專利名稱:觀察細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的組織芯片和細(xì)胞系芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，涉及一種高通量檢測與分析不同細(xì)胞(如各種正常與疾病組織細(xì)胞)中信號傳導(dǎo)通路的組織與細(xì)胞(系)芯片。
背景技術(shù)：
人基因組學(xué)研究目前是國際上的熱點。隨著研究的進(jìn)展，人們迫切發(fā)現(xiàn)在各種惡性腫瘤組織及細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路的變化并確定人類新基因和已知序列的基因，以及各種基因在各種細(xì)胞通路中所起的作用。
除人染色體DNA大規(guī)模測序，表達(dá)序列測序(EST)蛋白質(zhì)組的方法外，還缺少一種高通量檢測細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路改變的方法?，F(xiàn)有的基因芯片也只是將DNA固定在基片上，形成微陣列，無法直接原位檢測某一細(xì)胞中一種或多種基因的表達(dá)變化情況。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的技術(shù)，以便能高通量地細(xì)胞原位檢測一種或多種基因表達(dá)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種可高通量地細(xì)胞原位檢測一種或多種基因表達(dá)變化的芯片。
本發(fā)明的另一目的是提供所述芯片的制備方法和用途。
在第一方面，本發(fā)明提供了一種組織-細(xì)胞系芯片，它包括(a)一個基片；(b)位于所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，并且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細(xì)胞，且切片上有2種以上的組織/細(xì)胞。
在一優(yōu)選例中，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計。
在另一優(yōu)選例中，所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方厘米。
在另一優(yōu)選例中，所述的組織/細(xì)胞選自正常細(xì)胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養(yǎng)的細(xì)胞系、傳代細(xì)胞和/或原代細(xì)胞、體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細(xì)胞系。
在另一優(yōu)選例中，所述的基片選自載玻片和塑料基片。
在第二方面，本發(fā)明提供了一種組織-細(xì)胞系芯片的制備方法，它包括步驟(a)提供一空白石蠟塊，所述的石蠟塊具有4-1000個點樣孔，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計；(b)在步驟(a)中的石蠟塊的點樣孔中推入組織/細(xì)胞樣品，所述組織/細(xì)胞的種類為2種以上；(c)從步驟(b)中的石蠟塊切取1-20微米的石蠟切片；(d)將步驟(c)中的石蠟切片置于基片之上，形成組織-細(xì)胞系芯片。
在一優(yōu)選例中，步驟(b)中，所述的組織/細(xì)胞樣品選自(i)固定和石蠟包埋的正常組織、腫瘤組織和/或癌旁組織；(ii)石蠟包埋裸鼠皮下移植瘤組織；(iii)固定和石蠟包埋的細(xì)胞系。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，用點陣儀供體穿刺針從包埋有組織/細(xì)胞樣品的石蠟?zāi)笁K的定位處穿取組織/細(xì)胞，推入石蠟塊的點樣孔中，所述的穿刺針的直徑與點樣孔的直徑相符；且步驟(d)的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的組織-細(xì)胞系芯片的用途，它們被用于觀察細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測、免疫熒光分析、原位PCR、篩選藥物或藥靶。
在第四方面，本發(fā)明還提供了一種檢測不同細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路中基因表達(dá)狀態(tài)和/或磷酸化狀態(tài)差異的方法，它包括以下步驟(i)提供第一和第二組織/細(xì)胞系芯片，所述的芯片包括(a)一個基片；
(b)位于所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，并且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細(xì)胞，且切片上有2種以上的組織/細(xì)胞；且第一和第二組織/細(xì)胞系芯片上的石蠟切片為相鄰的連續(xù)切片；(ii)在第一組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因磷酸化蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析，并且在第二組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的總蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細(xì)胞系芯片之間的免疫組化檢測結(jié)果。
