專利名稱：信號(hào)傳導(dǎo)肽的制作方法
信號(hào)傳導(dǎo)肽 本發(fā)明涉及用作信號(hào)肽和膜錨定肽的新肽。這些肽來(lái)源于多種狂犬病毒株的糖蛋
白。本發(fā)明也提供編碼這種肽的核酸分子和載體以及使用這種核酸分子和載體表達(dá)指定從 宿主細(xì)胞分泌或錨定到細(xì)胞膜上的感興趣多肽的方法。本發(fā)明也特別相關(guān)于在各種原核和 真核體外系統(tǒng)或在動(dòng)物或人生物體中用于治療和預(yù)防目的的蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。 在過(guò)去二十年中，在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)內(nèi)重組多肽的制備已經(jīng)成為主要的挑戰(zhàn)之一。 幾個(gè)質(zhì)粒DNA和病毒載體已被制備和用于在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或活生物體內(nèi)表達(dá)核苷酸序
列，用于多種目的，包括接種疫苗，基因治療，免疫療法和在培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)制備重組多肽。
重組轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞分泌多肽通常是具有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)閺呐囵B(yǎng)上清液比從破壞細(xì) 胞釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中回收重組多肽的純化步驟容易。而 且，分泌也減少胞內(nèi)表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞或生物體可能具有的有害(例如毒性)作用。最終，通 過(guò)分泌途徑的易位也需要進(jìn)行翻譯后修飾和蛋白酶裂解，其在特定多肽的穩(wěn)定性，折疊，免 疫識(shí)別和生物學(xué)活性方面具有作用。 通常，分泌的多肽表達(dá)為前體，其包括在N末端的信號(hào)肽。信號(hào)肽通常由3個(gè)明顯 區(qū)域組成N末端和陽(yáng)性電荷區(qū)，中央疏水核心區(qū)和由信號(hào)肽酶識(shí)別的C末端裂解位點(diǎn)。信 號(hào)肽確保多肽前體有效的易位穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜。在提供成熟多肽(沒(méi)有信號(hào)肽的多肽) 的易位過(guò)程中信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切掉。 一旦多肽進(jìn)入ER，它被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，和之后的 分泌途徑的大量路線之一，其依賴于多肽的性質(zhì)和信號(hào)傳導(dǎo)肽(signaling p印tide)的存 在。例如，多肽可分泌到外部培養(yǎng)基中，或運(yùn)送到細(xì)胞區(qū)域如內(nèi)體和溶酶體區(qū)域或錨定到細(xì) 胞膜上。本領(lǐng)域已知大量翻譯后修飾發(fā)生在ER和高爾基體，如多肽的糖基化，二硫鍵形成 和蛋白酶解。不正確的翻譯后修飾典型地導(dǎo)致在生產(chǎn)異質(zhì)多肽產(chǎn)品中無(wú)活性多肽和無(wú)效的 信號(hào)肽酶裂解，其不能使用，特別是用于人類使用。 另一方面，先前已顯示通過(guò)以錨定在不同亞細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞膜上或細(xì)胞表面 的形式呈遞可增強(qiáng)免疫原性多肽的免疫原性活性(Andrew et al， 1990， J. Virol. 64， 4776-4783)，很可能通過(guò)改良的I類腿C I和/或II類腿C介導(dǎo)的到宿主免疫系統(tǒng)的呈 遞而進(jìn)行。例如，Ji等 (1999， Human Gene Ther. 10 :2727-2740)報(bào)道靶定人乳頭瘤病毒 (HPV)-16到內(nèi)體/溶酶體室增強(qiáng)它的抗腫瘤活性和允許在表達(dá)宿主生物體中增加腫瘤細(xì) 胞特異性CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。W099/03885揭示質(zhì)膜上靶 定HPV-16 E6和E7多肽允許改善它們的免疫原性潛力和因此它們?cè)谒拗魃矬w中的療效。 在細(xì)胞表面的膜結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和錨定涉及信號(hào)肽和膜錨定肽。 雖然，本領(lǐng)域中可獲得大量這樣的信號(hào)傳導(dǎo)肽，那些從狂犬病糖蛋白獲得的蛋白 質(zhì)證明特別是在痘病毒介導(dǎo)的表達(dá)中是有效的。因此，提供額外的信號(hào)傳導(dǎo)序列是有用的， 以確保通過(guò)細(xì)胞分泌途徑和/或信號(hào)肽酶裂解和/或轉(zhuǎn)運(yùn)和錨定到大量宿主細(xì)胞和生物體 的細(xì)胞膜的有效易位。 另外，編碼狂犬病糖蛋白衍生的本發(fā)明目的信號(hào)傳導(dǎo)肽的核酸序列已被工程化以 減少相互之間的同源性百分比小于75%，因此允許它們用于多基因表達(dá)載體，其表達(dá)的多 肽從宿主細(xì)胞分泌或錨定到細(xì)胞膜上例如質(zhì)膜以便于呈遞在細(xì)胞表面。但是，非常有限數(shù)量的有效的信號(hào)傳導(dǎo)肽、顯著的信號(hào)和膜錨定肽限制了從一個(gè)單載體表達(dá)的核酸序列 的數(shù)量。當(dāng)然，本領(lǐng)域已知，使用相同信號(hào)傳導(dǎo)肽指導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)和膜錨定由多基因表達(dá)載體編 碼的多肽的每一個(gè)可能導(dǎo)致這些同源序列之間的重組事件和包含于它們之中的核苷酸的 丟失(Matzke， M. ， Matzke， A. J. M. ， Scheid， 0. M. In HomologousRecombination and Gene Silencing in Plants ;Paszkowski， J.Ed. KluwerAcademic Publishers, Netherlands, 1994 ;pp 271-300)。這個(gè)不穩(wěn)定性問(wèn)題可導(dǎo)致載體原液不可用，特別是對(duì)于人的臨床實(shí)驗(yàn)。
如上所述，在本領(lǐng)域中需要為重組生產(chǎn)分泌的或膜錨定的多肽提供可選擇的信號(hào) 傳導(dǎo)肽，特別是在真核宿主細(xì)胞和生物體中。本發(fā)明為此需要提供了獲得自不同狂犬病病 毒株糖蛋白質(zhì)的新的肽作為信號(hào)肽和膜錨定肽。這種肽已證明在指導(dǎo)在真核細(xì)胞中表達(dá)自 痘病毒載體的感興趣多肽的分泌和膜錨定是高效的。此外，本發(fā)明也提供編碼這種肽的核 酸分子，其序列已被工程化以使其相互之間呈現(xiàn)小于75%的同源性百分比。使用這種工程 化的核酸分子提供表達(dá)自單一載體的多個(gè)感興趣多肽的分泌和膜錨定(當(dāng)同源序列存在 于這樣的載體構(gòu)建體中時(shí))顯著減少自然發(fā)生的同源重組事件的可能性。因此，本發(fā)明在 重組技術(shù)領(lǐng)域建立了一個(gè)重要工具，特別是在多基因表達(dá)載體用于分泌和膜呈遞多種多肽 中，特別是在真核宿主細(xì)胞中。 通過(guò)權(quán)利要求書中定義的實(shí)施方案解決了這個(gè)技術(shù)問(wèn)題。 本發(fā)明其他和進(jìn)一步的方面，特征和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)以下本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的描 述而變得明顯。這些實(shí)施方案僅是揭示目的。 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一個(gè)肽，其選自基本上由或由SEQID N0:1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列組成的肽組成的 組中。 如本文全文所用，除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"用于表示"至少一個(gè)"、"至少第一 個(gè)"、"一或多個(gè)"或"多個(gè)"參考的化合物或步驟。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"和/或"包括"和"、"或"和"所述術(shù)語(yǔ)連接的元件的所有或任 何其他組合"的意思。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"大約"或"近似"表示給出值或范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選10%以 內(nèi)，和更優(yōu)選5%以內(nèi)。 如本文所用，當(dāng)用于定義產(chǎn)品、組合物和方法時(shí)，術(shù)語(yǔ)"包含"應(yīng)表示所述產(chǎn)品、組 合物和方法包括提及的成分或步驟，但不排除其他的。"基本上由……組成"是指排除任何 實(shí)質(zhì)意義的其他成分或步驟。因此，基本上由所述成分組成的組合物將不排除微量污染物 和藥物可接受的載體。"由……組成"表示排除痕量元素以上的其他成分或步驟。例如，肽 "由氨基酸序列組成"是所述肽除了所述氨基酸序列之外不包任意氨基酸。肽"主要由氨基 酸序列組成"是這個(gè)氨基酸序列與僅僅少數(shù)額外氨基酸殘基(典型從大約1到大約10個(gè)左 右的額外殘基)共存。肽"包含"氨基酸序列是所述氨基酸序列是所述肽的最終氨基酸序 列的至少一部分。這樣的肽可具有多達(dá)幾百個(gè)額外氨基酸殘基。這樣的額外氨基酸殘基在 肽運(yùn)輸，促進(jìn)多肽生成或純化；延長(zhǎng)半衰期等方面發(fā)揮作用。這同樣可用于核苷酸序列。
在此使用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"指天然L-氨基酸，即20個(gè)遺傳編碼的氨基酸丙氨酸 (Ala或A)，纈氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)，異亮氨酸(Ile或I)，脯氨酸(Pro或P)， 甲硫氨酸(Met或M)，苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)，甘氨酸(GIy或G)，絲氨酸
5(Ser或S)，蘇氨酸(Thr或T)，半胱氨酸(Cys或C)，酪氨酸(Tyr或Y)，天冬酰胺(Asn或 N)，谷氨酰胺(Gin或Q)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，賴氨酸(Lys或K)，精氨 酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)以及其天然衍生物，如beta-丙氨酸，鳥氨酸，或甲硫氨 酸亞砜或例如通過(guò)附加甲基，甲?；阴；腔?，磷?；刃揎椧换蚨鄠€(gè)alpha-氨基， alpha-羧基或側(cè)鏈的氨基酸。 在此使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"，"肽"和"蛋白質(zhì)"可互換表示氨基酸殘基聚合物，其包含 通過(guò)肽鍵結(jié)合的9或更多個(gè)氨基酸。聚合物可以是線性的，分枝的或環(huán)形的。通常，如果氨 基酸聚合物長(zhǎng)(例如超過(guò)80個(gè)氨基酸殘基)，優(yōu)選地稱為多肽或蛋白質(zhì)。其結(jié)果是，"肽" 指長(zhǎng)度大約9到大約80個(gè)氨基酸的片段，最佳地大約10到大約75個(gè)氨基酸的片段，優(yōu)選 地大約20到大約70個(gè)氨基酸的片段，和更優(yōu)選地大約23到大約66個(gè)氨基酸的片段。肽 可包含一個(gè)選擇的天然蛋白質(zhì)的區(qū)域，如涉及多肽定位(例如定位多肽到特殊的細(xì)胞區(qū)域 或膜)的。術(shù)語(yǔ)"多肽/肽"的定義包含天然的和修飾的多肽/肽。 在此使用的術(shù)語(yǔ)"天然"指得自天然來(lái)源的材料(例如分離的，純化的)，與實(shí)驗(yàn)室 中人工修飾或改變的材料相區(qū)別。例如，天然多肽/肽是由存在于野生型生物體或細(xì)胞基 因組中的基因編碼。相反，修飾的多肽/肽是由在實(shí)驗(yàn)室中已被修飾的核酸分子編碼以不 同于天然多肽/肽，例如通過(guò)插入，缺失或取代一或多個(gè)氨基酸或這些可能性的任何組合。 當(dāng)考慮幾個(gè)修飾時(shí)，它們可涉及保守殘基和/或非連續(xù)殘基。"信號(hào)傳導(dǎo)肽"是一種肽，其使得能夠在給定宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)特異性定位包含 該肽的多肽。信號(hào)傳導(dǎo)肽的實(shí)例包括信號(hào)肽和膜錨定肽。 