專利名稱:沙門氏菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。特別涉及對沙門氏 菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導等溫擴 增法檢測沙門氏菌的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發(fā)病 率在我國食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。
目前對食源性病原體的檢測主要依靠病原體分離法、免疫學方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標準，但繁瑣費時，一般需要5天時間，最長需要一個月時間，而且 免疫學方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細菌的診斷。例如PCR中 國專利公開號CN1526825的專利申請，批露了一種利用副溶血性弧菌TO72H序列的特異性， 通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察等分子生物學手段檢測副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應(yīng)用。
環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國際 專利公開號W0 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出一種核酸擴增新技術(shù)，即針對靶基因 的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對)，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)， 擴增結(jié)果可直接對擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進行判斷或者對其濁度進行檢測，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，通過肉眼進行判定。用于LAMP技術(shù)擴 增的2對引物乃針對基因6個區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時間內(nèi)擴增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點。但是目前未有利用環(huán)介導等溫擴 增法檢測沙門氏菌的檢測方法和檢測試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對沙門氏菌特定基因片段具有特異性的引物。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種沙門氏菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述 靶基因為沙門氏菌的invA—GenBank登陸號DQ644633，所述引物與所述靶基因的 382—580bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種對沙門氏菌特定基因片段具有特異性的引物組。[0010]上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種沙門氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-inv GAACGTGTCGCGGAAGTC
反向外引物B3-inv CGGCAATAGCGTCACCTT
正向內(nèi)引物FIP-inv GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG
反向內(nèi)引物BIP-inv GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA
可以擴增沙門氏菌的invA(DQ644633)基因序列的382-—580bp位的核酸序列的 一部分或其互補鏈。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物或引物組基于環(huán)介導等溫擴增 法檢測沙門氏菌的檢測方法。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種沙門氏菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在沙門氏菌，其特征在 于，以沙門氏菌的invA(DQ644633)基因序列的382-—580bp位的核酸序列的一部分或其互 補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物或引物組選擇性擴增上述靶區(qū)域，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
具體檢測方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待 檢標本用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. 0ml增菌液lOOOOrpm離心2分鐘，棄 其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul 上清液做待檢模板DNA;
2)沙門氏菌的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)
取擴增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul lOOul的反應(yīng)體系，混勻點離后在約65°C條件下恒溫保溫約60分鐘，然后置于80°C的環(huán)境 下2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積20ul 100ul)
3) LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測
A)肉眼檢測與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為 陰性；或，
B)加染料后檢測每25ul體系的反應(yīng)管加1000XSYBR Green I (Invitrogen) l_2ul，1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；或，
C)電泳檢測2_3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征 性梯狀條帶，最小片段在130bp左右，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶則結(jié)果為陰性。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物組基于環(huán)介導等溫擴增法檢測 沙門氏菌的檢測試劑盒。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種沙門氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有上述引物組 的擴增反應(yīng)液、酶。
所述擴增反應(yīng)液中包括如下試劑
