專利名稱:血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及了血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(Endostatin)的一種表達、生產(chǎn)方法，特別是通過發(fā)酵條件的探索和工藝的改進，提高了其在畢赤酵母(PichiaPastoris)酵母中的穩(wěn)定性和表達得率，產(chǎn)品產(chǎn)率在國內(nèi)外均處于領(lǐng)先水平，使血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)價值得到提高。
背景技術(shù)：
二十年代八十年代后期至九十年代初，大量的研究發(fā)現(xiàn)，血管形成對于實體瘤及其轉(zhuǎn)移瘤的生長與維持是必需的(Induction of angiogenesis duringthe transition from hyperplasia to neplasia.Nature，1989，339(6219)58)。為了刺激血管生成，腫瘤會產(chǎn)生一系列血管形成因子，血管形成的表現(xiàn)是正和負(fù)的新生血管調(diào)節(jié)物網(wǎng)狀平衡的結(jié)果(The diagnostic andprognostic value of tumor angiogenesis.Eur J Surg Suppl 1998，(582)99-103)。
目前已分離和純化了20多種血管生成因子和相關(guān)因子，至少15種血管生成抑制因子。血管生成因子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VPF/VEGF)、酸性及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF，bFGF)、血管生成素(angiogenin)、胎盤生長因子(PIGF)、表皮生長因子(EGF)、白介素-8、腫瘤壞死因子α(TNFα)等(Angiogenesis Inhibitors in Cancer Research.NIH Press Release，Revised April 2，1999)。
就腫瘤的治療而言，以手術(shù)切除及放化療和免疫生物防治治療為主，但療效不盡如人意；其原因是藥物的非特異導(dǎo)向性，使腫瘤的殺滅力有限，并挑剔靶細(xì)胞種類，引起毒性副反應(yīng)；長期化療還易發(fā)生腫瘤基因的變異，導(dǎo)致腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。有研究表明腫瘤在生長至0.2-0.3mm時無血管供應(yīng)營養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞將停止生長或自行消失，因而針對血管新生的腫瘤抑制療法，簡稱休眠療法(dormancy therapy)應(yīng)運而生(Angiogenesis Inhibitors in CancerResearch.NIH Press Release，Revised April 2，1999)。
近年來能直接抑制血管增生的因子備受人們關(guān)注，內(nèi)源性的血管生成抑制劑主要包括血管抑制素(angiostatin)、血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin)、肌原蛋白1(troponin I)、轉(zhuǎn)化生長因子b(TGF-b)、血小板反應(yīng)素(thrombospondin)、血小板因子4(PF4)、干擾素α、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)、催乳素16kd片斷等。其中血管抑制因子-血管抑制素與血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制因子-血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素更是人們研究的熱點(AngiogenesisPotentials for Pharmacologic Intervention in the Treatment of Cancer，Cardiovascular Diseases，and Chronic Inflammation.Pharmacol Rev 2000，52(2)237-268)。目前動物試驗和臨床研究均證實這兩個因子有明顯的抑制血管增生進而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。
1997年，繼1994年從小鼠Lewis腫瘤細(xì)胞中分離出的38KD具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制作用的angiostatin后，O′Reilly等發(fā)現(xiàn)一種小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞系EOMA的培養(yǎng)基具有血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用。將該培養(yǎng)基過賴氨酸葡聚柱后，其抑制活性并不存在于結(jié)合物質(zhì)，而在流穿部分中，表明該抑制活性不是由angiostatin引起。但如許多具有血管抑制劑的物質(zhì)一樣，具有該抑制活性對肝素sepharose有親和力。經(jīng)肝素親和層析及S200凝膠過濾及幾輪C4柱反相HPLC后，該活性物質(zhì)純化到單一電泳純，從10L含500mg純蛋白的培養(yǎng)基中純化到2μg的活性物質(zhì)，抑制活性提高5000倍，活性回收率為2％。該物質(zhì)分子量為20kD左右，在(100～600)ng/ml濃度對血管內(nèi)皮細(xì)胞有劑量依賴的特異抑制生長作用，對其它細(xì)胞無作用。N端氨基酸序列測定結(jié)果表明，該物質(zhì)為膠原XVIIIC未端片段，被命名為血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。該物質(zhì)在小鼠中對腫瘤誘導(dǎo)的血管生成具有幾乎完全的抑制作用，顯示出很強的抗腫瘤活性。(EhdostatinAnendogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell，1997，88(2)277)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素為分子量20kD左右的膠原XVIIIC球形未端部分片段。人與小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素有86％的序列完全相同，其中都包含了4個保守的半胱氨酸，說明它們的結(jié)構(gòu)可能非常相似。小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素一級結(jié)構(gòu)有184個氨基酸，分子量為20-22KD，其中酸性氨基酸29個，疏水性氨基酸占42％。人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素一級結(jié)構(gòu)有183個氨基酸，分子量為18-20KD。