在此使用的"信號(hào)肽"或"信號(hào)序列"指一個(gè)氨基酸序列，其能夠起始其可操縱連 接的多肽通過(guò)至宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。通常，信號(hào)肽被內(nèi)肽酶切割(例如特異性ER定位 的信號(hào)肽酶)以釋放(成熟)多肽。典型地，信號(hào)肽的長(zhǎng)度范圍從大約10到大約40個(gè)氨 基酸，有利地大約15到大約30個(gè)氨基酸和優(yōu)選大約18到大約25個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選包括 Met起始物殘基的大約23個(gè)氨基酸。 在此使用的"膜錨定肽"指自然界中疏水的氨基酸序列，其能夠?qū)⑵淇刹倏v連接的 多肽錨定到細(xì)胞膜上，和特別是質(zhì)膜上。典型地，膜錨定肽的長(zhǎng)度范圍從大約20到大約85 個(gè)氨基酸，有利地大約25到大約75個(gè)氨基酸和優(yōu)選大約30到大約70個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選 大約66個(gè)氨基酸。優(yōu)選其含中央高度疏水結(jié)構(gòu)域，其能夠跨越細(xì)胞膜的脂雙層一或多次或 與膜的外表面相互作用。 在此使用的"嵌合"多肽指單條多肽鏈，其在天然序列內(nèi)的不同位置包含多肽/ 肽。構(gòu)成所述嵌合多肽的不同多肽/肽通常存在于自然界的分離的蛋白質(zhì)中，在嵌合多肽 中被連接在一起；或它們可存在于自然界中相同的蛋白質(zhì)，但是在嵌合多肽中具有不同排 列。例如，嵌合多肽可由獲得自不同來(lái)源地信號(hào)肽和感興趣多肽構(gòu)成。另一個(gè)嵌合多肽可 由信號(hào)肽，感興趣多肽和膜錨定肽構(gòu)成，其中感興趣多肽獲得自不同于信號(hào)肽和/或膜錨 定肽的來(lái)源。 術(shù)語(yǔ)"可操縱連接"指至少2個(gè)成分的并列，其中描述的組分處于允許它們以預(yù)期 的方式發(fā)揮功能的關(guān)系。例如如果啟動(dòng)子起始并使得能夠核苷酸序列轉(zhuǎn)錄以允許在宿主細(xì) 胞或生物體內(nèi)表達(dá)，則所述啟動(dòng)子是可操縱連接到所述核苷酸序列。信號(hào)肽是可操縱連接 到多肽上的，如果其起始和使得能夠使其易位通過(guò)ER和被切割以釋放所述多肽。膜錨定肽是可操縱連接到多肽上的，如果其能夠使其錨定到細(xì)胞膜，特別是質(zhì)膜上。 如本文所用，"載體"可以是在宿主細(xì)胞或生物體中能夠運(yùn)輸和表達(dá)核酸分子的任
意物質(zhì)。載體可以是染色體外(例如附加體)或整合(整合入宿主染色體)的、自主復(fù)制
或不是、多或低拷貝、雙鏈或單鏈、裸露或復(fù)合其他分子的(例如載體復(fù)合脂質(zhì)或聚合物以
形成特定結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體、脂復(fù)合物(lipoplexes)或納米微粒，包裝于病毒殼體的載體，和
固定在固相顆粒上的載體等)。 術(shù)語(yǔ)"核酸"，"核酸分子"，"多核苷酸"和"核苷酸序列"在本文可以互換使用，定義任意長(zhǎng)度的多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)或多聚核糖核苷酸(RNA)分子的聚合物或其任意組合。該定義包含單鏈或雙鏈、線性或環(huán)形、天然產(chǎn)生的或合成的多核苷酸。而且，這樣的多核苷酸可包含非天然產(chǎn)生的核苷酸(例如如美國(guó)5， 525， 711，美國(guó)4，711，955或EPA302 175中描述的甲基化核苷酸和核苷酸類似物)和化學(xué)修飾(例如見(jiàn)W0 92/03568 ;US5， 118,672)以增加核酸的體內(nèi)穩(wěn)定性，增強(qiáng)其運(yùn)輸，或減少來(lái)自宿主對(duì)象的清除率。如果存在，可在聚合之前或之后進(jìn)行修飾。 在此使用的術(shù)語(yǔ)"序列同源性"(或序列相同性)通常表示為百分比，表示彼此保留給定程度相同性的核苷酸序列?？紤]到需要引入以最佳化排列的缺口 (gap)數(shù)量和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，2個(gè)核苷酸序列之間的百分比同源性是序列共享的相同位置數(shù)量的函數(shù)。在本領(lǐng)域可獲得不同的計(jì)算機(jī)程序和數(shù)學(xué)算法確定核苷酸序列之間的百分比同源性例，例如GCG Wisconsin包和the Basic Local alignment Search Tool (BLAST)程序，其在NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)可公開獲得并在出版物中描述(例如Altschul等，1990， J. Mol. Biol. 215， 403-410)。 在此使用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"定義任何細(xì)胞，其可是或已經(jīng)是本發(fā)明載體的受體和這種細(xì)胞的子代。這個(gè)術(shù)語(yǔ)將被廣泛理解以至于包含分離的細(xì)胞， 一組細(xì)胞和特定的細(xì)胞組織，例如組織或器官中的。這種細(xì)胞可以是原代的，轉(zhuǎn)化的或培養(yǎng)的細(xì)胞。
在此使用的術(shù)語(yǔ)"生物體"指脊椎動(dòng)物，特別是許多的哺乳動(dòng)物和尤其是家畜，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sport animal)和包括人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供新的分離的肽，其呈現(xiàn)如上所定義的信號(hào)肽的功能性特性，其基本上由或由SEQ ID NO :1(MVPQVLLFVPLLGFPLCFGKFPI)或SEQ ID NO:2 (MVPQALLLVPLLGFSLCFGKFPI)所示的氨基酸序列組成。 更特別地，SEQ ID NO :1所示的信號(hào)肽來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)M38452所示的狂犬病毒ERA株糖蛋白前體N末端存在的信號(hào)肽。通常，天然的ERA株信號(hào)肽由SEQID NO :6(MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPI)的氨基酸序列組成并在2個(gè)位置不同于SEQ ID NO :1的信號(hào)肽，分別在位置5，其中天然肽中存在Ala殘基相對(duì)于本發(fā)明信號(hào)肽的Val殘基，和在位置13，其中天然肽中存在Val殘基相對(duì)于本發(fā)明信號(hào)肽的甘氨酸。
SEQ ID NO :2所示的信號(hào)肽來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)ay009097所示的狂犬病毒PG株糖蛋白前體N末端存在的信號(hào)肽。通常，天然的PG株信號(hào)肽由SEQ ID NO:7(MVPLALLLVPLLGFSLCFGKFPI)的氨基酸序列組成并在位置4不同于SEQ ID NO :2的信號(hào)肽，其中天然肽中存在Leu殘基相對(duì)于本發(fā)明信號(hào)肽的Gin殘基。 如果需要，本發(fā)明的肽可被修飾，條件是修飾不改變信號(hào)肽活性。例如，可缺失起始物Met殘基(如果被表達(dá)的多肽含有它)。
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本發(fā)明也提供了基本上由或由SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列組
成的肽作為信號(hào)肽的應(yīng)用。本發(fā)明的肽可以單獨(dú)地使用，組合任意額外信號(hào)肽，特別是本文
所述的膜錨定肽以起始或能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)和錨定感興趣多肽到細(xì)胞膜上。 本發(fā)明也提供了新的分離的肽，其呈現(xiàn)以上定義的膜錨定肽的功能性性質(zhì)，其基
本上由或由SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列組成。
Q ID NO :3);
Q ID NO :4);
Q ID NO :5)。 更特別地，SEQ ID NO :3所示的膜錨定肽來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄ay009097揭示的狂犬病毒PG株糖蛋白C末端存在的膜錨定肽。通常，天然的PG株膜錨定肽由SEQ
氨基酸序列組成并在3個(gè)位置不同于SEQ ID NO :3的膜錨定肽。 SEQ ID NO :4所示的膜錨定肽來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)S72465揭示的狂犬病毒Nishigahara株糖蛋白C末端存在的膜錨定肽。通常，天然的Nishigahara株膜錨
SGGETGL)的氨基酸序列組成和在3個(gè)位置不同于SEQ ID NO :4的膜錨定肽。 SEQ ID NO :5所示的膜錨定肽來(lái)源于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)u11751揭示的狂
犬病毒北極狐(artic fox)株糖蛋白C末端存在的膜錨定肽。通常，天然的北極狐株膜錨
KSGGETRL)的氨基酸序列組成和在位置58不同于SEQ ID NO :5的膜錨定肽，其中在天然肽中存在Tyr殘基相對(duì)于在本發(fā)明膜錨定肽的His殘基。 如果需要，本發(fā)明的肽可被修飾，條件是修飾不改變膜錨定肽活性。本發(fā)明也提供了基本上由或由SEQ ID N0:3，SEQ ID NO :4或SEQ IDNO :5所示氨
基酸序列組成的肽作為膜錨定肽的應(yīng)用。本發(fā)明的肽可以單獨(dú)使用，組合一或多個(gè)本文所
述的信號(hào)傳導(dǎo)肽、優(yōu)選信號(hào)肽以能夠錨定感興趣多肽到細(xì)胞膜上。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽允許
感興趣多肽錨定到質(zhì)膜上以便它可以與其他細(xì)胞表面或存在于細(xì)胞外介質(zhì)的其他分子相
互作用。 本發(fā)明也提供了嵌合多肽，其包含感興趣多肽和(i)本發(fā)明的肽，其基本上由或由SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列組成或(ii)本發(fā)明的肽，其基本上由或由SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列組成或(iii)本發(fā)明的基本上由或由SEQ ID NO :1或SEQID NO :2所示氨基酸序列組成的肽和基本上由或由SEQID NO :3， SEQ IDNO :4或SEQ ID NO :5所示氨基酸序列組成的肽二者。
可以通過(guò)化學(xué)合成或遺傳方式即通過(guò)框內(nèi)融合編碼構(gòu)成嵌合多肽的每個(gè)不同的多肽/肽的核苷酸序列產(chǎn)生嵌合多肽。"框內(nèi)融合"，其表示融合的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生其中沒(méi)有任何翻譯終止子的單多肽鏈。融合可以是直接(例如編碼每個(gè)多肽/肽的密碼子是連續(xù)的，中間沒(méi)有任何外部密碼子)或通過(guò)接頭(在構(gòu)成嵌合多肽的2個(gè)多肽/肽的連接處)。接頭的存在可促進(jìn)嵌合多肽的正確形成，折疊和/或功能或通過(guò)導(dǎo)入一或多個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)促進(jìn)克隆步驟。通常，接頭是2到30個(gè)氨基酸長(zhǎng)和由氨基酸殘基如甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，丙氨酸和/或脯氨酸組成。適合的肽接頭的有代表性的實(shí)例包括〃 Ser-Gly-Ser〃 ，〃 Gly-Ser-Gly〃 ，〃 Ser-Gly〃 ，〃 Gly-Ser〃和其核苷酸序列編碼一或多個(gè)限制性位點(diǎn)的接頭，特別適于插入多肽編碼核苷酸序列(例如〃 Gly-Ser〃接頭，其核苷酸序列〃 GGATCC〃編碼BamHI限制性位點(diǎn))。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本上由或由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2(信號(hào)肽)的氨基酸序列組成的本發(fā)明的肽連接在嵌合多肽的氨基末端，即在感興趣多肽的第一個(gè)殘基之前的位置(起始物Met殘基包含于本發(fā)明信號(hào)肽中)。 在本實(shí)施方案的一個(gè)方面，本發(fā)明的嵌合多肽沒(méi)有其他信號(hào)傳導(dǎo)肽，以使得感興趣多肽從宿主細(xì)胞分泌進(jìn)外部介質(zhì)(例如培養(yǎng)基)。 