其中 lOXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
所述酶為每微升含8-16個活性單位的Bst DNA酶。
所述試劑盒還包括陰性及陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水；所述陽性 對照模板為腸炎沙門菌基因組DNA(1 lOOnM)。
本發(fā)明通過提供一種對沙門氏菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含 有上述引物組的試劑盒檢測標本中是否存在沙門氏菌特定基因片段，進而確定標本中是否存在沙門氏菌。本發(fā)明檢測試劑和檢測方法具有敏感性高、特異性強、方便快捷、不需特殊 儀器、適用范圍廣等優(yōu)點，可解決食源性病原體的現(xiàn)場快速檢測和基層普及應(yīng)用難題；特別 是現(xiàn)場檢測及戰(zhàn)時野外應(yīng)用。同時，與現(xiàn)有的PCR方法相比具有特異性強、敏感性比PCR高 或相當、比PCR省時約2小時、不需特殊儀器(擴增反應(yīng)在水浴鍋中即可完成)等優(yōu)點。
圖1本發(fā)明所述引物組合進行環(huán)介導等溫擴增(LAMP)后可通過肉眼觀察的結(jié)果。 圖例1、陽性擴增結(jié)果；2、陰性擴增結(jié)果。
圖2本發(fā)明所述引物組合進行環(huán)介導等溫擴增(LAMP)后加入染料觀察的結(jié)果。圖 例1、陰性擴增結(jié)果；2，3、陽性擴增結(jié)果。
圖3本發(fā)明所述引物組合進行環(huán)介導等溫擴增(LAMP)結(jié)果的電泳圖。圖中，1 lOObp marker ；2、3 腸炎沙門氏菌；4 鼠傷寒沙門氏菌；5 傷寒沙門氏菌；6-14 分別為金 黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素A菌株、金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素B菌株、金黃色 葡萄球菌產(chǎn)腸毒素C菌株、痢疾志賀氏桿菌、大腸桿菌0157:H7、變形桿菌、副溶血弧菌、霍 亂弧菌，上述細菌均為標準菌株。
具體實施方式
下面通過具體的沙門氏菌檢測過程來對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于這 些實施例。
實施例一對已知菌株的invA基因的擴增
一)引物組的設(shè)計
通過查閱文獻和用BLAST軟件分析篩選出沙門氏菌特異性基因inV的 382-—580bp核酸序列，針對該片段的六個位點(這六個位點分別382-399bp ；471_490bp ； 414-431bp ；563-580bp ；493_512bp ；534_552bp。)設(shè)計出 LAMP 引物并合成，得到如下的引 物；引物設(shè)計通過LAMP專用引物設(shè)計軟件結(jié)合分子生物學分析軟件Advance Vector NTI
完成。[0046]序列編號1[0047]正向外引物F3-invGAACGTGTCGCGGAAGTC[0048]序列編號2[0049]反向外引物B3-invCGGCAATAGCGTCACCTT[0050]序列編號3[0051]正向內(nèi)引物FIP-invGCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG[0052]序列編號4[0053]反向內(nèi)引物BIP-invGAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA[0054]所述6個位點的序列分別為[0055]382~399bp gaacgtgtcgcggaagtc[0056]414-431bp tctggatggtatgcccgg[0057]471-490bp tattgatgcggatgccgcgc[0058]493-512bp gaacggcgaagcgtactgga
8[0059]534-552bp ttcctttgacggtgcgatg
563-580bp aaggtgacgctattgccg
其中，
所述正向外引物F3 擴增始于 382_399bp (gaacgtgtcgcggaagtc)；
所述正向內(nèi)引物FIP 擴增始于471_490bp的互補序列(gcgcggcatccgcatcaata) 和 414_431bp(tctggatggtatgcccgg)；
所述反向外引物B3 擴增始于563_580bp互補序列(cggcaatagcgtcacctt)；
反向內(nèi)引物 BIP 擴增始于 493-512bp (gaacggcgaagcgtactgga)和 534_552bp 互 補序列(catcgcaccgtcaaaggaa)。
上述引物組中各引物的共性在于與沙門氏菌特異性基因invA的382—580bp核 酸序列互補。
二)本實施例實驗的菌株與各菌株的擴增結(jié)果如下表一
表一(為了便于理解，本申請人將下列序號與圖1中編號設(shè)置成一致)
上述供試菌株均為標準菌株，購自中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心?！瓣?，，表示 無擴增反應(yīng)，“陽”表示有擴增反應(yīng)。
三)上述各菌株基因DNA的提取
細菌待檢標本(除金黃色葡萄球菌以外)用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時 后，取1. 0ml增菌液lOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA提取試劑盒(如TIANamp Bacteria DNA Kit)提取模板DNA或加30ul三蒸水煮沸5分鐘，直接取2ul上清液作模板 DNA ；金黃色葡萄球菌標本需用腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后用基因組DNA提取試劑盒 (TIANampBacteria DNA Kit)提取 DNA。
四)基于LAMP法的基因擴增
取擴增反應(yīng)液14. 6ul，加2. Oul待檢模板，加lul酶，再加7. 4ul ddH20，形成如下 表總體積為25ul的反應(yīng)體系，在溫度為65°C的恒溫水浴鍋保溫約60分鐘，然后置于80°C、 2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡化為擴增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。
擴增反應(yīng)液包含1/10預定反應(yīng)體積的lOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、3. 6mM硫酸鎂、1. 6uM正向內(nèi)引物FIP_inv、l. 6uM反向內(nèi)引物BIP_inv、0. 2uM的正向 外引物 F3-inv、0. 2uM 的反向外引物 B3-inv、l. 4mM dNTP 和 1M 甜菜堿(betaine)；
其中l(wèi)OXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)、100mM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含8個活性單位)。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達預定 的反應(yīng)體積。
五)擴增產(chǎn)物的檢測
