專利名稱:諾如病毒gⅱ型檢測(cè)用引物、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalampl ification, LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測(cè)技術(shù)。特別涉及對(duì)諾如病毒G II型特定 基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢 測(cè)諾如病毒G II型的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒G II型引起的食物中毒， 其發(fā)病率在我國(guó)食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
目前對(duì)食源性病原體的檢測(cè)主要依靠病原體分離法、免疫學(xué)方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)，一般需要5天時(shí)間，最長(zhǎng)需要一個(gè)月時(shí)間，而且 免疫學(xué)方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的診斷。例如PCR中 國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1526825的專利申請(qǐng)，批露了一種利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特異性， 通過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳觀察等分子生物學(xué)手段檢測(cè)副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準(zhǔn)確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測(cè)費(fèi)用以及對(duì)檢測(cè)人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層普及應(yīng)用。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國(guó)際 專利公開(kāi)號(hào)WO 00/28082)是2000年Notomi等開(kāi)發(fā)出一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，即針對(duì)靶基因 的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對(duì))，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)， 擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過(guò)肉眼進(jìn)行判斷或者對(duì)其濁度進(jìn)行檢測(cè)，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，通過(guò)肉眼進(jìn)行判定。用于LAMP技術(shù)擴(kuò) 增的2對(duì)引物乃針對(duì)基因6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。但是目前未有利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增法檢測(cè)諾如病毒GII型的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種對(duì)諾如病毒G II型特定基因片段具有特異性的 引物。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種諾如病毒G II型檢測(cè)用引物，其特征在于，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所 述靶基因?yàn)橹Z如病毒G II型的衣殼蛋白一GenBank登陸號(hào)X86557，所述引物與所述靶基 因的5095位一5319位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種對(duì)諾如病毒G II型特定基因片段具有特異性的引物組。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種諾如病毒G II型檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC
反向外引物B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT
正向內(nèi)引物FIP-G 11CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 反向內(nèi)引物 BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA
可以擴(kuò)增諾如病毒G II型的衣殼蛋白(X86557)基因序列的5095位-—5319位 的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈。
特別地，為了加快擴(kuò)增反應(yīng)速度，所述引物組還可以包括
正向環(huán)引物L(fēng)F-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
反向環(huán)引物L(fēng)B-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種利用上述引物或引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 法檢測(cè)諾如病毒G II型的檢測(cè)方法。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種諾如病毒G II型的檢測(cè)方法，該方法用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在諾如病毒G II 型，其特征在于，以諾如病毒G II型的衣殼蛋白(X86557)基因序列的5095位一5319位 的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈為靶，通過(guò)LAMP法用上述引物組選擇性擴(kuò)增上述靶區(qū)域， 確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體檢測(cè)方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、糞便、嘔吐物等病毒待 檢標(biāo)本；取糞便、腹瀉物用適量生理鹽水稀釋，離心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
2)諾如病毒G II型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)