在本實(shí)施方案的另一個(gè)且優(yōu)選的方面，本發(fā)明的嵌合多肽包含至少一個(gè)額外的信號(hào)傳導(dǎo)肽，特別是膜錨定肽以能夠錨定感興趣多肽到細(xì)胞膜上，特別是質(zhì)膜上，導(dǎo)致其在細(xì)胞表面呈遞。優(yōu)選地，膜錨定肽連接到感興趣多肽的羧基末端或C末端部分內(nèi)。羧基末端指多肽最后的氨基酸殘基(殘基由STOP密碼子之前的密碼子編碼)，而C末端部分指包含于多肽的最后的第3個(gè)的部分(假定多肽被分成3個(gè)部分，N末端，中央和C末端部分，每個(gè)大約占全部多肽的三分之一)。優(yōu)選地，C末端部分包含在最后100個(gè)殘基內(nèi)，更優(yōu)選地是給定多肽羧基末端之前的最后50個(gè)殘基內(nèi)。在本發(fā)明中適合使用的膜錨定肽可以獲得或分離自與細(xì)胞膜天然結(jié)合的任何細(xì)胞或病毒蛋白質(zhì)或多肽。在本領(lǐng)域技術(shù)人員可公開獲得的文獻(xiàn)中大量描述了這樣的膜結(jié)合蛋白(見(jiàn)例如Branden and Tooze， 1991， in Introductionto ProteinStructure p. 202_214，NY Garland)?？梢愿貏e地引用狂犬病糖蛋白，HIV病毒包膜糖蛋白和麻疹病毒F蛋白。 優(yōu)選地，包含于本發(fā)明嵌合多肽中的膜錨定肽是基本上由或由SEQ IDN0:3，4或5任一所示的氨基酸序列組成的本發(fā)明的膜錨定肽。更優(yōu)選地，本發(fā)明的嵌合多肽包括由SEQID N0:2所示氨基酸序列組成的信號(hào)肽和由SEQ ID NO :3所示氨基酸序列組成的膜錨定肽?；蛘?，本發(fā)明的嵌合多肽包括由SEQ ID NO:l所示氨基酸序列組成的信號(hào)肽和由SEQID N0:5所示氨基酸序列組成的膜錨定肽。 在此描述的信號(hào)肽和膜錨定肽來(lái)源于狂犬病糖蛋白，包含于本發(fā)明嵌合多肽中的感興趣多肽優(yōu)選與狂犬病病毒異源。在此使用的"與狂犬病病毒異源"的多肽指不與野生型狂犬病病毒天然相關(guān)或由野生型狂犬病病毒基因組編碼的多肽。 適合的感興趣多肽包括例如具有商業(yè)或研究?jī)r(jià)值的多肽以及能夠在呈現(xiàn)或傾向于呈現(xiàn)疾病或紊亂的宿主生物體中提供治療或保護(hù)活性的多肽。例如，感興趣多肽可選自以下一組中激素，細(xì)胞因子，免疫原，受體，伴侶分子，免疫球蛋白，酶，生長(zhǎng)因子，熒光蛋白如GFP，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如黃素氧還蛋白，珠蛋白，和金屬硫蛋白，毒素，自殺基因產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)蛋白，和抑制劑如蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明中，感興趣多肽優(yōu)選選自以下一組中免疫原性多肽和抗腫瘤多肽。"免疫原性"多肽指能夠在其表達(dá)的宿主生物體中誘導(dǎo)，剌激，發(fā)展或加強(qiáng)免疫系統(tǒng)的多肽。這樣的免疫反應(yīng)可以是體液或細(xì)胞或同時(shí)是體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。體液反應(yīng)引起抗研究多肽的抗體產(chǎn)生，而細(xì)胞反應(yīng)引起T輔助細(xì)胞和/或CTL反應(yīng)和/或剌激細(xì)胞因子產(chǎn)生。典型地，通過(guò)大量本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定(可獲得的評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)的起始和激活的技術(shù)的一般描述見(jiàn)例如最新版Coligan等，Current Protocols in Immunology ;ed J Wiley& Sonslnc，National Institute of Health)可以在體內(nèi)或體外評(píng)價(jià)多肽的免疫原性性質(zhì)。例如，檢測(cè)可以是比色法，熒光法或放射性的和適合的技術(shù)包括ELISA， Western印跡，放射免疫測(cè)定和免疫沉淀測(cè)定。通過(guò)測(cè)量由包括來(lái)源于CD4+和CD8+T細(xì)胞的激活的效應(yīng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子譜(例如通過(guò)ELIspot量化產(chǎn)生IFNg的細(xì)胞)、通過(guò)確定免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化狀態(tài)(例如通過(guò)經(jīng)典的[3H]胸苷吸收的T細(xì)胞增殖測(cè)定)、通過(guò)在敏化事物中測(cè)定抗原特異性T淋巴細(xì)胞(例如在細(xì)胞毒性測(cè)定中肽特異性裂解)可進(jìn)行細(xì)胞免疫的測(cè)定。通過(guò)ELIspot，基于四聚體的分析技術(shù)或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，在適合的動(dòng)物模型中也可以評(píng)價(jià)多肽的免疫原性性質(zhì)。適合的免疫原性多肽可獲得自乙型肝炎病毒(HBV)(例如，在EP 414 374 ;EP 304578或EP 198 474中描述的S， preS2或preSl-多月太);丙型肝炎病毒(HCV)(例如，核心C，包膜糖蛋白El， E2，非結(jié)構(gòu)多肽NS2， NS3， NS4或NS5或其任意組合)；人類免疫缺陷病毒(HIV)(例如gpl20或gpl60)，和乳頭瘤病毒。
包含在本發(fā)明嵌合多肽中的乳頭瘤病毒免疫原性多肽可以是早期，晚期或其任意組合。早期乳頭瘤病毒多肽包括E1，E2，E4，E5，E6和E7，而晚期多肽可以是L1或L2。其優(yōu)選獲得自選自HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51,HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59，HPV-66，HPV-68，HPV-70和HPV-85組的乳頭瘤病毒。文獻(xiàn)中已描述并可在專門的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得大量乳頭瘤病毒基因組的核苷酸序列和編碼多肽的氨基酸序列。通常，HPV-16基因組在Genbank中以登錄號(hào)NCJ)1526和K02718描述；HPV-18以NC_001357和X05015描述；HPV_31以J04353描述；HPV_33以M12732描述；HPV_35以NC—001529描述；HPV-39以NC—001535描述;HPV_45以X74479描述；HPV_51以NC—001533描述；HPV-52以NC_001592描述；HPV_56以X74483描述；HPV_58以D90400描述；HPV_59以NC—001635描述；HPV-68以X67160和M73258描述;HPV_70以U21941描述;禾口 HPV-85以AF131950描述。但是，本發(fā)明不限于這些示例的序列。事實(shí)上，在不同乳頭瘤病毒分離株之間觀察到的天然突遺傳變體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也包含如文獻(xiàn)中描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的非天然修飾(見(jiàn)例如Yasugi等.1997， J. Virol 71， 5942-51描述了修飾的El多月太;Sakai等 ， 1996， J. Virol. 70， 1602-1611描述了修飾的E2多肽和W099/03885描述了修飾的E6和E7多肽，適用于本發(fā)明)。"抗腫瘤"多肽指能夠提供腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增抑制或凈減少的多肽。通過(guò)在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中或處理的對(duì)象中在一段時(shí)間中實(shí)際腫瘤大小的減少可確定多肽的抗腫瘤性質(zhì)?？墒褂枚喾N方法評(píng)價(jià)腫瘤大小，包括輻射方法(例如，單光子或正電子發(fā)射斷層掃描，通常見(jiàn)"Nuclear Medicine in Clinical0ncology， 〃 Winkler， C. (ed.) Springer-Verlag,New York, 1986)，方法使用常規(guī)成像試劑(例如鎵-67擰檬酸鹽)，免疫學(xué)方法(例如放射性標(biāo)記的針對(duì)特異腫瘤抗原的單克隆抗體)以及超聲方法(見(jiàn)"UltrasonicDifferentialDiagnosis of Tumors" ， Kossoff and Fukuda， (eds.)， Igaku-Shoin， NewYork, 1984)?；蛘?，可以基于腫瘤標(biāo)記物存在的減少確定多肽的抗腫瘤性質(zhì)。實(shí)例包括PSA檢測(cè)前列腺癌和CEA檢測(cè)結(jié)腸直腸癌和某些乳腺癌。進(jìn)一步，在適合的動(dòng)物模型中例如使用注射典型的人癌細(xì)胞系的小鼠可確定多肽的抗腫瘤性質(zhì)?？捎|摸的腫瘤發(fā)育之后，小鼠注射本發(fā)明載體，然后監(jiān)測(cè)降低的腫瘤生長(zhǎng)率和增加的存活。另外，大量的體外方法可用于
10預(yù)測(cè)體內(nèi)腫瘤抑制。適合的抗腫瘤多肽包括腫瘤相關(guān)抗原(TAA)例如MUC-l (W092/07000 ; Acres et al，2005， Exp. Rev. Vaccines 4 (4))， BRCA-l， BRCA-2(Palma et al. ，2006， Critical Reviews in Oncology/haematology 27， 1-23)，癌胚抗原CEA (Conroy et al.， 1995， Gene Ther ;2， 59-65) ， MAGE (W099/40188 ;DePlaen et al. ， 1994， I匪nogenetics 40，360-369) ，MART-l，gp 100(Bakker etal. ，1994，J. Exp. Med. 179，1005-9)，PRAME，BAGE， Lage(也已知為NY Eosl) SAGE， HAGE (W099/53061) ， GAGE (Robbins and Kawakami， 1996. Current Opinions in Immunol. 8， 628-36)和前列腺特異性抗原(PSA) (Ferguson, et al.， 1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,3114-9 ;W098/12302， W098/20117和W000/04149)以及 來(lái)自具有腫瘤誘導(dǎo)潛能的病毒的病毒多肽。 本發(fā)明也提供了分離的核酸分子，包含、基本上由或由編碼本發(fā)明肽或本發(fā)明嵌 合多肽的至少一個(gè)核苷酸序列或組成。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含SEQID NO: 11-28中任一所示的至少一個(gè)核苷酸序列。 更特別地，SEQ ID NO:ll，SEQ ID N0:14和SEQ ID NO : 15的核苷酸序列編碼具有 SEQ ID NO :1的氨基酸序列的信號(hào)肽，SEQ ID NO :12的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO :2 的氨基酸序列的信號(hào)肽，SEQ IDNO :13的核苷酸序列編碼存在于Nishigahara株狂犬病糖 蛋白的信號(hào)肽(UniProt登錄號(hào)S72465中揭示)和SEQ ID NO :16的核苷酸序列編碼存在 于ERA株狂犬病糖蛋白的信號(hào)肽(UniProt登錄號(hào)M38452中揭示)。 SEQ ID NO :17和SEQ ID NO :22所示核苷酸序列編碼存在于PG株狂犬病糖蛋白 中的天然膜錨定肽(UniProt登錄號(hào)ay009097中揭示)；SEQ IDNO : 18所示核苷酸序列編碼 具有SEQ ID N0:3氨基酸序列的膜錨定肽；SEQ ID NO :19所示核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO :4氨基酸序列的膜錨定肽；SEQ ID NO :20和21所示核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO :5 的氨基酸序列的膜錨定肽。 