在一優(yōu)選例中，所述的不同細(xì)胞是病理組織的細(xì)胞和正常細(xì)胞。更佳地所述的不同細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞、癌旁組織的細(xì)胞以及正常細(xì)胞。



圖1顯示了本發(fā)明的癌組織-細(xì)胞系芯片。
圖2顯示了本發(fā)明的癌組織-細(xì)胞系芯片的免疫組化切片照片，其中從上至下分別為用HE染色的組織-細(xì)胞系芯片、用phospho-Akt-1抗體處理的組織-細(xì)胞系芯片、和用Akt1/2總蛋白抗體處理的組織-細(xì)胞系芯片。
圖3顯示了本發(fā)明的癌組織-細(xì)胞系芯片的檢測結(jié)果。
具體實施方式
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，開發(fā)了制備組織-細(xì)胞系芯片的新工藝，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
可用于本發(fā)明的組織/細(xì)胞沒有特別限制。代表性的例子包括正常細(xì)胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養(yǎng)的細(xì)胞系、傳代細(xì)胞和/或原代細(xì)胞、體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細(xì)胞系。
用于本發(fā)明的基片沒有特別限制，可以選用基因芯片領(lǐng)域常用的各種基片，例如載玻片、塑料基片。較佳地，基片是透明的、無色的。選用塑料基片時，塑料應(yīng)不受有機(jī)溶劑腐蝕。一種特別優(yōu)選的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
在本發(fā)明的芯片中，點樣孔的大小、間距和或點樣密度沒有特別限制。通常取決于所選用的細(xì)胞類型、石蠟類型以及穿刺針等因素。一般，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米或更大，較佳地為0.3-1.0毫米。所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米或更大，較佳地為0.3-4毫米，更佳地為0.4-3毫米，按點樣孔中心之間的距離計。而所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方厘米。
至于本發(fā)明芯片上的點樣孔的數(shù)目，通常為4-10000個點樣孔或更多。點樣孔的數(shù)目一方面取決于點樣密度，另一方面也取決于基片的大小。當(dāng)點樣孔較多時，可以選用表面積較大的基片。
在本發(fā)明中，固定在所述點樣孔的組織/細(xì)胞種類沒有特別限制，通常為2種至1000種細(xì)胞類型或更多。一種優(yōu)選的情況是正常細(xì)胞、腫瘤組織、癌旁組織、各種細(xì)胞系。
用于本發(fā)明芯片的石蠟芯片的厚度沒有特別限制，通常為1-20微米，較佳地為2-15微米，更佳地為3-10微米。
在本發(fā)明中所用的組織/細(xì)胞固定技術(shù)、石蠟包埋技術(shù)、以及切片技術(shù)沒有特別限制，可以選用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
優(yōu)選制備組織/細(xì)胞系樣品的方法包括(1)對于正常組織，腫瘤組織和瘤周非腫瘤組織(癌旁組織)行常規(guī)固定和石蠟包埋，石蠟切片經(jīng)HE染色后選擇欲制備組織芯片的部位，并在切片上標(biāo)記備用；(2)對于細(xì)胞系，可用貼壁細(xì)胞經(jīng)固定后用細(xì)胞刮子刮下后洗滌，再用2％瓊脂懸浮冷凝后將其切成小塊常規(guī)石蠟包埋(用于體外狀態(tài)的檢測)，(3)對于腫瘤細(xì)胞系，可用裸鼠皮下移植瘤組織常規(guī)石蠟包埋；在一種優(yōu)選例中，選用硬度適中的空白石蠟塊[稱為“芯片石蠟塊”或“受體塊”(Recipient block)]，并按設(shè)計打陣列孔。例如打孔針外徑，即實際受體石蠟孔孔徑為0.6mm，橫向和縱向孔距為0.6-0.9mm。
然后，根據(jù)各供體塊的組織定位信息，用點陣儀供體穿刺針(例如，穿刺針內(nèi)徑，即實際供體石蠟包埋組織外徑也為0.6mm)從石蠟?zāi)笁K的定位處穿取組織，推入芯片石蠟塊的坐標(biāo)定位孔(即點樣孔)中，依次進(jìn)行直至將所有標(biāo)本點成陣列。常規(guī)制作連續(xù)石蠟切片(例如，5μm厚切片)粘貼在聚-L-賴氨酸處理過的載玻片上。
本發(fā)明芯片的應(yīng)用范圍包括用于觀察細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測、免疫熒光分析、原位PCR、篩選藥物或藥靶。尤其是用于篩選影響腫瘤組織和細(xì)胞系中細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路改變的關(guān)鍵基因及其蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)具有診斷、治療價值的新基因及可作為藥靶的新基因。