取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應(yīng)體系，混勻點(diǎn)離后在約65°C條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80°C的 環(huán)境下2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積20ul IOOul)
3) LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)
A)肉眼檢測(cè)與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，未見(jiàn)渾濁為 陰性；或，
B)加染料后檢測(cè)每25ul體系的反應(yīng)管加1000 X SYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽(yáng)性，保持無(wú)色或棕色為陰性；或，
C)電泳檢測(cè)2_3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征 性梯狀條帶，最小片段在180bp左右，則結(jié)果為陽(yáng)性；如無(wú)任何條帶則結(jié)果為陰性。
特別地，為了加快擴(kuò)增反應(yīng)速度，所述擴(kuò)增反應(yīng)液還可以包括
正向環(huán)引物L(fēng)F-G II 0. 6-1. OuM
反向環(huán)引物L(fēng)B-G II 0. 6-1. OuM
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種利用上述引物或引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 法檢測(cè)諾如病毒G II型的檢測(cè)試劑盒。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種諾如病毒G II型檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有上述 引物或引物組的擴(kuò)增反應(yīng)液、酶。
所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包括如下試劑
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM ρΗ 8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
所述酶為包括，每微升含8個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶和每微升含20個(gè)活性單 位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
特別地，為了加快擴(kuò)增反應(yīng)速度，所述擴(kuò)增反應(yīng)液還可以包括
正向環(huán)引物L(fēng)F-G II 0. 6-1. OuM
反向環(huán)引物L(fēng)B-G II 0. 6-1. OuM
所述試劑盒還包括陰性及陽(yáng)性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板為雙蒸水；所述陽(yáng)性 對(duì)照模板為諾如病毒G II型基因組cDNA(l IOOnM)。
本發(fā)明通過(guò)提供一種對(duì)諾如病毒G II型特定基因片段具有特異性的引物組，及其 用包含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中是否存在諾如病毒G II型特定基因片段，進(jìn)而確 定標(biāo)本中是否存在諾如病毒G II型。本發(fā)明檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、 方便快捷、不需特殊儀器、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可解決食源性病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層 普及應(yīng)用難題；特別是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及戰(zhàn)時(shí)野外應(yīng)用。同時(shí)，與現(xiàn)有的PCR方法相比具有特異性 強(qiáng)、敏感性比PCR高或相當(dāng)、比PCR省時(shí)約2小時(shí)、不需特殊儀器(擴(kuò)增反應(yīng)在水浴鍋中即 可完成)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1本發(fā)明所述引物組合進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)后通過(guò)肉眼觀察的結(jié)果。圖 例1、陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果；2、陰性擴(kuò)增結(jié)果。
圖2本發(fā)明所述引物組合進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)后加入染料觀察的結(jié)果。圖 例1、陰性擴(kuò)增結(jié)果；2，3、陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。
圖3本發(fā)明所述引物組合進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)結(jié)果的電泳圖；
圖例1 =IOObp marker ；3-6 分別為諾如病毒G II病毒標(biāo)本；7_8 分別為輪狀病 毒A組G 1和G 3型毒株(標(biāo)準(zhǔn)毒株)對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體的諾如病毒G II型檢測(cè)過(guò)程來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例一對(duì)已知諾如病毒G II病毒標(biāo)本衣殼蛋白基因的擴(kuò)增
一)引物組的設(shè)計(jì)
通過(guò)查閱文獻(xiàn)和用BLAST軟件分析篩選出諾如病毒G II型特異性衣殼蛋白基 因的5095-—5319bp核酸序列，針對(duì)該片段的六個(gè)位點(diǎn)(這六個(gè)位點(diǎn)分別5095_5112bp、 5113-5130bp、5158-5178bp、5207-5228bp、5267-5286bp、5300-5319bp)設(shè)計(jì)出 LAMP 引物并 合成，得到如下的引物。引物設(shè)計(jì)通過(guò)LAMP專用引物設(shè)計(jì)軟件結(jié)合分子生物學(xué)分析軟件 Advance Vector NTI 完成。
序列編號(hào)1



正向外引物 F3-G II CGTCGAATGACGCCAACC 序列編號(hào)2
反向外引物 B3-G II CGCTCCACAGTATCTCACCT 序列編號(hào)3
