CGMCC5. 69轉(zhuǎn)接于PDA瓊脂斜面(含土豆35%、葡萄糖2. 5%、麥芽提 取物0. 3%及瓊脂1. 7%，余量為水)，25°C培養(yǎng)6天獲得發(fā)酵研究的種斜面；轉(zhuǎn)接于3只裝 有IOOml種子培養(yǎng)基的750ml搖瓶；種子培養(yǎng)基組成為豆餅粉2%，葡萄糖2. 5%，無水硫 酸鎂0. 15 %，磷酸二氫鉀0.3%,余量為水，pH自然；在25 °C、220rpm培養(yǎng)4天，按照10v/v % 的接種量將IOOml種子液轉(zhuǎn)接于10只裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的750ml搖瓶(發(fā)酵培養(yǎng)基 組成蔗糖4%，蛋白胨0. 4%，酵母膏0.2%，無水硫酸鎂0.15%，磷酸二氫鉀0. 3%，余量 為水4!16.0)，281、190印111搖床培養(yǎng)5天。發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液，4000rpm離心lOmin， 去除上清液；加去離子水600ml洗滌菌絲體，離心，去除上清液，菌絲體再同樣洗滌二次；稱 重為0. 32g/ml發(fā)酵液(計算方法所得發(fā)酵液中菌絲體的重量g/所得發(fā)酵液的體積ml)。
實施例2紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株ACCC50045接種于PDA斜面培養(yǎng)基(含土豆30 %、葡萄糖3 %、麥芽 提取物0. 5%及瓊脂1. 4% )，25°C培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)接于4只裝有IOOml種子培養(yǎng)基得750ml 三角搖瓶(種子培養(yǎng)基豆餅粉1 %，葡萄糖5 %，無水硫酸鎂0. 30 %，磷酸二氫鉀0. 1 %， pH自然)，28°C、200rpm培養(yǎng)6天，按照5v/v%接種量轉(zhuǎn)接于裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的10 只750ml三角搖瓶，25°C、220rpm培養(yǎng)7天，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2. 5%，蛋白胨0. 6%，酵母 膏0. 1%，無水硫酸鎂0. 10%，磷酸二氫鉀0. 5%，pH6. 5。菌絲體分離同實施例1 ；稱重為 0. 23g/ml發(fā)酵液。
實施例3紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株ACCC50468接種于PDA斜面培養(yǎng)基(含土豆40%、葡萄糖2%、麥芽提 取物0. 2%及瓊脂2. 0% )，25°C培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)接于4只裝有IOOml種子培養(yǎng)基得750ml三 角搖瓶(種子培養(yǎng)基豆餅粉3%，葡萄糖1. 5%，無水硫酸鎂0. 30%，磷酸二氫鉀0. 4%， PH自然)，26°C、200rpm培養(yǎng)4天，按照15v/v%接種量轉(zhuǎn)接于裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的10 只750ml三角搖瓶，26 °C、220rpm培養(yǎng)4天，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖6 %，蛋白胨0. 2 %，酵母膏 0.3%,無水硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.2%，pH5. 5。菌絲體分離同實施例1 ；稱重為0. 18g/ ml發(fā)酵液。
實施例4紫芝菌絲體的制備
將紫芝菌株紫芝1號接種于PDA斜面培養(yǎng)基(同實施例1)，25°C培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)接于 4只裝有IOOml種子培養(yǎng)基的750ml三角搖瓶(種子培養(yǎng)基同實施例3)，25°C、190rpm培 養(yǎng)4天，按照10v/v%接種量轉(zhuǎn)接于裝有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的10只750ml三角搖瓶，28°C、 220rpm培養(yǎng)6天，發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。菌絲體分離同實施例1 ；稱重為0. 46g/ml發(fā)酵 液。
實施例5-8紫芝菌絲體胞內(nèi)粗多糖的制備
將實施例1-4的菌絲體分別按下述方法提取胞內(nèi)粗多糖菌絲體與所加去離子水 的重量體積比為1 :3 5(g/ml)，加熱至85 95°C提取2h左右；抽濾，再同樣煮提兩次，將 三次水煮的提取液合并，減壓濃縮至300ml，加900ml
醇，攪拌沉淀24h，過濾得到胞內(nèi)粗多糖。實施例5 8胞內(nèi)粗多糖測 定總糖(測定方法見文獻(xiàn)葉姜瑜，談鋒.紫芝多糖的純化和組分分析，西南師范大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)，2002，27 (6) 945-949)含量分別為 43%、32%、20%、50%。
實施例9 12紫芝菌絲體初步純化的胞內(nèi)多糖的制備[0037]將實施例5 8的紫芝菌絲體胞內(nèi)粗多糖分別溶解于約200 600ml去離子水中， 抽濾，棄去水不溶物，將溶液蒸干，得到紫芝菌絲體純化的胞內(nèi)多糖(總糖測定方法同實施 例5-8)，多糖含量分別為55%、45%、38%、75%。
上述實施例中本發(fā)明未特殊說明的百分比均為重量百分比。
試驗實施例紫芝菌絲體胞內(nèi)多糖的抗腫瘤作用
采用小鼠移植性腫瘤模型，用腫瘤抑制率來評價抗腫瘤活性。具體方法如下取生 長良好的小鼠H22肝癌腹水、小鼠Lewis肺癌瘤塊，用生理鹽水稀釋(細(xì)胞濃度約1-2X107 個/ml)，每只小鼠右腋皮下接種0. 2ml，隨機(jī)分組，設(shè)空白對照組(蒸餾水)、陽性對照雙靈 固本散(現(xiàn)有靈芝類抗腫瘤中藥)組、樣品組(本發(fā)明實施例5 12)，接種后次日起給藥 (給藥劑量如下表所示)，給藥體積為0. 5ml/20g體重，連續(xù)經(jīng)口灌胃7-10天。接種后10-14 日脫頸處死動物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重之大小。
根據(jù)以下公式判定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種紫芝發(fā)酵方法，其包括將紫芝菌株依次進(jìn)行PDA培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)、一級種子 培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵，其中，一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有豆餅粉1 3%、葡 萄糖1. 5 5%、無水硫酸鎂0. 1 0. 3%、磷酸二氫鉀0. 1 0. 4%的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培 養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有蔗糖2. 5 6%、蛋白胨0. 2 0. 6%、酵母膏0. 1 0. 3%、無水硫酸鎂 0. 1 0. 3%、磷酸二氫鉀0. 2 0. 5%、pH5. 5-6. 5的液體培養(yǎng)基，所述的一級種子培養(yǎng)和 發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)；上述百分比均為重量百分比。
2.如權(quán)利要求
1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的PDA培養(yǎng)基含有重量百分比為 30 40%的土豆、2 3%的葡萄糖、0. 2 0. 5%的麥芽提取物及1. 4 2. 0%的瓊脂，所 述的斜面培養(yǎng)為25°C培養(yǎng)6 7天。
3.如權(quán)利要求
1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的振蕩培養(yǎng)為溫度在25 28°C，頻 率為190-220rpm的搖瓶培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求
1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的一級種子培養(yǎng)4 6天，發(fā)酵培養(yǎng) 4 7天，發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為5 15v/v%。
5.一種紫芝菌絲體的制備方法，其包括將權(quán)利要求
1 4任一項所述的紫芝發(fā)酵方法 制得的發(fā)酵產(chǎn)物離心去除上清液得到菌絲體。
6.如權(quán)利要求
5所述的制備方法，其特征在于所述的離心速度為4000rpm，離心次數(shù)為 1 3次。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種紫芝發(fā)酵方法，其包括將紫芝菌株依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的深層液體發(fā)酵。本發(fā)明還提供了由該發(fā)酵方法制得的紫芝菌絲體。本發(fā)明通過對紫芝深層發(fā)酵工藝參數(shù)和培養(yǎng)基的改進(jìn)，使獲得的紫芝菌絲體中提取的胞內(nèi)多糖中多糖含量達(dá)到39～75％，并具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
文檔編號C12N1/14GKCN101376873 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710045369
公開日2011年3月30日 申請日期2007年8月29日
發(fā)明者張琴, 楊義芳, 楊國紅, 桑紅嬌, 胡海峰 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),