具體而言，本發(fā)明芯片可高通量地應(yīng)用各種組織(正常組織、疾病組織如癌組織和癌旁組織)，各種細(xì)胞(正常細(xì)胞、原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞)，用于不同方法如原位雜交(ISH)方法檢測各種基因在核酸水平的表達(dá)變化；用免疫組化(IHC)檢測各種基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白)的變化等；用免疫熒光(IF)技術(shù)進(jìn)行基因的亞細(xì)胞定位。在一張組織-細(xì)胞系芯片上不僅用于檢測同種基因在各種組織中的表達(dá)差異；更重要的是檢測與分析同一基因的蛋白質(zhì)(包括磷酸化蛋白和總蛋白)的變化狀況。
因此，本發(fā)明還提供了一種檢測觀察細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路方法，其主要基于以下原理信號傳導(dǎo)過程中，蛋白質(zhì)磷酸化普遍存在，如生長因子和細(xì)胞因子可使其相應(yīng)受體磷酸化，而磷酸化的受體又可激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶使之磷酸化；細(xì)胞周期進(jìn)程中是由CDK的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)G1/S和G2/M的轉(zhuǎn)變；代謝過程中葡萄糖和糖原的互變及葡萄糖的運輸，也是由蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié)的。因此利用信號傳導(dǎo)分子的磷酸化抗體檢測疾病狀態(tài)下該細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子的磷酸化程度，可以為研究疾病的發(fā)生機(jī)理提供重要線索。采用同時篩選大量信號傳導(dǎo)通路分子的磷酸化，再擇其磷酸化變化明顯者對該信號傳導(dǎo)分子的上游調(diào)控基因或/和受該分子調(diào)控的下游分子進(jìn)行研究，或通過抑制該信號傳導(dǎo)分子的上游調(diào)控分子來觀察其磷酸化狀態(tài)或活性的改變，這種新型研究方法將對疾病致病機(jī)理的研究甚或基因功能研究是一種可行和有效的研究手段。
本發(fā)明的檢測不同細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路中基因表達(dá)狀態(tài)和/或磷酸化狀態(tài)差異的方法，包括以下步驟(i)提供本發(fā)明的第一和第二組織/細(xì)胞系芯片，所述的芯片包括(a)一個基片；(b)位于所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，并且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細(xì)胞，且切片上有2種以上的組織/細(xì)胞；
且第一和第二組織/細(xì)胞系芯片上的石蠟切片為相鄰的連續(xù)切片；(ii)在第一組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因磷酸化蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析，并且在第二組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的總蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細(xì)胞系芯片之間的免疫組化檢測結(jié)果。
然后，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的研究，例如(1)選擇發(fā)生改變的基因的信號通路上游和下游的基因，檢測其表達(dá)狀態(tài)和/或磷酸化狀態(tài)；(2)進(jìn)行各種疾病組織(如各種腫瘤及相應(yīng)正常組織)及各種癌細(xì)胞系不同通路的各種磷酸化和非磷酸化蛋白的對比檢測及其譜型；(3)觀察已知基因或新基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物組織中信號傳導(dǎo)的改變；(4)研究體內(nèi)和體外化學(xué)藥物和生物藥物處理后細(xì)胞和組織中信號傳導(dǎo)的改變，進(jìn)行藥靶篩選；(5)進(jìn)行原位雜交檢測基因在mRNA水平的表達(dá)改變。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1Akt基因在正常肝組織、肝癌組織、癌旁肝組織及肝癌細(xì)胞系中的磷酸化狀態(tài)檢測1.材料和方法癌組織-細(xì)胞系芯片本研究采用的組織芯片由54對肝細(xì)胞癌和癌旁組織，9例意外死亡者正常肝組織和3株肝癌細(xì)胞系Hep3B，SMMC7721，BEL7402的裸鼠皮下移植瘤組織等組成(見表1和圖1)。
表1磷酸化Akt-1抗體免疫組化結(jié)果(組織-細(xì)胞系芯片) 日期2001.12.6




N細(xì)胞核 P細(xì)胞質(zhì) E內(nèi)皮細(xì)胞 F成纖維細(xì)胞