正向內(nèi)引物 FIP-G II CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG 序列編號(hào)4 反向內(nèi)引物BIP-G II
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA 所述6個(gè)位點(diǎn)的序列分別為
5095-5112bp 5113-5130bp 5158-5178bp 5207-5228bp 5267-5286bp 5300-5319bp
cgtcgaatgacgccaacc catctgatgggtccgcag aggttatggctctggagcccg ggcgggccaacaaaacgtaatt tgga gagttcacagtgtccc aggtgagatactgtggagcg
其中，
所述正向外引物 F3 擴(kuò)增始于 5095-5112bp (cgtcgaatgacgccaacc)；
所述正向內(nèi)引物FIP 擴(kuò)增始于5158_5178bp (aggttatggctctggagcccg)的互補(bǔ)序 列和 5113_5130bp (catctgatgggtccgcag)；
所述反向外引物B3 擴(kuò)增始于5300_5319bp(aggtgagatactgtggagcg)的互補(bǔ)序 列；
反向內(nèi)引物 BIP 擴(kuò)增始于 5207-5228bp (ggcgggccaacaaaacgtaatt)和 5267-528 6bp (tggagagttcacagtgtccc)的互補(bǔ)序列。
上述引物組中各引物的共性在于 5095-—5319bp核酸序列互補(bǔ)。
二)本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)的毒株與各毒株的擴(kuò)增結(jié)果如下表一
表一(為了便于理解，本申請(qǐng)人將下列序號(hào)與圖1中編號(hào)設(shè)置成-
上述供試毒株部分為標(biāo)準(zhǔn)毒株，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；部分為檢測(cè)毒株 標(biāo)本(經(jīng)深圳太太基因熒光PCR試劑盒驗(yàn)證)由本申請(qǐng)人保存。“陰”表示無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，“陽(yáng)” 表示有擴(kuò)增反應(yīng)。
三)上述各毒株基因RNA的提取
取細(xì)胞培養(yǎng)上清液、糞便、腹瀉物用適量生理鹽水稀釋，離心取上清液用于RNA抽 提(QIAamp Viral RNA Mini Kit)。
四)基于LAMP法的基因擴(kuò)增
取擴(kuò)增反應(yīng)液14. 6ul，加2. Oul待檢模板，加Iul的聚合酶和0. 5ul的反轉(zhuǎn)錄酶， 再加6. 9ul ddH20,形成如下表總體積為25ul的反應(yīng)體系，在溫度為65°C的恒溫水浴鍋保 溫約90分鐘，然后置于80°C、2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡(jiǎn)化為擴(kuò)增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。
擴(kuò)增反應(yīng)液包含IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、3. 6mM硫酸鎂、 1.6uM正向內(nèi)引物FIP-G II、1.6uM反向內(nèi)引物BIP-G II、0. 2uM的正向外引物F3-G II、 0. 2uM 的反向外引物 B3-G II、1.4mM dNTP 和 IM 甜菜堿(betaine)；
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH 8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
酶每微升含8個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶和每微升含20個(gè)活性單位的AMV反
轉(zhuǎn)錄酶。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達(dá)預(yù)定 的反應(yīng)體積。
五)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，從dNTP析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中存在的鎂離子將 形成焦磷酸鎂沉淀。因此，只有在發(fā)生核酸擴(kuò)增的反應(yīng)液中才會(huì)出現(xiàn)白色渾濁。這樣可以 通過(guò)如下方式進(jìn)行判斷。
A)肉眼檢測(cè)與陰性對(duì)照管比較顯示，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯渾濁為陽(yáng)性，未見(jiàn)渾濁為 陰性；(參見(jiàn)圖1)或，
B)加染料后檢測(cè)每25ul體系的反應(yīng)管加1000 X SYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽(yáng)性，保持無(wú)色或棕色為陰性；(參 見(jiàn)圖2)或，
C)電泳檢測(cè)2_3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征 性梯狀條帶，最小片段在ISObp左右，則結(jié)果為陽(yáng)性；如無(wú)任何條帶則結(jié)果為陰性。(參見(jiàn) 圖3)
經(jīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，表明上述引物組只對(duì)諾如病毒G II型陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)照毒株未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，顯示了良好的特異性。
6)靈敏度比較
10[0100]以諾如病毒G II型陽(yáng)性標(biāo)本為檢測(cè)毒株，將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后做一系列 稀釋JO-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7,分別用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分別為 F3-G II、B3-G II)來(lái)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明LAMP反應(yīng)敏感性達(dá)10_4 ；PCR反應(yīng)敏感性達(dá)10_3 ； 結(jié)果顯示LAMP反應(yīng)敏感性比PCR反應(yīng)敏感10倍。
實(shí)施例二