血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素與angiostatin一樣，是一個大分子蛋白質(zhì)的酶解物，而大蛋白的分子不具血管抑制活性。血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素天然結(jié)構(gòu)中的折疊結(jié)構(gòu)是血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素功能發(fā)揮所必須的結(jié)構(gòu)。用大腸桿菌生產(chǎn)的重組血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素沒有天然折疊結(jié)構(gòu)，可溶性差，為沉淀蛋白，但皮下注射后能轉(zhuǎn)變成有活性的折疊結(jié)構(gòu)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，重新抑制血管內(nèi)皮增生。(《生命的化學(xué)》，1999，1)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素具有以下生物學(xué)活性1)血管生長抑制作用。Blezinger等證實，直接肌肉內(nèi)注射血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素表達質(zhì)?？梢越档湍[瘤血管形成3倍以上，可以抑制65％的實驗性角膜新生血管誘導(dǎo)生長(Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastasesby intramuscular administration of the endostatin gene.NatBiotechnol，1999，17(4)-343)；O′Reilly證實大腸桿菌生產(chǎn)的復(fù)性、未復(fù)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素及桿狀病毒產(chǎn)生的重組血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素均有抑制雞胚血管生成的作用(chick chorioallantoic membrane，CAM)。同樣，酵母產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素也證實存在同樣的作用(血管生成抑制素血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素研究新進展，《中國腫瘤生物治療雜志》2000，7(1)76-78)；血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對雞胚絨毛尿囊膜血管生成有明顯抑制作用，但不干擾正常的血管組織功能。
血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、牛肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞有特異的抑制增殖作用，而對非血管內(nèi)皮細(xì)胞系細(xì)胞如NIH3T3，Al0平滑肌細(xì)胞等則無增殖抑制作用。這種抑制作用在含血管形成促進因子bFGF(3ng/ml)時更為明顯。該生長抑制作用與細(xì)胞的凋亡相伴隨。牛肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(10μg/ml)作用后，細(xì)胞變圓，并與基質(zhì)相脫離。細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)為12h后annexinV-FLFC結(jié)合試驗中磷脂酰絲氨酸(PS)由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜外側(cè)，24h后細(xì)胞內(nèi)的半胱天冬酶活性明顯增加。TUNEL法也測到核內(nèi)DNA的降解，同時細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL含量也下降。(Endostatininduces endothelial cell apoptosis.J Biol Chem，1999，274(17)ll721)2)抗腫瘤作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對動物移植瘤顯示出良好的控制效應(yīng)，O′Reilly證實了血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對腫瘤的轉(zhuǎn)移和原發(fā)性種植腫瘤具有抑制作用。當(dāng)給予小鼠0.3mg/kg/d皮下注射時，小鼠Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移幾乎完全被抑制。重組的復(fù)性或非復(fù)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在小鼠中幾乎完全抑制種植已達100～200mm3大小的Lewis肺癌、T241纖維肉瘤、Eoma血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤、B16F10黑色素瘤的生長，原發(fā)性腫瘤消退至顯微鏡可見的休眠期。免疫組化證實腫瘤血管形成被阻斷，腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)提高7倍。在血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的治療中沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。