2.結(jié)果Akt1磷酸化蛋白抗體及Akt1/2總蛋白抗體免疫組化結(jié)果(肝癌組織/細(xì)胞系芯片)為癌細(xì)胞中胞核內(nèi)磷酸化Akt1呈異常強陽性，胞質(zhì)內(nèi)呈弱陽性；而癌旁肝和正常肝組織胞質(zhì)和胞核均為中等程度的表達(dá)或低表達(dá)，SMMC7721，BEL7402和Hep3B只有核內(nèi)高表達(dá)。癌旁肝組織中增生膽管上皮細(xì)胞核內(nèi)也呈高表達(dá)。Akt1/2總蛋白在肝癌組織，癌旁肝和正常肝組織胞質(zhì)均為高表達(dá)，胞核也呈陽性反應(yīng)，但較胞質(zhì)表達(dá)低；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質(zhì)和胞核內(nèi)均為高表達(dá)(詳見表2和圖2)，圖3為圖2的部分和局部放大。
表2Akt1磷酸化蛋白抗體和Akt1/2總蛋白抗體免疫組化結(jié)果(肝癌組織/細(xì)胞系芯片)抗體 各種蛋白在組織中的陽性率(％)*結(jié)果說明名稱 肝癌組織 癌旁肝組織 正常肝組織 肝癌細(xì)胞系胞質(zhì) 細(xì)胞核 胞質(zhì) 細(xì)胞核 胞質(zhì) 細(xì)胞核 胞質(zhì) 細(xì)胞核 癌細(xì)胞中胞核內(nèi)磷酸化+～ ++～ +～Akt1呈異常強陽性，胞質(zhì)內(nèi)±/- +～+++ ±/- +++ ±/- +++ ±/- +++弱陽性；而癌旁肝和正常肝磷酸化組織胞質(zhì)和胞核均為中等程Akt-1度的陽性或弱陽性，(p-Akt1 90.6 90.6 100 100 100 100 100 100SMMC7721，BEL7402和(Ser473)) (48/53) (48/53) (54/54) (54/54) (9/9) (9/9) (3/3) (3/3)Hep3B只有核內(nèi)高表達(dá)。癌旁肝組織中增生膽管上皮細(xì)胞核內(nèi)也呈強陽性+～ +～ ++～ ++～Akt1/2總蛋白在肝癌組織，+++ ±/+ +～+++ + +++ + +++ +++癌旁肝和正常肝組織胞質(zhì)均Akt-1 為強陽性，胞核呈弱陽性反總蛋白 100 100 100 100 100 100 100 100 應(yīng)，較胞質(zhì)陽性反應(yīng)低；(Akt1/2) (53/53) (53/53) (54/54) (54/54) (9/9) (9/9) (3/3) (3/3) SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質(zhì)和胞核內(nèi)均為強陽性*免疫組化結(jié)果的判定主要依據(jù)各種腫瘤(癌旁和癌)組織中實質(zhì)細(xì)胞的免疫化學(xué)反應(yīng)結(jié)果(陽性細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞著色深淺)綜合判定的；具體標(biāo)準(zhǔn)是無陽性反應(yīng)細(xì)胞，為“-”；陽性細(xì)胞數(shù)少于15％，為“+”；陽性細(xì)胞數(shù)約為15-25％，為“+”；陽性細(xì)胞數(shù)在25-50％，為“++”；在50-75％之間，為“+++”；大于75％，為 “++++”。表中陽性率以“+”以上計算。
實施例2Smad1基因在正常肝組織，肝癌組織，癌旁肝組織及肝癌細(xì)胞系中的磷酸化狀態(tài)檢測按實施例1中所述的方法，用Smad1磷酸化蛋白抗體和Smad1總蛋白抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析。
結(jié)果表明癌細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)磷酸化Smad1呈弱陽性，陽性率為31.37％(16/51)，胞核內(nèi)呈陰性；而癌旁肝和正常肝組織胞質(zhì)均為中等程度的陽性反應(yīng)，其陽性率均為100％(57/57；9/9)；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質(zhì)內(nèi)均呈中等程度的陽性反應(yīng)。
癌細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)Smad1總蛋白呈弱陽性，陽性率為31.37％(16/51)，胞核也呈不同程度的陽性；而癌旁肝胞質(zhì)內(nèi)弱陽性率為100(54/54)，胞核內(nèi)疑似陽性率為59.26％(32/54)；正常肝組織胞質(zhì)和胞核均呈中等程度的陽性反應(yīng)，其陽性率均為100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞質(zhì)胞核內(nèi)均呈中等程度的陽性反應(yīng)，Hep3B胞質(zhì)陽性，胞核陰性(詳見表3)。
表3Smad1磷酸化蛋白抗體和Smad1總蛋白抗體免疫組化結(jié)果(肝癌組織/細(xì)胞系芯片)抗體 各種蛋白在組織中的陽性率(％)*結(jié)果說明名稱 肝癌組織 癌旁肝組織 正常肝組織 肝癌細(xì)胞系胞質(zhì) 細(xì)胞 胞質(zhì) 細(xì)胞 胞質(zhì) 細(xì)胞 胞質(zhì) 細(xì)胞 癌細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)磷酸化Smad1核 核 核 核呈弱陽性，陽性率為+～ + +～ + ++～ + +～+++ ++++ +++ +++ +++ 31.37％(16/51)，胞核內(nèi)呈陰性；而磷酸化癌旁肝和正常肝組織胞質(zhì)均為中等31.37 0 100 0 100 0 100 0Smad1程度的陽性反應(yīng)，其陽性率均為(16/51) (54/54) (9/9) (3/3)100％(57/57；9/9)SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質(zhì)內(nèi)均呈中等程度的陽性反應(yīng)。