本實(shí)施例與實(shí)施例一的區(qū)別在于，本實(shí)施例中，基于LAMP法的基因擴(kuò)增階段，為 了加快擴(kuò)增反應(yīng)速度，在所述擴(kuò)增反應(yīng)液還包括有
序列編號(hào)5
正向環(huán)引物L(fēng)F-G II TTATTGACCTCTGGGACGAGG
序列編號(hào)6 反向環(huán)引物 LB-G II GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG 此時(shí)
所述正向環(huán)引物 LF-G II 擴(kuò)增始于 5135_5155bp(cctcgtcccagaggtcaataa)的互
所述反向環(huán)引物L(fēng)B-G II 擴(kuò)增始于5242-5265bp
補(bǔ)序列；
(gaaacaattttgtacaagcccctg)
此時(shí)反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
在加入上述正向環(huán)引物L(fēng)F-G II和反向環(huán)引物L(fēng)B-G II后只需在溫度為65°C的恒 溫水浴鍋保溫約60分鐘，然后置于80°C、2分鐘滅活酶。
實(shí)施例三
本實(shí)施例與實(shí)施例二的區(qū)別在于，本實(shí)施例中，基于LAMP法的基因擴(kuò)增使用的反 應(yīng)體系為
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)[0118]
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡(jiǎn)化為擴(kuò)增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。
擴(kuò)增反應(yīng)液包含10 XBstDNAPolymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、2mM硫酸鎂、1. OuM 正向內(nèi)引物FIP-G II、LOuM反向內(nèi)引物BIP-G II、0. 15uM的正向外引物F3-G II、0. 15uM 的反向外引物B3-G IIU. OmM dNTP、0. 6uM正向環(huán)引物L(fēng)F-G II、0. 6uM反向環(huán)引物L(fēng)B-G II 和 0. 8M 甜菜堿(betaine)；其中 IOXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM PH 8. 8的三羥基甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸 鎂和曲拉通X-100 ；
酶每微升含8個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶和每微升含20個(gè)活性單位的AMV反
轉(zhuǎn)錄酶。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達(dá)預(yù)定 的反應(yīng)體積。
反應(yīng)條件在溫度為60°C的恒溫水浴鍋保溫約75分鐘，然后升溫至80°C、2分鐘 滅活酶。
實(shí)施例四
本實(shí)施例與實(shí)施例二的區(qū)別在于，本實(shí)施例中，基于LAMP法的基因擴(kuò)增使用的反 應(yīng)體系為
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡(jiǎn)化為擴(kuò)增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)液 A 包含IOXBst DNAPolymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、6mM硫酸鎂、2. OuM正向內(nèi)引物FIP-G II、2. OuM反向內(nèi)引物BIP-G 11,0. 3uM的正向外引物F3-G 11,0. 3uM的反向外引物B3-G II、1.6mM dNTP、l. OuM正向環(huán)引物L(fēng)F-G II、1. OuM反向環(huán)引物L(fēng)B-G II和1.5M甜菜堿 (betaine)。
其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH 8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl) UOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100。
酶每微升含16個(gè)活性單位的Bst DNA聚合酶和每微升含20個(gè)活性單位的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達(dá)預(yù)定 的反應(yīng)體積。
反應(yīng)條件在溫度為65°C的恒溫水浴鍋保溫約60分鐘，然后置于80°C、2分鐘滅活酶。
實(shí)施例五從腹瀉物中分離的毒株的檢測(cè)
毒株基因DNA的提取及擴(kuò)增、檢測(cè)
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、糞便、嘔吐物等病毒待 檢標(biāo)本；取糞便、腹瀉物用適量生理鹽水稀釋，離心取上清液用于RNA抽提(QIAamp Viral RNAMini Kit)；
對(duì)上述提取的RNA與實(shí)施例一同樣的通過(guò)LAMP法進(jìn)行核酸擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的 進(jìn)行檢測(cè)及酶切鑒定。擴(kuò)增結(jié)果與陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定結(jié)果之比較，如下表二。
基于陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定
將LAMP檢測(cè)為陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定靶基因序列上含限制性內(nèi)切酶Hae III位點(diǎn)，位于5211-5214bp，用Hae III來(lái)酶切LAMP陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示酶切片斷有 3個(gè)，分別為155bp、121bp、90bp大小，與理論預(yù)測(cè)值相符(參見(jiàn)電泳圖3第2道)，因而確 定陽(yáng)性擴(kuò)增為特異性擴(kuò)增。
如表二所示，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定符合理論預(yù)測(cè)片段大小及片段數(shù)，只有檢 測(cè)標(biāo)本的LAMP特異性擴(kuò)增才觀察到上述結(jié)果。
序列表
<110>珠海市疾病預(yù)防控制中心
<120>諾如病毒G II型檢測(cè)用引物、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒
<160>7
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>1