(血管生成抑制素血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素研究新進展，《中國腫瘤生物治療雜志》2000，7(1)76-78)Folkman實驗室用血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素治療小鼠Lewis肺癌后(20mg/kg)，腫瘤縮小，停止給藥后，腫瘤又回復(fù)到原來大小；再用血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素治療，腫瘤再次縮小，這樣持續(xù)6輪循環(huán)治療后，血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素治療仍然有效，而且腫瘤在被觀察的5個月內(nèi)未再復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞不再重新增殖而處于休眠狀態(tài)。解剖后發(fā)現(xiàn)，所有的腫瘤都退化到無需血管也能存活的微小狀態(tài)。在所有的實驗中，均無腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。這一實驗表明血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素沒有引發(fā)腫瘤產(chǎn)生抗藥性。除了直接注射重組血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素引起腫瘤抑制外，Blezinger P直接肌肉注射血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的表達質(zhì)粒也形成了對原發(fā)性腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制。他們給小鼠肌肉注射240μg的表達質(zhì)粒，注射后第3天，血循環(huán)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素水平達3μg/ml，第7天最高達8μg/ml，至14d后降至4μg/ml。接種的BALB/c小鼠腎細(xì)胞癌(Renca)和C57BL CLC在注射后第13天與對照相比，腫瘤被抑制40％，二者有統(tǒng)計學(xué)的差別。肺部腫瘤有6倍轉(zhuǎn)移數(shù)的抑制，肺重量減少32％。用angiostatin和endostatin聯(lián)合治療取得了更好的療效，治療25天后，腫瘤完全退化，停止治療后，所有的小鼠都保持健康，沒有腫瘤重新生長。
美國EntreMed公司2000年6月在美國癌癥研究協(xié)會(AACR)會議上報告了該藥物的研究情況。美國ENTREMED公司2000年11月宣布開始血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的I期臨床試驗，結(jié)果證明其是一種安全、良好耐受的藥物。共61例病人(20種不同的實體腫瘤)參與試驗。試驗在三處分別進行馬撒諸塞州波士頓的Dana-Farber/Partners腫瘤監(jiān)護中心、休斯頓國家癌癥學(xué)院(NCI)的癌癥中心(主辦單位)以及威斯康星癌癥中心。試驗中未見病人出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而部分進展性癌癥患者有臨床應(yīng)答。一位惡性肉瘤患者下巴病灶處縮小了60％，另一位神經(jīng)瘤患者的腫瘤縮小了20％，另有5例病人病情趨于穩(wěn)定，腫瘤不再發(fā)展。ENTREMED公司發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素用藥并未干擾例如傷口愈合等正常血管組織的生長。ENTREMED公司在2001年一季度開始血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在所有實體腫瘤以及一些特殊腫瘤進行II期臨床試驗。
歐洲腫瘤學(xué)研究所(European Institute of Oncology)經(jīng)過體外和活性研究，證明血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素有抗癌癥血管生成的作用，可促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致癌瘤萎縮。將安度司它汀和化療聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)可以抑制移植到老鼠體內(nèi)的非霍奇金淋巴瘤的生長，而且安度司它汀可以降低化療藥物的毒副作用。
中國專利申請公開號CN1177005(1998年03月25日申請)公開了一種人實體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制因子的基因克隆方法及在抗腫瘤血管再生治療中的應(yīng)用。
目前表達重組血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素最多的且有產(chǎn)業(yè)價值的方式有二種大腸桿菌表達和酵母表達。
中國專利申請公開號CN1224759(1999年08月04日)公開了一種在大腸桿菌中生產(chǎn)內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法，其中經(jīng)PCR方法合成人內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因，并構(gòu)建了含有該基因的載體和重組菌株。然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素產(chǎn)物需要復(fù)性，因此工藝較為復(fù)雜。
大腸桿菌表達的重組血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素為不溶性蛋白，雖然動物試驗證實直接注射這種不溶性蛋白可被機體緩慢吸收并產(chǎn)生抑瘤活性，但作為治療藥品能否被批準(zhǔn)將是一個很大的問題。雖然也有報道通過體外復(fù)性得到可溶性蛋白，但復(fù)性過程中蛋白濃度需要維持在很低的水平，如80pg/ml(POMPLIANODAVID L，et al.，SOLUBLE RECOMBINANT ENDOSTATIN，W00058498)，不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