隨著擴增反應(yīng)的進行，從dNTP析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中存在的鎂離子將 形成焦磷酸鎂沉淀。因此，只有在發(fā)生核酸擴增的反應(yīng)液中才會出現(xiàn)白色渾濁。這樣可以 通過如下方式進行判斷。
A)肉眼檢測與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為 陰性；(參見圖1)或，
B)加染料后檢測每25ul體系的反應(yīng)管加1000XSYBR Green I (Invitrogen) l_2ul，1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；(參 見圖2)或，
C)電泳檢測2_3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征 性梯狀條帶，最小片段在130bp左右，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶則結(jié)果為陰性。(參見 圖3)
經(jīng)對擴增產(chǎn)物的檢測，表明上述引物組對傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌 出現(xiàn)LAMP擴增反應(yīng)，對照菌未出現(xiàn)擴增反應(yīng)，顯示了良好的特異性。
6)靈敏度比較
以腸炎沙門菌作為檢測菌，將lX106CFU/mL的菌液做一系列稀釋106、105、104、 lO3、^)2、^)1、^)。，分別用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分別為F3-inv、B3-inv)來檢 測，檢測結(jié)果表明LAMP反應(yīng)敏感性達10°CFU/mL ；PCR反應(yīng)敏感性達lOtFU/mL ；結(jié)果顯示 LAMP反應(yīng)敏感性比PCR反應(yīng)敏感10倍。
實施例二
本實施例與實施例一的區(qū)別在于，本實施例中，基于LAMP法的基因擴增使用的反 應(yīng)體系為
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
11
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡化為擴增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。
擴增反應(yīng)液包含1/10預定反應(yīng)體積的lOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩 沖液、2mM硫酸鎂、1. OuM正向內(nèi)引物FIP-inv、l. OuM反向內(nèi)引物BIP_inv、0. 15uM的正向夕卜 引物 F3-inv、0. 15uM 的反向外引物 B3-inv、1.0mM dNTP 和 0. 8M 甜菜堿(betaine)；
其中l(wèi)OXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含8個活性單位)。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達預定 的反應(yīng)體積。
實施例三
本實施例與實施例一的區(qū)別在于，本實施例中，基于LAMP法的基因擴增使用的反 應(yīng)體系為
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為25ul)
除核酸模板外，上述反應(yīng)體系可以簡化為擴增反應(yīng)液，酶和雙蒸水。
擴增反應(yīng)液A 包含1/10預定反應(yīng)體積的lOXBst DNA PolymeraseBuffer反應(yīng) 緩沖液、6mM硫酸鎂、2. OuM正向內(nèi)引物FIP-inv、2. OuM反向內(nèi)引物BIP_inv、0. 3uM的正向 外引物 F3-inv、0. 3uM 的反向外引物 B3-inv、l. 6mM dNTP 禾P 1.5M 甜菜堿(betaine)；
其中l(wèi)OXBst DNA Polymerase Buffer 反應(yīng)緩沖液含有 200mM pH8. 8 的三羥基 甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；
酶Bst DNA聚合酶(每微升含16個活性單位、終濃度0. 64U/ul)。
雙蒸水的加入原則是，在其他試劑的量確定后，加入雙蒸水使反應(yīng)體積到達預定 的反應(yīng)體積。
實施例四
本實施例與實施例一的區(qū)別在于，本實施例中，基于LAMP法的基因擴增使用的反 應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為lOOul)
實施例五
本實施例與實施例一的區(qū)別在于，本實施例中，基于LAMP法的基因擴增使用的反
應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積為20ul)
實施例六從嘔吐物中分離的菌株的檢測
菌株基因DNA的提取及擴增、檢測
取食物中毒者嘔吐物25g，用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液lOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，加30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液。另 用前述腸道增菌培養(yǎng)液接種分離培養(yǎng)平板，菌落用生物_梅里埃GNI+卡及VITEC 32全自 動微生物分析儀進行分離株的鑒定。
對上述提取的基因DNA與實施例一同樣的通過LAMP法進行核酸擴增和擴增產(chǎn)物 的檢測。擴增結(jié)果與VITEC鑒定結(jié)果比對，如下表二。
如表二所示，鑒定結(jié)果表明分離的菌株含有沙門氏菌和糞大腸桿菌，基于VITEC 32全自動微生物分析儀的鑒定結(jié)果與使用引物組擴增的結(jié)果一致，只有在鑒定為沙門氏菌 的標本中觀察到上述引物組產(chǎn)生的擴增。
0120]序列表0121]<110>珠海市疾病預防控制中心0122]<120>沙門氏菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒0123]<160>50124]<210>10125]<211>180126]<212>DNA0127]<213>人工序列0128]<220>0129]<223>引物0130]<400>10131]GAACGTGTCGCGGAAGTC 180132]<210>20133]<211>180134]<212>DNA0135]<213>人工序列0136]<220>0137]<223>引物0138]<400>20139]CGGCAATAGCGTCACCTT 180140]<210>30141]<211>380142]<212>DNA0143]<213>人工序列
0144]<220>
0145]<223> 引物
0146]<400>3
0147]GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG 38
0148]<210>4
0149]<211>39
0150]<212>DNA
0151]<213>人工序列
0152]<220>
0153]<223> 引物
0154]<400>4
0155]GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA 39
0156]<210>5
0157]<211>199
0158]<212>DNA