SEQ ID NO :23(M38452，vl)的核苷酸序列包含通過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO: 17的核苷酸序列的SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列；SEQ ID NO :24的核苷酸序列包含通 過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO :18的核苷酸序列的SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列；SEQ ID NO :25的核苷酸序列包含通過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO :19的核苷酸序列的SEQID NO :13所示的核苷酸序列；SEQ ID N0:26的核苷酸序列包含通過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO :20的核苷酸序列的SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列；SEQ ID NO :27的核苷酸序列包 含通過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO :21的核苷酸序列的SEQ ID NO :15所示的核苷酸序 列；和SEQ ID NO :28的核苷酸序列包含通過(guò)BamHI接頭連接到SEQ ID NO :22的核苷酸序 列的SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列。 而且，已工程化SEQ ID NO :23_28的核苷酸序列以減少彼此之間的同源性百分比 少于75%，如所附實(shí)施例部分所述，因此在多基因表達(dá)載體中允許聯(lián)合使用至少兩種這種 序列以能夠分泌和/或膜錨定多個(gè)感興趣多肽。當(dāng)多個(gè)多肽需要從一個(gè)單載體表達(dá)和分泌 和/或轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上時(shí)，聯(lián)合使用本發(fā)明的核苷酸序列具有優(yōu)勢(shì)。當(dāng)同源序列存在于同 一載體上時(shí)，使用本發(fā)明的核苷酸序列允許減少可能發(fā)生的同源性重組事件的風(fēng)險(xiǎn)。本領(lǐng) 域已知天然的狂犬病信號(hào)傳導(dǎo)序列與它們之間呈現(xiàn)高度的同源性，這種同源性阻礙它們的 聯(lián)合使用，其可負(fù)面影響載體穩(wěn)定性和導(dǎo)致不適合人類使用的載體原液。
通過(guò)修飾密碼子使用模式，典型地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的2個(gè)核酸分子之間的同源性百分 比的減少。作為起點(diǎn)，可以使用修飾之前核酸分子之間的序列排列以揭示其同源性部分。遺 傳密碼的簡(jiǎn)并用于減少這種同源性部分中的同源性百分比到少于75%。但是甲硫氨酸和色 氨酸殘基每個(gè)由唯一的核酸三聯(lián)體編碼(即密碼子)，不同的密碼子可用于編碼18個(gè)其他 氨基酸(遺傳密碼的簡(jiǎn)并)。通過(guò)使用其他密碼子替代一或多個(gè)"天然"密碼子典型地進(jìn)行 密碼子使用模式的修飾。例如，使用編碼Arg的CGC密碼子替代編碼Arg的AGA密碼子將 在密碼子的3個(gè)位置中的2個(gè)上減少同源性。不需要簡(jiǎn)并所有天然密碼子，因?yàn)椴糠痔娲?可充分減少同源性。 而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)一步修飾揭示的核苷酸序列。例如，編碼存在于信號(hào)肽 N末端的起始物Met殘基的第一個(gè)密碼子和/或編碼存在于膜錨定肽C末端的TGA STOP密 碼子的最后密碼子可被缺失，如果感興趣多肽被裝備這樣的調(diào)節(jié)密碼子。而且，也可能將存 在于信號(hào)和膜錨定序列連接處的BamHI接頭用另一個(gè)含限制性位點(diǎn)更適合克隆多肽編碼 核苷酸序列的接頭取代。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼感興趣多肽的核苷酸序列包含在本發(fā)明的核酸分 子內(nèi)的編碼信號(hào)肽的核苷酸序列(SEQ ID NO :11-16中定義)和編碼膜錨定肽的核苷酸序 列(SEQ ID NO :17-22中定義)之間的連接處。更優(yōu)選地，它在SEQ ID NO :23-28的BamHI 接頭內(nèi)大約位置70和大約位置76之間插入。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子被置于恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件的控制下 以確保其在給定的宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"指任意序列，其 允許、有助于或調(diào)節(jié)核酸分子在給定的宿主細(xì)胞中的表達(dá)，包括復(fù)制，重復(fù)，轉(zhuǎn)錄，剪接，翻 譯，穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)運(yùn)核酸或其任意衍生物(例如mRNA)進(jìn)入宿主細(xì)胞。這樣的調(diào)節(jié)序列在 本令頁(yè)域已知(見(jiàn)例如Goeddel， 1990，Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185， Academic Press, San Diego)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到調(diào)節(jié)序列的選擇可依賴于因 素如載體類型，宿主細(xì)胞，所需表達(dá)水平等。 啟動(dòng)子是特別重要的，本發(fā)明包括使用在許多類型宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核酸分子的表 達(dá)的組成型啟動(dòng)子和僅在某些宿主細(xì)胞中(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)或在應(yīng)答特異性事 件或外源因子(例如溫度，營(yíng)養(yǎng)添加劑，激素或其他配體)時(shí)指導(dǎo)表達(dá)的那些。在真核系統(tǒng) 中適合組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子如SV40啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期 啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(Boshart et al. ， 1985， Cell 41， 521-530)，腺病毒早期和晚期啟動(dòng)子，單 純皰疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(例如MoMuLV 和Rous肉瘤病毒(RSV)LTR)以及細(xì)胞啟動(dòng)子如甘油磷酸激酶(PGK)啟動(dòng)子(Hitzeman et al.，1983， Science 219，620-625 ;Adra et al. ， 1987， Gene 60,65-74)。用于驅(qū)動(dòng)痘病毒 載體中的核酸分子表達(dá)的適合的啟動(dòng)子包括痘苗病毒的7. 5K， H5R， TK， p28， pll或K1L啟 動(dòng)子。或者，可使用合成啟動(dòng)子如Chakrabarti等(1997，Biotechniques 23,1094-1097)， Hammond et al. (1997， J. Virological Methods 66， 135—138)禾口 Kumar禾口 Boyle (1990， Virology 179,151-158)描述的那些以及早期和晚期痘病毒啟動(dòng)子之間的嵌合啟動(dòng)子。
可誘導(dǎo)啟動(dòng)子由外源提供的化合物調(diào)節(jié)，包括但不僅限于鋅誘導(dǎo)型金屬硫蛋白 (MT)啟動(dòng)子(Mc Ivor et al. ， 1987， Mol. Cell Biol. 7，838-848)，地塞米松(Dex) i秀導(dǎo) 型小鼠乳腺腫瘤病毒(匪TV)啟動(dòng)子，T7聚合酶啟動(dòng)子系統(tǒng)(W0 98/10088)，蛻皮激素昆
12蟲啟動(dòng)子(No et al. ，1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 3346-3351)，四環(huán)素阻抑啟動(dòng) 子(Gossen et al. ， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 5547-5551)，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子(Kim et al. ， 1995， J. Virol. 69， 2565-2573) ， RU486誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Wang et al.， 1997， Nat. Biotech. 15,239-243 and Wang et al. ，1997， Gene Ther. 4， 432-441)，雷帕霉 素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Magari et al. ，1997， J.Clin. Invest. 100,2865-2872)和來(lái)自大腸桿菌 (E. coli)的lac， TRP，和TAC啟動(dòng)子。 本發(fā)明使用的調(diào)節(jié)序列也可以是組織特異性的以驅(qū)動(dòng)核酸分子在期望治療益處 的特異性組織中表達(dá)。合適的啟動(dòng)子可得自優(yōu)先在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的基因。例如通過(guò)展示 和比較基因組雜交可鑒定這種基因(見(jiàn)例如US5， 759， 776和5， 776， 683)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到控制核酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)元件還可包含額外元件用于 正確起始，調(diào)節(jié)和/或終止轉(zhuǎn)錄(例如polyA轉(zhuǎn)錄終止序列)，mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)(例如核定位信號(hào) 序列)，加工(例如剪接信號(hào))，穩(wěn)定性(例如內(nèi)含子和非編碼5'和3'序列)和翻譯(例 如三聯(lián)前導(dǎo)序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Shine-Dalgamo序列等)進(jìn)宿主細(xì)胞或生物體。
本發(fā)明也提供用于表達(dá)一或多個(gè)本發(fā)明嵌合多肽的載體。有利地，本發(fā)明載體包 含一或多個(gè)在此描述的核酸分子，優(yōu)選2， 3或甚至4個(gè)核酸分子。期望地，每個(gè)插入本發(fā)明 載體的核酸分子至少在信號(hào)肽，膜錨定肽和/或其編碼的感興趣多肽上不同。優(yōu)選地，本發(fā) 明的載體包含2，3，4或甚至更多的編碼信號(hào)肽和膜錨定肽的核苷酸序列，其彼此之間呈現(xiàn) 的同源性百分比少于75% (例如選自SEQ ID NO :23-28組成的組中)。更優(yōu)選地，本發(fā)明 載體包含SEQ ID N0:24的核苷酸序列以能夠表達(dá)第一個(gè)感興趣多肽到細(xì)胞膜和包含SEQ ID NO :28的核苷酸序列以能夠表達(dá)第二個(gè)感興趣多肽到細(xì)胞膜上。 多種載體系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明的嵌合多肽，包括適于原核細(xì)胞(例如大腸桿菌 或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))的噬菌體、質(zhì)粒或粘粒；適于酵母宿主細(xì)胞(例如 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、巴斯德畢 赤氏酵母(Pichia pastoris))的酵母表達(dá)載體；適于昆蟲宿主細(xì)胞(例如SF9細(xì)胞)的病 毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)；適于植物細(xì)胞的病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV ; 煙草花葉病毒TMV)或適于植物細(xì)胞的質(zhì)粒載體(例如Ti質(zhì)粒)；或適于高等真核宿主細(xì) 胞或生物體的質(zhì)粒或病毒載體。 適合在原核系統(tǒng)中使用的載體包括但不限于pBR322(Gibco BRL) ， pUC(Gibco BRU ， pBluescript(Stratagene)， p Poly(Lathe et al，1987，Gene 57,193-201)， pTrc(Ama皿et al. ， 1988， Gene 69,301-315) ;pET lld(Studier etal. ， 1990， Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185，60-89) ;pIN(Inouye et al.， 1985， Nucleic Acids Res. 13，3101-3109 ;Van Heeke et al. ，1989， J.Biol. Chem. 264， 5503-5509)和pGEX載體，其中本發(fā)明的核酸分子可以與谷胱甘肽S_轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合 形式表達(dá)。 適合在酵母(例如釀酒酵母)中表達(dá)的載體包括但不限于pY印Secl(Baldari et al. ，1987， EMB0 J. 6，229-234)， pMFa(Kujan et al. ，1982， Cell 30,933-943)， pJRY88(Schultz et al. ，1987 ;Gene 54，113-123)， pYES2 (InvitrogenCorporation， San Diego，Calif.)和pTEF-MF(Dualsystems Biotech Productcode :P03303)。