目前國外臨床研究均采用酵母表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。畢赤酵母(PichiaPastoris)表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速，具有諸多優(yōu)點的表達系統(tǒng)，在表達真核細(xì)胞外源蛋白時，不僅具有原核生物生長快、操作簡便的特點，又具備哺乳類細(xì)胞的翻譯后加工和修飾的功能，從而表達有生物活性的可溶蛋白。但目前國內(nèi)外報道的用畢赤酵母(Pichia Pastoris)表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素水平還比較低低，中試搖瓶的表達水平15-30mg/L左右(Dhanabal M，Volk R，RamchandranR，Simons M，Sukhatme VP.，Cloning，expression，and in vitro activityof human endostatin.Biochem Biophys Res Commun 1999，258(2)345-52；Trinh L，Noronha SB，F(xiàn)annon M，Shiloach J.，Recovery of mouseendostatin produced by Pichia pastoris using expanded bedadsorption，Bioseparation 2000；9(4)223-30)，發(fā)酵罐大生產(chǎn)水平達120mg/ml(BERMEJO LOURDES L，et al.，METHOD OF PRODUCING ANDPURIFYING ENDOSTATIN PROTEIN，Patent NumberW00119989)。
臨床上血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素用量很大，特別是用血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素治療實體瘤，劑量達100mg/m2左右，因此提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的表達水平成為當(dāng)務(wù)之急，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效的生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效的生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法，它包括步驟(a)在適合表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的條件且鋅離子濃度為0.01-50mM下，培養(yǎng)攜帶編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞或染色體中整合有編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的宿主細(xì)胞，從而表達出血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素；(b)從培養(yǎng)物中分離純化出血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。
在一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌和酵母細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)包括二個階段(i)培養(yǎng)階段，其中鋅離子濃度為0.1-20mM；(ii)誘導(dǎo)階段，其中鋅離子濃度為0.1-20mM，pH為5-8。
在另一優(yōu)選例中，在誘導(dǎo)階段，鋅離子濃度為0.5-5mM，pH為6-7。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)之前還包括步驟
制備種子液，其中鋅離子濃度為0.1-1mM。
在另一優(yōu)選例中，所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素包括人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素、鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，及其保持血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素生物活性的突變體。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括超濾、層析。
在另一優(yōu)選例中，在誘導(dǎo)階段還加入酪蛋白，以防止血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素被降解。
在另一優(yōu)選例中，所述的鋅離子是以選自下組的鋅鹽形式加入氯化鋅、硫酸鋅、乙酸鋅、或其混合物。
在另一優(yōu)選例中，在純化系統(tǒng)中加入1-100uM Zn2+，從而進一步提高純化的回收率。
具體實施方式
對水溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素與Zn2+關(guān)系的研究很多。對于Zn2+的存在對血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素最終的活性發(fā)揮是否有直接關(guān)系存在很多爭議(Boehm T.O′reilly MS，Keough K，Shiloach J，Shapiro R，F(xiàn)olkman J.，Zinc-bindingof endostatin is essential for its antiangiogenic activity，BiochemBiophys Res Commun 1998，252(1)190-4；Hohenester E，Sasaki T，MannK，Timpl R.，Variable zinc coordination in endostatin，J Mol Biol2000，297(1)1-6)。在生理條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素與Zn2+11結(jié)合。此結(jié)合受到pH、其它鹽的的影響。
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的生產(chǎn)過程中，通過提高鋅離子濃度，可以大幅提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的產(chǎn)率。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
適用于本發(fā)明的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素包括人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(humanEndostatin)與鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(murine Endostatin)，及其保持血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的生物學(xué)活性的突變體。突變體包括血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的N端缺失、增加或改變0-15個氨基酸，C端缺失、增加或改變0-15個氨基酸，分子內(nèi)部變更部分氨基酸，但保持血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的生物學(xué)活性的突變蛋白。
適用于本發(fā)明的表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的宿主細(xì)胞，可以是現(xiàn)有的生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的工程菌，也可用常規(guī)方法構(gòu)建。宿主細(xì)胞可以是原核(如大腸桿菌)或真核(如酵母)，較佳地是畢赤酵母。在構(gòu)建時，可根據(jù)文獻報道的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的氨基酸序列，全基因合成或天然來源得到血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的cDNA。期間，可以根據(jù)Pichia酵母對不同密碼子的偏愛性，選擇性突變了天然血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的部分堿基(氨基酸序列不變)。用分子克隆的常規(guī)方法，在cDNA 5′端與3′端分別引進特異性酶切位點，克隆入表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化P.Pastoris宿主菌，篩選鑒定，得到工程菌。 工程菌可能時快速利用甲醇型(Mut+)與慢速利用甲醇型(Muts)。
在獲得了表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的宿主細(xì)胞后，便可在常規(guī)的適合表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的條件下培養(yǎng)，以表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。其中通過提高鋅離子濃度便可大幅提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的產(chǎn)量。
在本發(fā)明中，鋅離子可以來自鋅鹽，例如ZnCl2，ZnSO4，乙酸鋅等鋅鹽，還可來自其他含鋅離子的物質(zhì)，或它們的混合物。
在本發(fā)明方法中，鋅離子的濃度通常為0.01-50mM或更高，較佳地為0.1-20mM，更佳地為0.5-5mM。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基沒有特別限制，可以是各種常規(guī)的培養(yǎng)基。例如對于畢赤酵母而已，可以選用(但并不限于)YPD、BMGY、MM培養(yǎng)液、低鹽發(fā)酵培養(yǎng)基等。
YPD平板 酵母提取物 1％蛋白胨 2％葡萄糖 2％瓊脂 1％BMGY 酵母提取物 1％蛋白胨 2％磷酸鉀緩沖液，pH6.0 100mMYNB 1.34％
生物素 (4×10-5)％甘油 1％MM YNB 1.34％生物素 (4×10-5)％甲醇 0.5％低鹽發(fā)酵培養(yǎng)基 H3PO4(85％原液) 26.7ml/LCaSO4·2H2O 0.93g/LK2SO418.2g/LMgSO47.27g/LKOH(固體) 4.13g/L橘鹽酸鈉·2H2O 1.47g/LPTM12ml/L甘油 4％(w/v)另一方面，本發(fā)明還對對發(fā)酵條件進行了進一步優(yōu)化1.溫度的控制血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在25-31℃。
2.誘導(dǎo)期的PH值控制誘導(dǎo)期pH，通常為pH5-8。pH在6-7更加有利于表達水平的提高。
3.溶氧的控制溶氧控制在20-90％。溶氧的維持可以用氧氣/空氣混合氣體的通入來解決。
4.補料的流加補料種類包括甘油、甲醇、葡萄糖等糖原，可單獨補料或混合補料。
5.Zn2+加入。如上所述，Zn2+有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素N端的致密性，即有保護N端的作用。若血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的N-端失去保護，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象打開，很容易被蛋白水解酶作為底物而降解?？梢栽谡麄€或部分培養(yǎng)、誘導(dǎo)過程中加入鋅離子。例如加入Zn2+的方式有以下幾種方法，這幾種方法可以分開，也可以同時進行
(1).改變PTM1中鋅鹽的濃度。PTM1是微量元素混合物，其常規(guī)配方如下PTM1CuSO4·5H2O 6g/LKI 0.08g/LMgSO4·H2O 3g/L鉬酸鈉 0.2g/L硼酸 0.02g/LCaSO4·2H2O 0.5g/LZnCl220g/L氯化鈷 0.5g/LFeSO465g/L生物素 0.2g/LH2SO45ml/L例如，將經(jīng)典PTM1中ZnCl2的濃度從20g/L提高到30～60g/L。
(2).種子液中加入0.1-1mM Zn2+，使菌種在接入發(fā)酵罐時，更容易適應(yīng)發(fā)酵罐中的鋅離子濃度。
(3).培養(yǎng)、誘導(dǎo)過程中Zn2+的濃度0.1-20mM，特別是誘導(dǎo)過程，最好是0.5-5mM。
6.PTM1(混合微量基元素)的量，以下幾種方法可以分開，也可以同時進行(1).在上罐前，加入的PTM1為2～20ml/L發(fā)酵液；(2).甘油補料或混合補料中的PTM1為2～20ml/L發(fā)酵液；(3).甲醇補料中的PTM1的為2～20ml/L發(fā)酵液。
7.加CA(酪蛋白水解物)的方法在誘導(dǎo)開始不同時間，間斷性加入一定量的CA。
在本發(fā)明中，對于表達的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，可以用常規(guī)方法進行純化并制成藥劑。一種優(yōu)選方法是對發(fā)酵樣品以離心、過濾等方式去除菌體，獲得含目的蛋白質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的發(fā)酵清液。然后，對發(fā)酵清液通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析。
1.凝膠過濾層析樣品超濾濃縮后，可以用凝膠過濾層析去鹽及純化。
2.離子交換層析(陽離子交換層析、陰離子交換層析)樣品的緩沖系統(tǒng)以稀釋、超濾、沉淀后復(fù)溶、透稀或凝膠過濾層析等手段進行更換，直至與對應(yīng)的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，且電導(dǎo)率小于4000uS/cm，直接上樣，鹽濃度梯度或pH梯度梯度洗脫。
此外，在純化緩沖系統(tǒng)中可加入1-100uM Zn2+，以提高回收率。
經(jīng)過2-3步純化，得到血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素純品，純化得率65％以上，純度95％以上，純品得率約200mg/L發(fā)酵液，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的EC50為100ng/ml。
在本發(fā)明的一個實例中，構(gòu)建了血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的P.Pastoris酵母表達工程菌，甲醇誘導(dǎo)，表達的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素為胞外分泌型，不需復(fù)性，優(yōu)于大腸桿菌表達系統(tǒng)。該工程菌屬甲醇快速利用型，具有發(fā)酵時間短的優(yōu)點。通過提高目的基因在酵母中的整合數(shù)及對發(fā)酵條件的優(yōu)化，特別是增加培養(yǎng)基中的Zn2+水平及對pH進行優(yōu)化，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素穩(wěn)定性和最終表達量，使血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素表達量達250-300mg/L，且表達產(chǎn)物穩(wěn)定，這在國內(nèi)外均處于領(lǐng)先水平(是國內(nèi)外所報道水平的2-3倍)。
在本發(fā)明中，因表達蛋白屬于胞外分泌型，發(fā)酵上清可直接進行層析純化。經(jīng)過二步純化后，得到血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素純品，純品得率約200mg/L發(fā)酵液，純度95％以上，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的EC50為100ng/ml。
純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的注射用粉針劑。經(jīng)穩(wěn)定性試驗表明，該粉針劑穩(wěn)定。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的Pichia酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建1.目的基因的獲得根據(jù)文獻報道的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的堿基序列，合成20段互補的引物，并在5′、3′端分別引入特異性酶切位點EcoR I、Not I，按分子克隆的常規(guī)方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30min。磷酸化的各寡核苷酸片段以等mol數(shù)混合，94℃變性5min，立即變至65℃退火10min，然后加入T4連接酶，16℃反應(yīng)過夜。
2.表達質(zhì)粒pPIC9K-血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化宿主菌pPIC9K質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、Not I酶解后，回收大片斷，與合成的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素cDNA片斷連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，小量制備質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶鑒定篩選出含血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素全長cDNA序列的陽性克隆。用pPIC9K質(zhì)粒的5′AOX1引物及3′AOX1引物進行正、逆向序列分析，證實克隆序列與設(shè)計序列完全一致。
把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9k-血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素線性化，并用低熔點瓊脂糖膠回收后，轉(zhuǎn)入宿主菌畢赤酵母GS115，不同濃度G418(如2，4，6，8mg/L)的MD平板上選擇，得到高效表達株(據(jù)其抗G418濃度，可判斷其基因拷貝整合數(shù)大于等于20個)。誘導(dǎo)24小時后目的蛋白表達量占總蛋白10％左右。根據(jù)其消耗甲醇的速度，判斷此工程菌株為Mut+。
實施例2中試發(fā)酵條件選擇NBS BioFlo 3000發(fā)酵罐(5L)。
1.菌種與培養(yǎng)基挑取單克隆，BMGY中30℃振蕩培養(yǎng)過夜，至OD6002-4，1∶10接入低鹽培養(yǎng)基。