0159]<213>沙門氏菌
0160]<400>5
0161]382 gaacgtgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat
0162]421 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg
0163]481 gatgccgcgc gcgaacggcg aagcgtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt
0164]541 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg
權(quán)利要求
一種沙門氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物F3-inv GAACGTGTCGCGGAAGTC反向外引物B3-inv CGGCAATAGCGTCACCTT正向內(nèi)引物FIP-inv GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG反向內(nèi)引物BIP-inv GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA可以擴增沙門氏菌invA基因---GenBank登錄號DQ644633，382---580bp位的特異性核酸序列。
2.一種沙門氏菌的檢測方法，該方法用于檢測食品中是否存在沙門氏菌，其特征在于， 以沙門氏菌的invA-—GenBank登錄號DQ644633基因序列的382-—580bp位的核酸序列 的一部分或其互補鏈為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求
1所述引物組選擇性擴增所述靶基因， 確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的沙門氏菌的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法具體為1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標本；細菌待檢標本用相應(yīng)腸道增 菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. 0ml增菌液lOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA 提取試劑盒提取模板DNA或加20 30 yl三蒸水煮沸5分鐘，再取2 yl上清液做待檢模 板 DNA ；2)沙門氏菌的環(huán)介導等溫擴增取擴增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20iU 100 yl的反應(yīng)體系，混勻點離后在約65°C條件下恒溫保溫約60分鐘，然后置于80°C的環(huán)境 下2分鐘滅活酶； 其中l(wèi)OXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8. 8的三羥基甲硫 氨酸甲烷-鹽酸、lOOmM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ； 所述酶為每微升含8-16個活性單位的Bst DNA酶；3) LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測A)肉眼檢測與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；或，B)加染料后檢測每25ill體系的反應(yīng)管加1000XSYBR Green I Invitrogenl-2 u 1, 1-5分鐘觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；或，C)電泳檢測2-3%瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征性梯 狀條帶,最小片段在130bp左右，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶則結(jié)果為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的沙門氏菌的檢測方法，其特征在于，當反應(yīng)總體積為25 yl 時，所述反應(yīng)體系具體為
5. 一種沙門氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要求
1所 述的引物組的擴增反應(yīng)液、酶；所述擴增反應(yīng)液中包括如下試劑 其中l(wèi)OXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8. 8的三羥基甲硫 氨酸甲烷-鹽酸、lOOmM氯化鉀、lOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ； 所述酶為每微升含8-16個活性單位、終濃度0. 16-0. 64U/ u 1的Bst DNA酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的沙門氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述擴增反應(yīng)液包含lOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、3. 6mM硫酸鎂、 1.6iiM正向內(nèi)引物FIP-inv、1.6iiM反向內(nèi)引物BIP_inv、0. 2 y M的正向外引物F3_inv、 0. 2iiM的反向外引物B3-inv、1.4mM dNTP禾口 1M甜菜堿；所述酶為每微升含8個活性單位，終濃度0. 32U/ u 1的Bst DNA酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5或6所述的沙門氏菌檢測用試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括 陰性及陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水；所述陽性對照模板為腸炎沙門菌基因 組 DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。一種沙門氏菌檢測用引物，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為沙門氏菌的invA---GenBank登陸號DQ644633，所述引物與所述靶基因的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。本發(fā)明通過提供一種對沙門氏菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測標本中是否存在沙門氏菌特定基因片段，進而確定標本中是否存在沙門氏菌。
文檔編號C12Q1/04GKCN101153327 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710030437
公開日2010年11月3日 申請日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛軍, 魏泉德 申請人:珠海市疾病預防控制中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),