適合在真核宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá)的載體可以是病毒或非病毒的(例如質(zhì)
13粒DNA)。適合的質(zhì)粒載體包括但不限于pREP4， pCEP4 (Invitrogene) ， pCI (Promega)， pCDM8 (Seed,1987， Nature 329,840)禾口 pMT2PC(Kaufman et al. ，1987， EMBO J. 6， 187-195)， pVAX禾口pgWiz(GeneTherapy System Inc ;Himoudi et al. ， 2002， J. Virol. 76， 12735-12746)。在此使用的"病毒載體"具有本領(lǐng)域已知的意義。其指任意的包含至少一 個(gè)病毒來(lái)源元件的載體，包括完全的病毒基因組，其部分或以下描述的修飾的病毒基因組 以及其產(chǎn)生的病毒顆粒(例如病毒載體包裝進(jìn)病毒殼體以產(chǎn)生感染性病毒顆粒)。本發(fā)明 的病毒載體可以是復(fù)制型或可以是遺傳缺陷的以便是復(fù)制缺陷的或復(fù)制受損的。在此使用 的術(shù)語(yǔ)"復(fù)制型"包含選擇性復(fù)制和條件性復(fù)制病毒載體，其被工程化以更好地復(fù)制或可選 擇地在特異宿主細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)中復(fù)制。病毒載體可以得自大量不同的病毒，特別 是得自選自逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒(AAV)，痘病毒，皰疹病毒，麻疹病毒和泡沫病 毒一組中的病毒。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是腺病毒載體(綜述見(jiàn)〃 Adenoviralvectors for gene ther即y" ，2002， Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press)。其可會(huì)g來(lái)源 于任何人類或動(dòng)物腺病毒。在本發(fā)明中可使用任何的血清型和亞群。可引用更獨(dú)特的亞群 A (例如血清型12， 18，和31)，亞群B (例如血清型3， 7， 11， 14， 16， 21， 34，和35)，亞群C (例 如血清型l'2，5，和6)，亞群D(例如血清型8， 9， 10， 13， 15， 17， 19， 20， 22-30， 32， 33， 36-39， 和42-47)，亞群E (血清型4)，亞群F (血清型40和41)。特別優(yōu)選地是人腺病毒2 (Ad2)， 5 (Ad5) ， 6 (Ad6) ， 11 (Adl 1) ， 24 (Ad24)和35 (Ad35)。這種腺病毒可獲得自在美國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心(ATCC， Rockville， Md.)并已有大量出版物主題描述它們的序列，構(gòu)成和生產(chǎn)方 法，允許本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用它們(見(jiàn)例如US 6， 133， 028 ;US 6， 110， 735 ;W002/40665 ;W0 00/50573 ;EP 1016711 ;Vogels et al，2003，J.Virol. 77，8263-8271)。
本發(fā)明的腺載體可以是復(fù)制型的。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易獲得大量復(fù)制型腺病毒 載體的實(shí)例(見(jiàn)例如Hernandez-Alcoceba et al. ， 2000， HumanGene Ther. 11， 2009-2024 ; Nemunaitis et al. ，2001， Gene Ther.8，746-759 ;Alemany et al. ，2000， Nature Biotechnology 18， 723-727 ;W000/24408 ;US5， 998， 205， W099/25860, US5， 698， 443， W000/46355, W000/15820和W001/36650)。 或者，本發(fā)明的腺病毒載體可以是復(fù)制缺陷型的(見(jiàn)例如W094/28152)。優(yōu)選的 復(fù)制缺陷型腺病毒載體是El缺陷的(例如US 6， 136， 594和US6， 013， 638)，帶有從大約 459位置延伸到3328位置或從大約459位置延伸到3510位置(參考在GeneBank登錄號(hào)M 73260揭示的人腺病毒類型5的序列和Chroboczek et al. ，1992， Virol. 186， 280-285中) 的E1缺失。通過(guò)缺失腺病毒基因組的額外部分(例如Lusky et al. ， 1998， J. Virol 72， 2022-2032描述的在非必需E3區(qū)或其他必需E2， E4區(qū))還可改善克隆容量和安全性。
本發(fā)明的核酸分子可以插入腺病毒載體的任何位置，如Chartier等(1996， J. Virol. 70,4805-4810)描述和以相對(duì)于插入?yún)^(qū)天然轉(zhuǎn)錄方向的正義和/或反義方向放 置。例如，其可插入替代El區(qū)或可選擇地替代E3區(qū)。 在另 一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是痘病毒載體(見(jiàn)例如Cox et al. in" Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos， Carolina Academic Press)。 其可得自任何痘病毒科成員，特別是金絲雀痘病毒(例如W095/27780描述的ALVAC)， 禽痘病毒(例如Paoletti et al. ， 1995， Dev. Biol. Stand. 84， 159-163描述的TR0VAC)或痘苗病毒，優(yōu)選后者。適合的痘苗病毒可選自Copenhagen株(Goebel et al. ， 1990， Virol.179,247-266 and 517-563 ;Johnsonet al. ，1993， Virol.196,381-401)， Wyeth株， NYVAC(見(jiàn)W092/15672和Tartaglia et al. ， 1992， Virology 188， 217-232)和高減毒修 飾的Ankara(MVA)株(Mayr et al. ， 1975， Infection 3，6_16)組成的組中。這種載體禾口 生產(chǎn)方法在大量本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的文件中描述(例如Paul et al. ，2002， Cancer geneTher. 9,470-477 ;Piccini et al. ，1987， Methods of Enzymology 153，545-563 ;US 4，769，330;US 4， 772， 848 ;US 4，603，112;US 5， 100， 587和US 5,179,993)。本發(fā)明的核 酸分子優(yōu)選插入痘病毒基因組的非必需基因座以便于重組痘病毒保持活性和感染性。非必 需區(qū)是非編碼基因間區(qū)域或任意基因，其失活或缺失不顯著消弱病毒生長(zhǎng)，復(fù)制或感染。可 以預(yù)計(jì)插入必需病毒基因座，條件是在生產(chǎn)病毒顆粒過(guò)程中反式補(bǔ)充缺陷的功能，例如通 過(guò)使用輔助細(xì)胞系，其攜帶相應(yīng)于痘病毒基因組缺失的序列的互補(bǔ)序列。
當(dāng)使用Copenhagen痘苗病毒時(shí)，核酸分子優(yōu)選插入胸苷激酶基因(tk) (Hruby et al.，1983' Proc. Natl. Acad. Sci USA 80， 3411—3415 ;Weir et al. ， 1983， J. Virol. 46， 530-537)。但是，其它插入位點(diǎn)也是恰當(dāng)?shù)?，例如在血凝素基因?nèi)(Guo et al. ， 1989， J. Virol. 63，4189-4198)，在K1L基因座內(nèi)，在u基因(Zhouet al. ， 1990， J. Gen. Virol. 71， 2185-2190)或痘苗病毒基因組的左末端，其中在文獻(xiàn)中已報(bào)道了大量自發(fā)或工程化 的缺失(Altenburger et al. ，1989， ArchivesVirol. 105，15_27 ;Moss et al. 1981， J. Virol. 40,387-395 ;Panicali et al. ，1981， J. Virol. 37，1000-1010 ;Perkus et al， 1989， J. Virol. 63,3829-3836 ;Perkus et al，1990， Virol. 179，276-286 ;Perkus et al， 1991， Virol. 180,406-410)。 當(dāng)使用MVA時(shí)，核酸分子可插入出現(xiàn)在MVA基因組中的已鑒定的缺失I到VII的 任意一個(gè)(Antoine et al. ， 1998，Virology 244,365-396)以及D4R基因座中，但是插入缺 失II和/或III是優(yōu)選的(Meyer et al. ， 1991， J. Gen. Virol. 72， 1031-1038 ;Sutter et al. ，1994，Vaccine 12,1032-1040)。 當(dāng)使用禽痘病毒時(shí)，雖然可考慮在胸苷激酶基因內(nèi)插入，核酸分子優(yōu)選導(dǎo)入位于 0RF 7和9之間的基因間區(qū)域(見(jiàn)例如EP 314 569和US5， 180， 675)。
而且，本發(fā)明載體也可以包含一或多個(gè)額外元件，其能夠在給定的宿主細(xì)胞或生 物體內(nèi)維持，增殖或表達(dá)核酸分子。這種額外元件包括但不限于標(biāo)記物基因以促進(jìn)重組宿 主細(xì)胞的鑒定和分離(例如通過(guò)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)或抗生素抗性)，穩(wěn)定元件(例如 Summers and Sherrat， 1984， Cell 36， 1097-1103和US 5， 198， 343描述的DAP系統(tǒng))，和整 合元件(例如LTR病毒序列和轉(zhuǎn)座子)。 本發(fā)明也提供了包含上述核酸分子或載體的感染性病毒顆粒。在此將不詳細(xì)描述 已知用于生產(chǎn)感染性病毒顆粒的多種方法。典型地，這種病毒顆粒通過(guò)包括如下步驟的過(guò) 程生產(chǎn)(a)將病毒載體導(dǎo)入適合的細(xì)胞系，(b)在適合的條件下培養(yǎng)細(xì)胞系以允許生產(chǎn)所 述感染性病毒顆粒，從所述細(xì)胞系的培養(yǎng)物回收生產(chǎn)的感染性病毒顆粒，和任選純化所述 回收的感染性病毒顆粒。 當(dāng)病毒載體是缺陷型的時(shí)，通常在在反式補(bǔ)充非功能性病毒基因的互補(bǔ)細(xì)胞系中 生產(chǎn)感染性顆粒。例如，互補(bǔ)El缺失的腺病毒載體的適合細(xì)胞系包括293細(xì)胞(Graham et al. ，1997， J. Gen. Virol. 36， 59—72) ， PER-C6細(xì)胞(Fallaux et al. ，1998， Human GeneTher. 9， 1909-1917)和HER96細(xì)胞。適合增殖痘病毒載體的細(xì)胞是禽類細(xì)胞，最優(yōu)選自受精 卵獲得的雞胚制備的原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。生產(chǎn)者細(xì)胞可以在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器， 培養(yǎng)瓶和Petri平板中、在適合溫度下、pH和氧含量條件下培養(yǎng)。感染性病毒顆粒可以從培 養(yǎng)上清液或裂解后的細(xì)胞中回收。