CGTCGAATGACGCCAACC18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>2
CGCTCCACAGTATCTCACCT20
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物[0167]<400>3
CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG39
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>4
GGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA 42
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>5
TTATTGACCTCTGGGACGAGG21
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<5320〉
<223> 引物
<400>6
GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG24
<210>7
<211>225
<212>RNA
<213>諾如病毒6 11型
<400>7
5095 cgtcga
5101 atgacgccaa cccatctgat gggtccgcag ccaacctcgt cccagaggtc
aataatgagg
5161 ttatggctct ggagcccgtt gttggtgccg ctattgcggc acctgtggcg
ggccaacaaa
5221 acgtaattga cccctggatt agaaacaatt ttgtacaagc ccctggtgga
gagttcacag
5281 tgtcccctag aaacgctcca ggtgagatac tgtggagcg
權(quán)利要求
一種諾如病毒GII型檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物F3 GII CGTCGAATG ACGCCAACC反向外引物B3 GII CGCTCCACA GTATCTCACCT正向內(nèi)引物FIP GII CGGGCTCCAGAGCCATAACCTCATCTGATGGGTCCGCAG反向內(nèi)引物BIP GIIGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGGGACACTGTGAACTCTCCA。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種諾如病毒GII型檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物 組還包括正向環(huán)引物 LF-GII TTATTGACCTCTGGGACGAGG 反向環(huán)引物 LB-GII GAAACAATTTTGTACAAGCCCCTG。
3.—種諾如病毒GII型檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要 求1中所述的引物組的擴(kuò)增反應(yīng)液、酶；所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包括如下試劑 其中IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8. 8的三羥基甲硫 氨酸甲烷-鹽酸、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述酶包括每微升含8個(gè)活性單位、終濃度0. 16-0. 64U/ul的Bst DNA聚合酶和每微 升含20個(gè)活性單位、終濃度0. 4U/ul的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的一種諾如病毒GII型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng) 液還包括正向環(huán)引物L(fēng)F-GII 0.6-1. OuM反向環(huán)引物 LB-GII 0.6-1. OuM。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的一種諾如病毒GII型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng) 液，包含1/10預(yù)定反應(yīng)體積的IOXBst DNA PolymeraseBuffer反應(yīng)緩沖液、3. 6mM硫酸鎂、 1. 6uM正向內(nèi)引物FIP-GIIU. 6uM反向內(nèi)引物BIP_GII、0. 2uM的正向外引物F3_GII、0. 2uM 的反向外引物B3-GII、0. 8uM正向環(huán)引物L(fēng)F-GI 1,0. 8uM反向環(huán)引物L(fēng)B-GIIU. 4mMdNTP和 IM甜菜堿；所述酶每微升含8個(gè)活性單位、終濃度0. 32U/ul的Bst DNA聚合酶和每微升含20個(gè) 活性單位、終濃度0. 4U/ul的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的一種諾如病毒GII型檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 還包括陰性及陽(yáng)性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板為雙蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照模板為1 IOOnM 諾如病毒GII型基因組cDNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測(cè)技術(shù)。一種諾如病毒GII型檢測(cè)用引物，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因?yàn)橹Z如病毒GII型的衣殼蛋白---GenBank登陸號(hào)X86557，所述引物與所述靶基因的5095位---5319位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明通過(guò)提供一種對(duì)諾如病毒GII型特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中是否存在諾如病毒GII型特定基因片段，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在諾如病毒GII型。
文檔編號(hào)C12N15/11GKCN101153341 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710030430
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛(ài)軍, 魏泉德 申請(qǐng)人:珠海市疾病預(yù)防控制中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (3),