專利名稱:志賀氏菌檢測(cè)用引物、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測(cè)技術(shù)。特別涉及對(duì)志賀氏 菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增法檢測(cè)志賀氏菌的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發(fā)病 率在我國(guó)食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
目前對(duì)食源性病原體的檢測(cè)主要依靠病原體分離法、免疫學(xué)方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)，一般需要5天時(shí)間，最長(zhǎng)需要一個(gè)月時(shí)間，而且 免疫學(xué)方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的診斷。例如PCR中 國(guó)專利公開號(hào)CN1526825的專利申請(qǐng)，批露了一種利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特異性， 通過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳觀察等分子生物學(xué)手段檢測(cè)副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準(zhǔn)確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測(cè)費(fèi)用以及對(duì)檢測(cè)人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層普及應(yīng)用。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國(guó)際 專利公開號(hào)WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，即針對(duì)靶基因 的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對(duì))，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)， 擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過(guò)肉眼進(jìn)行判斷或者對(duì)其濁度進(jìn)行檢測(cè)，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，通過(guò)肉眼進(jìn)行判定。用于LAMP技術(shù)擴(kuò) 增的2對(duì)引物乃針對(duì)基因6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。但是目前未有利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增法檢測(cè)志賀氏菌的檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種對(duì)志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種志賀氏菌檢測(cè)用引物，其特征在于，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所 述靶基因?yàn)橹举R氏菌的ipaH-—GenBank登陸號(hào)M32063，所述引物與所述靶基因的 1095-—1299bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種對(duì)志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物組。[0010]上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種志賀氏菌檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
正向內(nèi)引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
反向內(nèi)引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
可以擴(kuò)增志賀氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095-—1299bp位的核酸序列的 一部分或其互補(bǔ)鏈。
特別地，為了加快擴(kuò)增反應(yīng)速度，所述引物組還可以包括
正向環(huán)引物L(fēng)F-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
反向環(huán)引物L(fēng)B-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種利用上述引物或引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 法檢測(cè)志賀氏菌的檢測(cè)方法。
上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種志賀氏菌的檢測(cè)方法，該方法用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在志賀氏菌，其特征在 于，以志賀氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互 補(bǔ)鏈為靶，通過(guò)LAMP法用上述引物或引物組選擇性擴(kuò)增上述靶區(qū)域，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體檢測(cè)方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標(biāo)本；細(xì)菌待 檢標(biāo)本用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄 其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul 上清液做待檢模板DNA;2)志賀氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)
取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應(yīng)體系，混勻點(diǎn)離后在約65°C條件下恒溫保溫約40-90分鐘，然后置于80°C的 環(huán)境下2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積20ul IOOul)
權(quán)利要求
一種志賀氏菌檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物F3 ipa ATACCGTCTCTGCACGCA反向外引物B3 ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC正向內(nèi)引物FIP ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT反向內(nèi)引物BIP ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT可以擴(kuò)增志賀氏菌的ipaH基因 GenBank登陸號(hào)M32063，1095 1299bp位的特異性核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的志賀氏菌檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組還包括正向環(huán)引物 LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT反向環(huán)引物 LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG。
3.—種志賀氏菌的檢測(cè)方法，該方法用于檢測(cè)食品樣品中是否存在志賀氏菌，其特征 在于，以志賀氏菌的ipaH基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈為 靶，通過(guò)LAMP方法用權(quán)利要求
1或2所述引物組選擇性擴(kuò)增所述靶基因，確認(rèn)是否存在有 擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的志賀氏菌檢測(cè)方法，其特征在于，具體檢測(cè)方法為1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標(biāo)本；細(xì)菌待檢標(biāo)本用相應(yīng)腸道增 菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA 提取試劑盒提取模板DNA或加20 30 μ 1三蒸水煮沸5分鐘，再取2 μ 1上清液做待檢模 板 DNA ；2)志賀氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20 μ 1 100 μ 1的反應(yīng)體系，混勻點(diǎn)離后在約65°C條件下恒溫保溫約40-90分鐘，然后置于80°C的 環(huán)境下2分鐘滅活酶；反應(yīng)總體積20 μ 1 100 μ 1的反應(yīng)體系為
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的志賀氏菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)液還包括 正向環(huán)引物L(fēng)F-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向環(huán)引物 LB-ipa 0. 6-1. 0 μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的志賀氏菌檢測(cè)方法，其特征在于，當(dāng)反應(yīng)總體積為25μ 1時(shí)， 所述反應(yīng)體系具體為
7. —種志賀氏菌檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要求
1或2 所述引物組的擴(kuò)增反應(yīng)液、酶；所述擴(kuò)增反應(yīng)液中包括如下試劑
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的一種志賀氏菌檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)液 還包括正向環(huán)引物L(fēng)F-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向環(huán)引物 LB-ipa 0.6-1.0 μ Μ。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的一種志賀氏菌檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)液包含 1/10預(yù)定反應(yīng)體積IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、3· 6福硫酸鎂、1. 6 μ M正 向內(nèi)引物FIP-ipa、l. 6 μ M反向內(nèi)引物BIP_ipa、0. 2 μ M的正向外引物F3-ipa、0. 2 μ M的反 向外引物B3-ipa.0.8uM正向環(huán)引物L(fēng)F-opa、0.8uM反向環(huán)引物L(fēng)B-ipa.I. 4mM dNTP禾口 IM 甜菜堿；所述酶為每微升含8個(gè)活性單位，0. 32U/ μ 1的Bst DNA酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的志賀氏菌檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰 性及陽(yáng)性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板為雙蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照模板為1 100mM志賀氏菌 基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測(cè)技術(shù)。一種志賀氏菌檢測(cè)用引物，能擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因?yàn)橹举R氏菌的ipaH---GenBank登陸號(hào)M32063，所述引物與所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明通過(guò)提供一種對(duì)志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中是否存在志賀氏菌特定基因片段，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在志賀氏菌。
文檔編號(hào)C12Q1/04GKCN101153326 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710030435
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛(ài)軍, 魏泉德 申請(qǐng)人:珠海市疾病預(yù)防控制中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),