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步純化(如W096/27677，W098/00524， W098/22588, W098/26048, W000/40702, EP1016700和W000/50573所述的色譜，超速離心) 它們。 本發(fā)明也包含病毒載體，其被修飾以允許優(yōu)先靶定到特定的宿主細(xì)胞。被靶定的 載體的典型特征是它們的表面存在能夠識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞和表面暴露成分如細(xì)胞特異性標(biāo) 記物(例如HPV感染的細(xì)胞)、組織特異性標(biāo)記物或腫瘤特異性標(biāo)記物的配體。配體可被遺 傳插入存在于載體表面的多肽(例如W094/10323和W002/96939中描述的腺病毒纖維，五 鄰體，pIX或EP 1146 125描述的痘苗pl4基因產(chǎn)物)。 本發(fā)明也涉及包含上述核酸分子、載體或感染性病毒顆粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞(例如大腸桿菌，芽孢桿菌，李斯特菌)，低等真 核細(xì)胞如酵母(例如釀酒酵母，粟酒裂殖酵母，巴斯德畢赤氏酵母)，和其它真核細(xì)胞如昆 蟲細(xì)胞，植物和高等真核細(xì)胞，特別優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人或非人細(xì)胞)。適合的宿主 細(xì)胞的典型實(shí)例包括但不限于BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞，MDCK細(xì)胞(Madin-Darby犬腎細(xì)胞 系)，CRFK細(xì)胞(Crandell貓腎細(xì)胞系)，CV-1細(xì)胞(非洲猴腎細(xì)胞系)，COS (例如C0S-7) 細(xì)胞，中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，小鼠NIH/3T3細(xì)胞，HeLa細(xì)胞和Vero細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì) 胞"還涵蓋能夠互補(bǔ)如上所述的本發(fā)明的復(fù)制缺陷型載體(例如腺病毒載體)的至少一種 缺陷的功能的互補(bǔ)細(xì)胞。 在分離的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入核酸分子、載體或感染性顆粒的方法是本領(lǐng)域常規(guī)的， 包括例如顯微注射(C即echi et al. ，1980， Cell 22,479-488)， CaP(^介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Chen and Okayama， 1987， MoL Cell Biol. 7， 2745-2752) ， DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔(Chu et al， 1987， Nucleic Acid Res. 15， 1311-1326) ， lipofection/脂質(zhì)體融合(Feigner et al. ， 1987， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84， 7413-7417)，顆粒轟擊(Yang et al. ， 1990， Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,9568-9572)，基因槍，轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒感染以及通過(guò)多種手段直接施用給 宿主生物體。 通過(guò)重組手段，宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)本發(fā)明核酸分子、載體或感染性顆粒編碼的 感興趣多月太。本領(lǐng)域已知這禾中技術(shù)(見(jiàn)例如Ausubel， CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley， 1987-2002 ;禾口最新版Sambrook etal. ， Molecular Cloning, A Laboratory Ma皿al， Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，上述嵌合多肽，核酸分子，載體，感染性病毒顆粒 或宿主細(xì)胞(在此也表示為"活性物質(zhì)")或其任意組合包含在組合物中。有利地，所述組 合物是藥物組合物，其包含治療有效量的活性物質(zhì)和藥物可接受的載體。在此所使用的"治 療有效量"是在宿主生物體內(nèi)足以緩和一或多個(gè)通常與希望治療或預(yù)防的疾病或病癥相關(guān) 的癥狀的劑量。當(dāng)考慮到預(yù)防使用時(shí)，這個(gè)術(shù)語(yǔ)表示足以在宿主生物體內(nèi)防止或延遲疾病 或病癥建立的劑量。例如，治療有效量可以是在被治療的生物體內(nèi)足以誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反 應(yīng)的量，或足以減輕，改善，穩(wěn)定，反轉(zhuǎn)，減慢或延遲疾病進(jìn)程(例如減少大小或衰退損害或 腫瘤，逆轉(zhuǎn)病毒感染)。
如在此所用，"藥物可接受的載體"包括任何和所有的載體，溶劑，稀釋劑，賦形劑， 佐劑，分散介質(zhì)，包被劑，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，和吸收延遲劑等等，與藥物施用相容。期望 地，本發(fā)明的組合物包含一或多個(gè)在使用的劑量和濃度無(wú)毒性的載體和/或稀釋劑。這樣 的載體和/或稀釋劑優(yōu)選選自那些通常用于配制單位劑量或多劑量形式的組合物以全身 或粘膜施用。適合的載體可以是溶劑，分散介質(zhì)，含有例如水，乙醇，多羥基化合物(例如 甘油，丙二醇，液體聚乙二醇等)，植物油或其恰當(dāng)?shù)幕旌衔?。?yōu)選地，稀釋劑是等滲的、低 滲的或弱高滲的并具有相對(duì)低的離子強(qiáng)度。適合的稀釋劑的典型實(shí)例包括無(wú)菌水，生理鹽 水(例如氯化鈉)，Ringer' s溶液，葡萄糖，海藻糖或蔗糖溶液，Hank' s溶液和其他含水 生理平衡的鹽溶液(見(jiàn)例如最新版Remington :The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro， Lippincott, Wi lliams&Wi Iking)。本發(fā)明組合物的pH是被恰當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)和緩 沖以適用于人類和動(dòng)物，優(yōu)選在生理或微堿性pH(大約pH7. 5到大約pH9之間，特別優(yōu)選 pH8-8. 5)。適合的緩沖液包括磷酸緩沖液(例如PBS)，重碳酸鹽緩沖液和/或Tris緩沖 液。特別優(yōu)選的組合物(特別地當(dāng)活性物質(zhì)是腺病毒載體時(shí))是以1M蔗糖，150mM NaCl， ImM MgCl2，54mg/lTween 80， 10mM Tris pH 8. 5配制的。另一個(gè)優(yōu)選的組合物以10mg/ml 甘露醇，lmg/ml HAS，20mM Tris，pH 7. 2和150mM NaCl配制。這樣的配制物特別適于保存 本發(fā)明組合物的穩(wěn)定性超過(guò)至少2個(gè)月，無(wú)論是在冷凍(例如-70°C， _40°C， _20°C )或冷 藏(例如4tO溫度下。 組合物也可以含有一或多個(gè)藥物可接受的賦形劑以提供期望的藥物或藥代性質(zhì)， 包括例如更改或維持配制物的pH、滲透壓、粘性、清晰度、顏色、無(wú)菌度、穩(wěn)定性、溶解速度， 更改或維持釋放或吸收進(jìn)入人或動(dòng)物。 另外，本發(fā)明組合物可包含一或多個(gè)適于人體全身或粘膜施用的佐劑。"佐劑"， 其表示具有增強(qiáng)對(duì)特定抗原的免疫反應(yīng)的能力的化合物。佐劑可以是在抗原部位或其附 近輸送。典型地通過(guò)針對(duì)抗原的抗體滴度的顯著增加(通常超過(guò)10倍)來(lái)顯示體液免疫 的增強(qiáng)。例如通過(guò)陽(yáng)性皮膚測(cè)驗(yàn)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞測(cè)定，ELISP0T測(cè)定IFNg或IL-2測(cè)量 細(xì)胞免疫的增強(qiáng)。優(yōu)選地，本發(fā)明使用的佐劑能夠剌激對(duì)活性物質(zhì)的免疫，特別通過(guò)toll 樣受體(TLR)如TLR-7、 TLR-8和TLR-9進(jìn)行。有用佐劑的代表性實(shí)例包括但不限于明礬， 礦物油乳劑如Freunds完全和不完全佐劑(IFA)，脂多糖或其衍生物(Ribi et al. ， 1986， Immunology and Imm皿opharmacology ofBacterial Endotoxins, Plenum Pub 1. Corp. ， NY， p407-19)，皂苷如QS21(Sumino et al. ， 1998， J. Virol. 72， 4931-9 ;W0 98/56415)，咪唑喹 啉化合物如咪喹莫特(imiquimod) (Suader， 2000， J. Am Acad Dermatol. 43，S6_S11) ， lH-咪 唑(4，5-c)喹啉-4-胺(1H-imidazo(4，5-c)quinolon-4-amine)衍生物(Aldara )和相 關(guān)化合物(Smorlesi， 2005， Gene Ther. 12， 1324-32)，胞嘧啶-磷酸鹽-鳥嘌呤寡脫氧核苷 酸如CpG(Chu et al. ，1997， J.Exp.Med. 186 :1623 ;Tritel et al. ， 2003， J. Immunol. 171 : 2358-2547)和陽(yáng)離子肽如IC-31(Kritsch et al. ， 2005， J. Chromatogr Anal. Techno1 Biomed Life Sci 822,263-70)。 本發(fā)明的組合物可以是多種形式，例如固體(例如干粉或凍干形式)或液體(例 如含水)。活性物質(zhì)的固體組合物加上任意額外的所需成分可得自其先前過(guò)濾滅菌的溶液， 真空干燥和凍干。如果需要，其可以被保存于無(wú)菌安瓿瓶中準(zhǔn)備通過(guò)在使用前添加適合的 載體重構(gòu)(reconstitution)。
本發(fā)明的嵌合多肽，核酸分子，載體，感染性顆?；蚪M合物可通過(guò)多種施用模式施 用，包括全身，局部和粘膜施用。通過(guò)任何方式，例如皮下，皮內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，血 管內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)注射進(jìn)行全身施用。使用常規(guī)注射器和針頭或本領(lǐng)域可獲得的任何其他設(shè)備 進(jìn)行注射。經(jīng)口，鼻，氣管內(nèi)，肺內(nèi)，陰道內(nèi)或直腸內(nèi)途徑進(jìn)行粘膜施用。使用透皮方式(例 如貼片等)進(jìn)行局部施用。肌內(nèi)或皮下施用特別優(yōu)選用病毒載體和感染性顆粒作為活性物 質(zhì)。 恰當(dāng)?shù)膭┝靠梢蕾囉谌缣囟ɑ钚晕镔|(zhì)的藥代特征，患者年齡，健康和體重，要治療 的病癥，癥狀的性質(zhì)和程度，合并治療的種類，治療頻率，需要預(yù)防或治療和/或所需效果 等已知因素而改變。劑量的計(jì)算也依賴于選擇的特別施用途徑。進(jìn)一步由從業(yè)者依據(jù)相關(guān) 情況對(duì)需要確定恰當(dāng)?shù)闹委焺┝砍Ｒ?guī)進(jìn)行計(jì)算的改進(jìn)。通常，腺病毒顆粒的適合劑量從大 約105到大約1013iu (感染單位)，期望從大約107到大約1012iu和優(yōu)選從大約108到大約 10"iu。痘苗病毒顆粒的適合劑量從大約104到大約l(Tpfu(噬斑形成顆粒)，期望從大約 105到大約109pfu和優(yōu)選從大約106到大約5X 108pfu。載體質(zhì)粒可以10 ii g到20mg之間 的劑量施用，優(yōu)選100 ii g和2mg之間和嵌合多肽的劑量在0. 5 ii g到5g之間，優(yōu)選在5 y g 和500mg之間。 而且，可以單劑量或可選擇地依據(jù)幾小時(shí)、幾天和/或幾周的標(biāo)準(zhǔn)方案、劑量和方 案以多劑量進(jìn)行施用。而且，可以經(jīng)推注或連續(xù)灌注進(jìn)行施用。例如，可以以周間隔進(jìn)行3 次連續(xù)施用，隨后至少在第一系列之后的4到6個(gè)月以內(nèi)進(jìn)行至少一次施用。通常，使用MVA 載體作為治療劑，優(yōu)選施用途徑是用106到5X 108pfu之間劑量的MVA顆粒經(jīng)皮下進(jìn)行。
本發(fā)明的嵌合多肽，核酸分子，載體，感染性顆粒，宿主細(xì)胞或組合物可以用于治 療或預(yù)防多種疾病和病理病癥包括遺傳疾病，先天疾病和后天疾病的方法中。本發(fā)明也涉 及本發(fā)明嵌合多肽，載體，感染性顆粒，宿主細(xì)胞或組合物用于制備治療或預(yù)防這種疾病的 藥物的應(yīng)用。其特別適合治療或預(yù)防傳染病(例如病毒和/或細(xì)菌感染)，癌癥和免疫缺陷 疾病。術(shù)語(yǔ)"癌癥"包含任意癌性病癥，其源于非所需的細(xì)胞增殖包括擴(kuò)散或定位的腫瘤，轉(zhuǎn) 移，癌息肉和癌前病變(例如瘤形成)。本發(fā)明預(yù)期的癌癥包括但不限于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，肉 瘤，黑色素瘤，肥大細(xì)胞瘤，癌以及乳腺癌，前列腺癌，睪丸癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，宮頸癌 (特別是與乳頭瘤病毒相關(guān)的那些)，肺癌(例如包括大細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，鱗狀細(xì)胞肺 癌和腺癌)，腎癌，膀胱癌，肝癌，結(jié)腸癌，肛門癌，胰腺癌，胃癌，胃腸癌，口腔癌，喉癌，腦和 CNS癌，皮膚癌(例如黑素瘤和非黑素瘤)，血癌(淋巴瘤，白血病，特別地若它們已經(jīng)發(fā)展 為實(shí)體)，骨癌，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤和甲狀腺癌。傳染病包含那些由任意病原微生物如病毒導(dǎo) 致的疾病。本發(fā)明預(yù)期的傳染病包括與肝炎病毒(例如甲肝，乙肝或丙肝病毒)感染相關(guān) 的疾病。本發(fā)明預(yù)期的其他傳染病包括那些與乳頭瘤病毒(例如HPV-16，HPV-18，HPV-31， HPV-33， HPV-45， HPV-52)相關(guān)的疾病，這樣的疾病包括持續(xù)感染，癌前病變(例如低、中或 高等級(jí)宮頸上皮內(nèi)瘤形成)和癌變(例如宮頸癌)。 本發(fā)明也提供用于重組產(chǎn)生多肽的方法，其包含步驟a)將本發(fā)明的載體或感染 性病毒顆粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，b)在允許表達(dá)感興趣多肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞， 和c)從培養(yǎng)物回收和任選純化所述多肽。 在一個(gè)實(shí)施方案中，依據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)多肽以分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。優(yōu)選地， 所述多肽包括在帶有在此描述的信號(hào)肽的嵌合多肽內(nèi)，其中所述信號(hào)肽從所述嵌合多肽切
18除，并且從培養(yǎng)基中回收所述多肽。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，依據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)多肽以錨定到細(xì)胞膜上，特別優(yōu)選附 著在質(zhì)膜的外表面。優(yōu)選地，所述多肽以這樣的方式錨定，即其可與其他細(xì)胞表面或存在于 胞外培養(yǎng)基中的其他分子相互作用。優(yōu)選地，所述多肽包括在帶有在此描述信號(hào)肽和膜肽 的嵌合多肽內(nèi)，其中信號(hào)肽從嵌合多肽切除并且從培養(yǎng)的細(xì)胞中回收所述多肽。
本發(fā)明也提供了指導(dǎo)感興趣多肽在細(xì)胞外表達(dá)的方法，其包含步驟(a)通過(guò)將選 自SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15禾PSEQ ID NO :16組成的組中的第一個(gè)核苷酸序列連接到編碼所述多肽的第二個(gè)核苷酸序列上來(lái)產(chǎn) 生核酸分子，其中所述核酸分子編碼嵌合多肽，其從N到C端包含由所述第一個(gè)核苷酸序列 編碼的信號(hào)肽和所述感興趣多肽；(b)將所得的核酸分子插入表達(dá)載體和(c)將所述表達(dá) 載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體。如前所討論，分泌過(guò)程中信號(hào)肽從嵌合多肽切割，然后感興趣 多肽釋放到胞外。使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)其可以從培養(yǎng)基中回收和純?nèi)芜x化。
本發(fā)明也提供了指導(dǎo)錨定在質(zhì)膜表面的多肽的表達(dá)的方法，其包括步驟(a)通過(guò) 在選自SEQ ID N0:23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27禾P SEQ ID NO :28組成的組中的第一個(gè)核苷酸序列中在所述第一個(gè)核苷酸序列第70位的核苷酸和 第76位的核苷酸之間的任意位置插入編碼感興趣多肽的第二個(gè)核苷酸序列而產(chǎn)生核酸分 子，其中所述核酸分子編碼嵌合多肽，其從N到C端包含由所述第一個(gè)核苷酸序列編碼的信 號(hào)肽，由所述第二個(gè)核酸編碼的感興趣多肽和由所述第一個(gè)核苷酸序列編碼的膜錨定肽； (b)將所得的核酸分子插入表達(dá)載體和(c)將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體。如上 所討論，所述信號(hào)肽從所述嵌合多肽上切割，帶有膜錨定肽的多肽以這樣的方式存在于表 達(dá)宿主細(xì)胞的表面，即其可與其他細(xì)胞表面或存在于胞外介質(zhì)中的其他分子相互作用。
使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法例如Sambrook et al. (2001， MolecularCloning， a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor, N. Y)，Ausubel et al. (1994， Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y.) 禾口 Herdewijn (2004， Oligonucleotide Synthesis :Methods and Applications(Methods inMolecular Biology) ，Humana Press, Totowa，New Jersey)等描述的方法可產(chǎn)生在此描述的本發(fā)明的核酸，載體和多肽(例如分 離的、純化的和合成的)。 本發(fā)明以舉例性的方式進(jìn)行描述，可以理解已使用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)是說(shuō)明的而不是限制
的。顯然，根據(jù)所述教導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修飾和變化。因此可以理解在所附的權(quán)利
要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以與在此特別描述的方式不同的方式實(shí)施。 所有上述提及的專利公開，出版物和數(shù)據(jù)庫(kù)條目以每個(gè)這種單獨(dú)的專利、出版物
或條目特異和單獨(dú)表明并入?yún)⒖枷嗤某潭纫云淙奶貏e并入本文參考。 以下實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明
實(shí)施例 依據(jù)最新片反Sambrook等(A Laboratory Maruml，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor NY)描述的常規(guī)基因工程和分子克隆技術(shù)或當(dāng)使用商品 化試劑盒時(shí)依據(jù)廠商建議進(jìn)行以下描述的構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知PCR擴(kuò)增技術(shù)(見(jiàn)例如PCR protocols-A guide to methodsand applications,1990， published by Innis， Gelfand， Sninsky andWhite， Academic Press)。攜帶氨節(jié)青霉素抗性基因的重 組質(zhì)粒在補(bǔ)加lOOii g/ml抗生素的瓊脂或液體培養(yǎng)基中的大腸桿菌C600 (Stratagene)， BJ5183(Hanahan， 1983， J. Mol. Biol. 166， 557-580)和NM522內(nèi)復(fù)制。依據(jù)以上引用的文 獻(xiàn)和Mackett等(1982， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79， 7415-7419)和Mackett等(1984， J. Virol. 49,857-864)描述的本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行重組痘苗病毒的構(gòu)建。大腸桿菌的 選擇基因gpt (黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)(Falknerand Moss， 1988， J. Virol. 62， 1849-1854)用于促進(jìn)重組痘苗病毒的選擇。
實(shí)施例1 :鑒定和評(píng)價(jià)新的信號(hào)傳導(dǎo)序列 已示出通過(guò)將重組蛋白質(zhì)重新定向到質(zhì)膜表面改善了重組MVA表達(dá)的抗原的呈 遞。在質(zhì)膜上呈遞需要將感興趣基因克隆在編碼信號(hào)肽和膜錨定肽的序列之間。這樣的信 號(hào)傳導(dǎo)肽典型地存在于膜結(jié)合蛋白質(zhì)中如多種病毒株的狂犬病糖蛋白并已被廣泛用于在 細(xì)胞表面表達(dá)感興趣多肽(見(jiàn)W099/03885)。更特別地，描述了 4個(gè)不同的狂犬病病毒株并 且編碼的糖蛋白的氨基酸序列可在特殊的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，例如在NCBI上的Uniprot中的登錄 號(hào)分別是M38452 (ERA株)、ay009097 (PG株)、S72465 (Nishigahara株)和u11751 (北極狐 株)。但是，當(dāng)超過(guò)2個(gè)重組多肽需要定位到質(zhì)膜表面時(shí)，獲得自這些可獲得的狂犬病株的 糖蛋白質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)肽在多基因表達(dá)載體中的聯(lián)合使用是不恰當(dāng)?shù)?。由于其在核苷酸水?的高度同源性，可能發(fā)生同源重組事件，其可負(fù)面影響載體穩(wěn)定性和載體原液不適于人類 使用。 本發(fā)明允許解決潛在的同源重組這個(gè)問(wèn)題和提供來(lái)源于狂犬病糖蛋白的新的信 號(hào)傳導(dǎo)肽和編碼這種肽的已被工程化以彼此呈現(xiàn)小于75%同源性的"簡(jiǎn)并的"核苷酸序列。 這些序列通過(guò)修飾密碼子使用模式而簡(jiǎn)并以降低DNA同源性，因此限制了載體生產(chǎn)步驟中 的重組風(fēng)險(xiǎn)。編碼信號(hào)肽和膜錨定肽的6個(gè)新核苷酸序列被工程化，其分別命名為M38452,
vl(SEQ ID NO :23)， ay009097， vl(SEQ ID NO :24)， S72465, vl (SEQID NO :25)， ull751，
vl(SEQ ID NO :26)，ull751，v2(SEQ ID NO :27)和M38452， v2-ay009097v2 (SEQ ID NO :28)。
表1顯示編碼信號(hào)肽的本發(fā)明核苷酸序列呈現(xiàn)的同源性百分比，表2說(shuō)明編碼膜錨定肽的
本發(fā)明核苷酸序列呈現(xiàn)的同源性百分比。 a)編碼這些新信號(hào)傳導(dǎo)序列的核苷酸序列的產(chǎn)生 經(jīng)組裝重疊寡核苷酸產(chǎn)生核苷酸序列。更特別地，每種情況中，2個(gè)寡核苷酸 用于產(chǎn)生編碼信號(hào)肽的序列和4個(gè)寡核苷酸用于產(chǎn)生編碼膜錨定序列。然后，每對(duì)合 成序列插入PBS衍生的載體，以提供pTG15833(S72465， vl) ， pTG15834(ul1751， vl)， pTG15835(M38452， vl) ， pTG15943 (ay009097， vl) ， pTG15944 (M38452， v2-ay009097， v2)和 pTG15945(u11751， v2)。
b)評(píng)價(jià)新信號(hào)傳導(dǎo)序列 非致癌HPV-16E7蛋白(如W099/03885描述缺失氨基酸殘基21到26(ADLYCYE)) 用作模型蛋白質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)由每6個(gè)序列的每一個(gè)編碼的信號(hào)肽和膜錨定肽表達(dá)錨定到質(zhì)膜 的給定多肽的能力。編碼HPV-16E7變體的核苷酸序列被克隆在每個(gè)上述質(zhì)粒的信號(hào)肽編 碼序列和膜錨定肽序列之間的BamHI位點(diǎn)。在每種情況中，表達(dá)置于痘苗病毒p7. 5K啟動(dòng)
20子控制下(Cochran et al， 1985. J. Virol. 54， 30-37)。然后，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代雞胚成纖維細(xì) 胞(CEF)之后分析E7的表達(dá)和定位。使用Lipofectine(Invitrogen)用1 y g質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn) 染以lpfu/細(xì)胞的MOI用MVATGN33. 1預(yù)先感染的106細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)Western 印跡分析E7表達(dá)水平。 結(jié)果顯示除了 pTG15833顯示更低表達(dá)水平(序列S72465vl對(duì)應(yīng)SEQID NO :25)， 在其他的每個(gè)檢測(cè)質(zhì)粒中E7的表達(dá)水平近似。值得注意的是，所述表達(dá)水平與在獲得自參 考狂犬病毒株ERA(M38452)糖蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和膜錨定肽的控制下用表達(dá)E7的對(duì)照質(zhì)粒 觀測(cè)到的水平是相同數(shù)量級(jí)的。 通過(guò)免疫熒光分析細(xì)胞定位。使用lpfu/細(xì)胞的MOI的MVATG33. 1感染 7. 5X104BHK21細(xì)胞，然后使用Lipofectin (Invitrogen)用0. 125 ii g質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。24小 時(shí)后，使用兔多克隆抗E7抗體進(jìn)行免疫熒光。正如所預(yù)料，在質(zhì)膜表面檢測(cè)E7蛋白質(zhì)的所
有信號(hào)傳導(dǎo)序列?？傊碌男盘?hào)傳導(dǎo)序列可用于在宿主細(xì)胞表面表達(dá)一或多個(gè)錨定在質(zhì)膜上的感興趣多肽。表1 :在此揭示的信號(hào)肽編碼序列之間的DNA同源性百分比。M38452 M38452， vlay009097， vlS72465， vl
u11751，vl ull751，v2M38452， vl71. 0ay009097， vl71. 071. 0S72465， vl66. 766. 7 68. 1rvul1751， vl69. 675.4 68. 1 63.8rvul1751， v268. 171.0 73.972. 0
71. 0M38452， v2-71. 068. 1 66. 765. 2
72. 571. 0ay009097v2表2 :在此揭示的膜錨定肽編碼序列之間的DNA同源性百分比。M38452 M38452， vlay009097， vlS72465， vl
u11751，vl ull751，v2M38452， vl66. 5ay009097， vl63. 862. 9S72465， vl67. 162. 0 66. 2rvul1751， vl62. 462.4 62.4 62.0rvul1751， v260. 162. 4 59. 665. 2
67. 6M38452， v2-59. 656. 3 64. 871. 3
63. 860. 5ay009097v權(quán)利要求
選自如下一組中的肽，所述肽基本上由或由SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的氨基酸序列組成。
2. —種嵌合多肽，其包含感興趣多肽和(i)或者基本上由或由SEQ IDNO:l或SEQ IDNO :2所示氨基酸序列組成的肽或者(ii)基本上由或由SEQID NO :3， SEQ ID NO :4或SEQID NO :5所示氨基酸序列組成的肽或(iii)基本上由或由SEQ ID NO:l或SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的肽和基本上由或由SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示氨基酸序列組成的肽二者。
3. 權(quán)利要求2的嵌合多肽，其中所述基本上由或由SEQ ID NO:l或SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的肽連接在所述嵌合多肽的氨基末端。
4. 權(quán)利要求2(i)或3的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽無(wú)其他信號(hào)傳導(dǎo)肽。
5. 權(quán)利要求2或3的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含至少一個(gè)膜錨定肽。
6. 權(quán)利要求5的嵌合多肽，其中所述膜錨定肽連接到感興趣多肽的羧基末端或C末端部分內(nèi)。
7. 權(quán)利要求2，3，5和6任一項(xiàng)的嵌合多肽，其中所述信號(hào)肽由SEQID NO :2所示氨基酸序列組成，且所述膜錨定肽由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列組成。
8. 權(quán)利要求2，3，5和6任一項(xiàng)的嵌合多肽，其中所述信號(hào)肽由SEQID NO :1所示氨基酸序列組成，所述膜錨定肽由SEQ ID N0:5所示氨基酸序列組成。
9. 權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)的嵌合多肽，其中感興趣多肽與狂犬病病毒是異源的。
10. 權(quán)利要求9的嵌合多肽，其中所述感興趣多肽選自免疫原性多肽和抗腫瘤多肽的組成的組中。
11. 權(quán)利要求10的嵌合多肽，其中所述免疫原性多肽是乳頭瘤病毒多肽。
12. 分離的核酸分子，其包含至少編碼權(quán)利要求1的肽或權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的嵌合多肽的核苷酸序列。
13. 分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO :11-28任一所示的核苷酸序列中的至少一個(gè)。
14. 權(quán)利要求13的核酸分子，其中編碼感興趣多肽的核苷酸序列插入到SEQ ID NO:23-28的大約第70位到大約第76位之間。
15. 權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述核酸分子被置于恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件的控制下以確保其在給定的宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)表達(dá)。
16. 用于表達(dá)一或多個(gè)權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的嵌合多肽的載體。
17. 權(quán)利要求16的載體，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子。
18. 權(quán)利要求17的載體，其包含2，3或4個(gè)權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子。
19. 權(quán)利要求18的載體，其中所述2，3或4個(gè)核酸分子彼此之間呈現(xiàn)少于75%的同源性百分比。
20. 權(quán)利要求19的載體，其包含SEQ ID N0:24的核苷酸序列以使得能夠表達(dá)第一個(gè)感興趣多肽到細(xì)胞膜并包含SEQ ID N0:28的核苷酸序列以使得能夠表達(dá)第二個(gè)感興趣多肽到細(xì)胞膜。
21. 權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的載體，其中所述載體是病毒或非病毒載體。
22. 權(quán)利要求21的載體，其中所述載體是腺病毒載體。
23. 權(quán)利要求22的載體，其中所述腺病毒載體是復(fù)制缺陷型的。
24. 權(quán)利要求21的載體，其中所述載體是痘病毒載體。
25. 權(quán)利要求24的載體，其中所述痘病毒載體獲得自痘苗病毒，所述痘苗病毒選自由Copenhagen株，Wyeth株，NYVAC和高度減毒修飾的Ankara(MVA)株組成的組中。
26. 感染性病毒顆粒，其包含權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的載體。
27. —種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求26的感染性病毒顆粒。
28. —種藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的嵌合多肽、權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求26的感染性病毒顆?；驒?quán)利要求27的宿主細(xì)胞或其任意組合和藥物可接受的載體。
29. 權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)的嵌合多肽、權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求26的感染性病毒顆粒或權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞或其任意組合在制備用于治療或預(yù)防疾病或病理性病癥的藥物中的應(yīng)用。
30. 權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中所述疾病或病理性病癥是傳染病。
31. 基本上由SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列組成的肽作為信號(hào)肽的應(yīng)用。
32. 基本上由或由SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4或SEQ ID NO :5所示氨基酸序列組成的肽作為膜錨定肽的應(yīng)用。
33. 重組產(chǎn)生多肽的方法，其包含步驟a)將權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求26的感染性病毒顆粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，b)在允許感興趣多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和c)從培養(yǎng)物回收和任選純化所述多肽。
34. 指導(dǎo)感興趣多肽胞外表達(dá)的方法，其包含步驟a)通過(guò)將選自由SEQ ID NO:ll，SEQID NO :12， SEQ ID NO :13， SEQ ID NO :14， SEQ IDNO :15和SEQ ID NO :16組成的組中的第一個(gè)核苷酸序列連接到編碼所述多肽的第二個(gè)核苷酸序列而產(chǎn)生核酸分子，其中所述核酸分子編碼嵌合多肽，所述嵌合多肽從N到C末端包含由所述第一個(gè)核苷酸序列編碼的信號(hào)肽和所述感興趣多肽；(b)將所得核酸分子插入表達(dá)載體和(c)將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體。
35. 指導(dǎo)錨定在質(zhì)膜表面的多肽表達(dá)的方法，其包含步驟(a)通過(guò)在選自由SEQ IDNO :23， SEQ ID NO :24， SEQ ID NO :25， SEQ ID NO :26， SEQ ID NO :27和SEQ ID NO :28組成的組中的第一個(gè)核苷酸序列的第70位核苷酸和第76位核苷酸之間的任意位置插入編碼感興趣多肽的第二個(gè)核苷酸序列而產(chǎn)生核酸分子，其中所述核酸分子編碼嵌合多肽，所述嵌合多肽從N到C末端包含由所述第一個(gè)核苷酸序列編碼的信號(hào)肽，由所述第二個(gè)核酸編碼的感興趣多肽和由所述第一個(gè)核苷酸序列編碼的膜錨定肽；(c)將所得核酸分子插入表達(dá)載體和(c)將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體。
全文摘要
本發(fā)明提供具有特殊序列的新肽和其作為信號(hào)肽或膜錨定肽的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及嵌合多肽，其包含一或多個(gè)這種肽和感興趣的多肽，還涉及編碼這種肽和嵌合多肽的核酸分子，載體，感染性病毒顆粒和宿主細(xì)胞。本發(fā)明也涉及藥物組合物，其包含這種元件和藥物可接受的載體。本發(fā)明也提供一種使用這種肽重組產(chǎn)生多肽的方法，特別是指導(dǎo)胞外或錨定在質(zhì)膜表面的感興趣多肽的表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C07K14/145GK101743250SQ200880024766
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日
發(fā)明者E·雅各布斯, N·西爾韋斯特雷 申請(qǐng)人:特蘭斯吉恩股份有限公司