2.發(fā)酵培養(yǎng)階段溫度30℃PH5.0
甘油補料中PTM1量12ml/L甲醇誘導(dǎo)前濕菌重223g/L，共培養(yǎng)31小時3.發(fā)酵誘導(dǎo)階段溫度30℃PH6.5甲醇補料中PTM1量12ml/L甲醇誘導(dǎo)結(jié)束濕菌重474g/L，共誘導(dǎo)35小時4.結(jié)果誘導(dǎo)35hr后，血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素表達量占發(fā)酵上清液總蛋白31％，表達量達250ug/ml(用改良Lowry法測)。
結(jié)果


實施例5血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素純化1岱13.鴕°4℃下5000rpm離心10min，得上清。
2岢伺ㄋ跫案 換撼逡海菏褂AMillipore超濾器，超濾膜截流分子量為3KD，超濾時留取濃縮液。發(fā)酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入以PB(PH7.4，20mM，含0.01％Tween80)，繼續(xù)超濾；反復(fù)此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平和PB(PH7.4，20mM，含0.01％Tween80)緩沖液的電導(dǎo)水平接近。
3岵閹觶°層析介質(zhì)SP Sepharose FF緩沖液溶液APB(PH7.4，20mM)+0.01％Tween80溶液BPB(PH7.4，20mM)+2M NaCl+0.01％Tween80上樣將超濾濃縮的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素溶液(1L左右，電導(dǎo)為2000cm/s左右)上樣。
清洗上樣后用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％-100％。
收集當(dāng)溶液B在30％-40％時出現(xiàn)樣品。
結(jié)果純化得率65％以上，純度95％以上，純品得率約200mg/L發(fā)酵液，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的EC50為100ng/ml。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的條件且鋅離子濃度為0.01-50mM下，培養(yǎng)攜帶編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞或染色體中整合有編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的宿主細(xì)胞，從而表達出血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素；(b)從培養(yǎng)物中分離純化出血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌和酵母細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母。
4.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(a)包括二個階段(i)培養(yǎng)階段，其中鋅離子濃度為0.1-20mM；(ii)誘導(dǎo)階段，其中鋅離子濃度為0.1-20mM，pH為5-8。
5.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，在誘導(dǎo)階段，鋅離子濃度為0.5-5mM，pH為6-7。
6.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(a)之前還包括步驟制備種子液，其中鋅離子濃度為0.1-1mM。
7.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素包括人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素、鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，及其保持血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素生物活性的突變體。
8.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括超濾、層析。
9.如權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，在誘導(dǎo)階段還加入酪蛋白，以防止血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素被降解。
10.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的鋅離子是以選自下組的鋅鹽形式加入氯化鋅、硫酸鋅、乙酸鋅、或其混合物。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法，它包括步驟(a)在適合表達血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的條件且鋅離子濃度為0.01－50mM下，培養(yǎng)攜帶編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞或染色體中整合有編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因的宿主細(xì)胞，從而表達從血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素；(b)從培養(yǎng)物中分離純化出血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。本發(fā)明方法可大幅提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的產(chǎn)量。
文檔編號C12P21/02GKCN1436853SQ02110782
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月6日
發(fā)明者黃陽濱, 豐濤, 蔣劍 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan