專利名稱:副溶血性弧菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。特別涉及對副溶血 性弧菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導(dǎo)等 溫擴(kuò)增法檢測副溶血性弧菌的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發(fā)病 率在我國食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
目前對食源性病原體的檢測主要依靠病原體分離法、免疫學(xué)方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費時，一般需要5天時間，最長需要一個月時間，而且 免疫學(xué)方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的診斷。例如PCR中 國專利公開號CN1M6825的專利申請，批露了一種利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特異性， 通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳觀察等分子生物學(xué)手段檢測副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準(zhǔn)確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應(yīng)用。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國際 專利公開號WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，即針對靶基因 的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對)，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)， 擴(kuò)增結(jié)果可直接對擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或者對其濁度進(jìn)行檢測，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料STOR Green I染色，通過肉眼進(jìn)行判定。用于LAMP技術(shù)擴(kuò) 增的2對引物乃針對基因6個區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時間內(nèi)擴(kuò)增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點。但是目前未有利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò) 增法檢測副溶血性弧菌的檢測試劑盒，以及對副溶血性弧菌tih特定基因片段具有特異性 的引物及引物組的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的引 物。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌檢測用引物，其特征在于，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所述 靶基因為副溶血性弧菌的tih-—GenBank登陸號AY578148，所述引物與所述靶基因的946 位一1140位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。[0009]本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的 引物組。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA
反向外引物B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG
正向內(nèi)引物FIP-tih
GCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC
反向內(nèi)引物BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC
可以擴(kuò)增副溶血性弧菌的tih(AY578148)基因序列的946位-—1140位的核酸序 列的一部分或其互補鏈。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測 副溶血性弧菌的檢測方法。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種副溶血性弧菌的檢測方法，該方法用于檢測標(biāo)本中是否存在副溶血性弧菌， 其特征在于，以副溶血性弧菌的tih基因序列的946位一1140位的核酸序列的一部分或 其互補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物組選擇性擴(kuò)增上述靶區(qū)域，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn) 物。
具體檢測方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本；細(xì)菌待 檢標(biāo)本用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄 其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul 上清液做待檢模板DNA;
2)副溶血性弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)
取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應(yīng)體系，混勻點離后在約60-65°C條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80°C 的環(huán)境下2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積20ul IOOul)
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物 F3-tih GGCACAAGCGATGTACTACA反向外引物 B3-tih GACGCTGCACACTCAGAG正向內(nèi)引物FIP-tihGCGCAGAAGTTAGCGTCTCGAAGCGCAAGGTTACAACATCAC反向內(nèi)引物 BIP-tih GGTTTCGTGAACGCGAGCGACGCAATGCGTGGGTGTAC可以擴(kuò)增副溶血性弧菌tih基因的特異性核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的副溶血性弧菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組擴(kuò)增 副溶血性弧菌tih基因946位一1140位的特異核酸序列部分。
3.一種副溶血性弧菌的檢測方法，該方法用于檢測食品樣品中是否存在副溶血性弧 菌，其特征在于，以副溶血性弧菌GenBank登陸號為AY578148的tih基因946位-—1140 位的核酸序列為靶基因，通過LAMP法用權(quán)利要求
1-2任意一項所述的引物組選擇性擴(kuò)增所 述靶基因，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的副溶血性弧菌檢測方法，其特征在于，具體檢測方法為1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標(biāo)本；細(xì)菌待檢標(biāo)本用相應(yīng)腸道增 菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA 提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液做待檢模板 DNA ；2)副溶血性弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應(yīng)體系，混勻點離后在約60-65°C條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80°C 的環(huán)境下2分鐘滅活酶；反應(yīng)總體積20ul IOOul的反應(yīng)體系為成分終濃度或量待檢模板核酸模板I-IOuI正向內(nèi)引物FIP-tih1.0-2.0 uM擴(kuò)反向內(nèi)引物BIP-tih1.0-2.0 uM增正向外引物F3-tih0.15-0.3 uM反反向外引物B3-tih0.15-0.3 uM應(yīng)甜菜堿betaine0.8-1.5 M液dNTP1.0-1.6mMMgs042-6 mM反應(yīng)緩沖液 Bst DNAPolvmerase Buffer IOx1/10反應(yīng)體積ul酶Bst DNA Polymerase0.16-0.64U/ul雙蒸水ddH20加至預(yù)定反應(yīng)體積ul其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8. 8的三羥基甲硫 氨酸甲烷-鹽酸、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述酶為每微升含8-16個活性單位的Bst DNA酶； 3) LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測A)肉眼檢測與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；或，B)加染料后檢測每25ul體系的反應(yīng)管加1000XSTORGreen I invitrogenl_2ul， 1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；或，C)電泳檢測2-3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征性梯 狀條帶，最小片段在160bp左右，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶則結(jié)果為陰性。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的副溶血性弧菌檢測方法，其特征在于，當(dāng)反應(yīng)總體積為25ul 時，所述反應(yīng)體系具體為
6. 一種副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要求
1所述的引物組的擴(kuò)增反應(yīng)液、酶； 所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包括如下試劑
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)液包含1/10預(yù)定反應(yīng)體積IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、 3. 6mM硫酸鎂、1. 6uM正向內(nèi)引物FIP-tih、l. 6uM反向內(nèi)引物BIP_tih、0. 2uM的正向外引物 F3-tih、0. 2uM 的反向外引物 B3-tih、l. 4mM dNTP 和 IM 甜菜堿；所述酶為每微升含8個活性單位、終濃度0. 32U/ul的Bst DNA酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6或7所述的副溶血性弧菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 還包括陰性及陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水；所述陽性對照模板為1 IOOnM 副溶血性弧菌基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。一種副溶血性弧菌檢測用引物，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為副溶血性弧菌的tih---GenBank登陸號AY578148，所述引物與所述靶基因的946位---1140位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。本發(fā)明通過提供一種對副溶血性弧菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測標(biāo)本中是否存在副溶血性弧菌特定基因片段，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在副溶血性弧菌。
文檔編號C12Q1/04GKCN101153330 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710030441
公開日2011年7月13日 申請日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛軍, 魏泉德 申請人:珠海市疾病預(yù)防控制中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),