+～ +～++ +～++ ±/+ +～++ + ++～ +～++″癌細(xì)胞中胞質(zhì)內(nèi)Smad1總蛋白+++ +++呈弱陽性，陽性率31.37％(16/51)，31.37 11.32 100 59.26 100 100 100 66.67胞核也呈不同程度的陽性；而癌旁Smad1(16/51) (6/53) (54/54) (32/54) (9/9) (9/9) (3/3) (2/3) 肝胞質(zhì)內(nèi)弱陽性率為100(54/54)，胞總蛋白核內(nèi)疑似陽性率為59.26％(32/54)；正常肝組織胞質(zhì)和胞核均呈中等程度的陽性反應(yīng)，其陽性率均為100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞質(zhì)胞核內(nèi)均呈中等程度的陽性反應(yīng)。
″*免疫組化結(jié)果的判定主要依據(jù)各種腫瘤(癌旁和癌)組織中實質(zhì)細(xì)胞的免疫化學(xué)反應(yīng)結(jié)果(陽性細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞著色深淺)綜合判定的；具體標(biāo)準(zhǔn)是無陽性反應(yīng)細(xì)胞，為“-”；陽性細(xì)胞數(shù)少于15％，為“+”；陽性細(xì)胞數(shù)約為15-25％，為“+”；陽性細(xì)胞數(shù)在25-50％，為“++”；在50-75％之間，為“+++”；大于75％，為“++++”。表中陽性率以“+”以上計算。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測不同細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路中基因表達(dá)狀態(tài)和/或磷酸化狀態(tài)差異的方法，其特征在于，包括以下步驟(i)提供第一和第二組織/細(xì)胞系芯片，所述的芯片包括(a)一個基片；(b)位于所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，并且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細(xì)胞，且切片上有2種以上的組織/細(xì)胞；且第一和第二組織/細(xì)胞系芯片上的石蠟切片為相鄰的連續(xù)切片；(ii)在第一組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因磷酸化蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析，并且在第二組織/細(xì)胞系芯片上用與信號傳導(dǎo)相關(guān)的總蛋白的抗體進(jìn)行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細(xì)胞系芯片之間的免疫組化檢測結(jié)果。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方厘米。
4.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的組織/細(xì)胞選自正常細(xì)胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養(yǎng)的細(xì)胞系、傳代細(xì)胞和/或原代細(xì)胞、體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細(xì)胞系。
5.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的基片選自載玻片和塑料基片。
6.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種高通量檢測與分析各種正常與疾病組織的細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路的組織與細(xì)胞芯片。所述芯片包括(a)一個基片；(b)位于所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，并且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細(xì)胞，且切片上有2種以上的組織/細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述芯片的制法和用途，尤其是用于檢測不同細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路中基因表達(dá)狀態(tài)和/或磷酸化狀態(tài)差異。
文檔編號C12Q1/02GKCN1193101SQ02111667
公開日2005年3月16日 申請日期2002年5月15日
發(fā)明者顧健人, 李錦軍 申請人:上海新世界基因技術(shù)開發(fā)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan