專利名稱：RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路在血管外膜重塑中的功能和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物的方法。
背景技術(shù)：
1989年，Baumbach等(Baumbach GL，Heistad DD.Remodeling of cerebralarterioles in chronic hypertension.Hypertension.1989 Jun；13(6 Pt 2)968-972)發(fā)現(xiàn)易卒中自發(fā)性高血壓大鼠的腦部小動(dòng)脈的血管中層厚度/管腔內(nèi)徑值雖然升高，但管壁的橫切面積并無改變，他將血管的這一適應(yīng)性變化稱為血管重塑(vascular remodeling)。簡單地說，血管重塑是指管壁細(xì)胞增生，肥厚，重新排列并發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的過程。目前研究表明血管重塑廣泛地存在于動(dòng)脈粥樣硬化、血管損傷后再狹窄、高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。血管重塑的過程包括小血管新生、炎性細(xì)胞浸潤、局部細(xì)胞的分化、增生、遷移、凋亡并伴有細(xì)胞外基質(zhì)的沉積(Saverio S，Angela C，et al.Contribution of adventitial fibroblasts toneointimaformation and vascular remodeling from innocent bystander to activeparticipant.Circ Res.2001；891111-1121)。
幾十年來人們對(duì)于血管重塑的研究都集中于血管中膜，認(rèn)為中膜平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是血管重塑的主要參與者。而90年代以來的研究表明血管外膜在血管重塑中扮演著更為重要的角色。1991年朱鼎良(Zhu DL，Herembert T，Marche P.Increased proliferation of adventitial fibroblastsfrom spontaneously hypertensive rat aorta.J Hypertens 1991；91161-1168)等在國際上首先報(bào)道體外培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)胸主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblasts，AF)的增殖明顯快于正常對(duì)照大鼠(WKY)，且前者對(duì)于多種生長因子的增殖反應(yīng)也強(qiáng)于后者。1996年Shi(Shi Y，Pieniek M，et al.Adventitial remodeling after coronary arterial injury.Circulation.1996 Jan15；93(2)340-348)等報(bào)道，在球囊擴(kuò)張?jiān)斐韶i冠狀動(dòng)脈損傷時(shí)，血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MF)，后者遷移至內(nèi)膜并增殖形成新生內(nèi)膜，從而提出MF參與血管重塑的理論。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖形成新生內(nèi)膜的觀點(diǎn)提出了挑戰(zhàn)。近年來Li等進(jìn)一步將穩(wěn)定表達(dá)LacZ基因的AF細(xì)胞導(dǎo)入即刻球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈球，發(fā)現(xiàn)血管損傷后5-14天中膜及新生內(nèi)膜LacZ基因的表達(dá)及α-半乳糖苷酶的活性，動(dòng)態(tài)觀察證實(shí)了AF參與血管重塑過程。之后許多實(shí)驗(yàn)都證實(shí)MF在動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈炎和血管移植術(shù)后等一系列血管病變中起了重要作用。
綜合近年來的研究結(jié)果表明成纖維細(xì)胞(AF)是血管外膜的主要細(xì)胞成分，在血管損傷時(shí)血管外膜成纖維細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)，后者具有增殖，遷移和分泌功能，并參與新生內(nèi)膜的形成，因此AF/MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是促發(fā)血管重塑的始動(dòng)機(jī)制，MF在血管重塑過程中起重要作用。所以研究AF向MF表型轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機(jī)制是調(diào)控血管外膜細(xì)胞分化、阻斷AF/MF表型轉(zhuǎn)化乃至阻止血管重塑的根本措施，但迄今為止鮮有關(guān)成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的通路-RhoA/ROKα通路，以及該通路的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種篩選通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物的方法，包括步驟(a)在測試組中，向血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測血管外膜成纖維細(xì)胞中ROKα的表達(dá)量；(b)將步驟(a)測試組中ROKα的表達(dá)量與未添加候選物的對(duì)照組中ROKα的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表明該候選物是促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的促進(jìn)劑；如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑制血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的抑制劑。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中還包括檢測測試組血管外膜成纖維細(xì)胞中α-SM-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量，并與對(duì)照組中α-SM-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行比較。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中培養(yǎng)物中還添加了α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的TGF-β1。
在另一優(yōu)選例中，所述的血管外膜成纖維細(xì)胞是人、大鼠、小鼠的血管外膜成纖維細(xì)胞。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種RhoA/ROKα通路抑制劑的用途，它被用于制備抑制血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的藥物。
在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑選自Y27632胞外酶C、ROKα蛋白的抗體、ROKα的反義核酸。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種RhoA/ROKα通路促進(jìn)劑的用途，它被用于制備促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用本發(fā)明上述方法獲得的通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選調(diào)節(jié)血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)的基因的方法，它包括步驟(b)建立AF/MF轉(zhuǎn)化模型；(b)用TGF-β1處理AF/MF細(xì)胞；(c)對(duì)AF/MF細(xì)胞進(jìn)行基因分析，分離差異片斷；(d)對(duì)差異片斷測序鑒定，序列分析，獲得MF上調(diào)或下調(diào)基因。


圖1顯示了α-SM-肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果。其中，A未經(jīng)TGF-β1處理的AF細(xì)胞，B為TGF-β1處理24小時(shí)的AF細(xì)胞(放大200倍)。
圖2顯示了α-SM-肌動(dòng)蛋白Western blot結(jié)果。其中，上排為α-SM-肌動(dòng)蛋白條帶，下排為β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，左側(cè)為經(jīng)TGF-β1處理24小時(shí)的AF細(xì)胞，右側(cè)為未經(jīng)TGF-β1處理的AF細(xì)胞。
圖3顯示了血管外膜AF和MF的mRNA差異顯示圖。其中，A為AF細(xì)胞，M為MF細(xì)胞，差異片段以箭頭標(biāo)出，最左側(cè)為分子量標(biāo)記。
圖4顯示了差異片段的Northern印跡雜交結(jié)果。其中，上排為ROKα條帶，下排為18s RNA作為內(nèi)參照。
圖5顯示了RhoA免疫印跡結(jié)果。其中，上排為RhoA條帶，下排為β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。
圖6顯示了Y27632抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。其中，上排為α-SM-肌動(dòng)蛋白條帶，下排為β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照。
圖7顯示了胞外酶抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。其中，上排為α-SM-肌動(dòng)蛋白條帶，下排為β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照具體實(shí)施方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了1.血管外膜成纖維細(xì)胞存在RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路；2.血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程涉及RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
具體而言，成纖維細(xì)胞是血管外膜的主要細(xì)胞成分，在血管損傷時(shí)血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)迅速轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)，后者具有增殖、遷移和分泌功能，在血管重塑過程中起重要作用，因此AF/MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是促發(fā)血管重塑的始動(dòng)機(jī)制。為了尋找血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的相關(guān)基因，本發(fā)明人制備了血管外膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞二種細(xì)胞模型，利用熒光差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Fluo-DDPCR)技術(shù)篩選這兩種細(xì)胞差異表達(dá)基因。DDPCR結(jié)果顯示19個(gè)差異表達(dá)片段，其中14條為已知基因，5條為EST。經(jīng)Northern blot證實(shí)，ROKα是肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因之一。
ROKα是一分子量為160KD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其主要功能是與其上游的效應(yīng)分子RhoA共同參與細(xì)胞骨架的重排，已知ROKα在骨骼肌、平滑肌等細(xì)胞骨架重排中起了重要作用，但血管外膜細(xì)胞中是否存在ROKα基因尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明在基因及蛋白水平均證實(shí)血管外膜成纖維細(xì)胞存在ROKα基因，TGF-β1可上調(diào)血管外膜成纖維細(xì)胞ROKα和RhoA的表達(dá)，ROKα表達(dá)上調(diào)始于TGF-β1刺激后2小時(shí)而RhoA表達(dá)上調(diào)始于TGF-β1刺激后30分鐘。使用ROKα和RhoA的特異性抑制劑Y27632和胞外酶C3可以阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的血管外膜成纖維細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)。
這些結(jié)果表明，血管外膜成纖維細(xì)胞存在RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路，并且血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程涉及RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)篩選抑制通過RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)而抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的物質(zhì)(抑制劑或拮抗劑)。
這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠有效治療與通過RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路導(dǎo)致血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞有關(guān)的血管病變的藥物。
在本發(fā)明中，使用常規(guī)的檢測方法，利用血管外膜成纖維細(xì)胞上的RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)，可篩選出與影響血管外膜成纖維細(xì)胞上RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)(如RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等)。
RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)的拮抗劑或抑制劑，可以施用于個(gè)體時(shí)，以抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而改善與血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞有關(guān)的血管病理變化。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
本發(fā)明還提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量的(a)RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)的拮抗劑或抑制劑(例如抗ROKα的抗體、抗RHOA蛋白的抗體、ROKα反義核酸或RHOA反義核酸等)，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可以抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。
通常，這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測血管外膜成纖維細(xì)胞上RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路水平(或ROKα和RHOA蛋白數(shù)量)的方法。這些檢測結(jié)果可用于輔助判斷血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的能力。
一種檢測血管外膜成纖維細(xì)胞RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)數(shù)量的方法是利用抗ROKα和RHOA蛋白的特異性標(biāo)記物進(jìn)行檢測，它包括將含血管外膜成纖維細(xì)胞的樣品與抗RHOA抗體和/或抗ROKα抗體接觸；觀察所形成抗體復(fù)合物的數(shù)目。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于首次證實(shí)了血管外膜成纖維細(xì)胞上RHOA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路(或ROKα和RHOA蛋白)與血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞之間的相關(guān)性，從而提供了通過RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的新途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)方法如下1.AF及MF兩種表型細(xì)胞的建立及鑒定。采用貼片法獲得并培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈外膜的AF細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)使用4～6代細(xì)胞；用TGF-β1(10ng/ml)處理靜止?fàn)顟B(tài)的AF細(xì)胞24h后獲MF。采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及Western blot對(duì)AF和MF進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。SD大鼠購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，TGF-β1購自Valbiotech公司。
2.總RNA提取及DNA酶處理?？俁NA提取應(yīng)用Trizol試劑(Gibco公司)分別提取AF及MF兩種細(xì)胞的總RNA。各取10μg RNA，用DNA酶(Promega公司)處理去除DNA混雜，再以乙醇沉淀獲得處理后的RNA。
3.逆轉(zhuǎn)錄。取1μg RNA用M-MLV(Promega公司)300U進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物使用Genomyx的差異顯示PCR試劑盒的12條錨定引物。
4.差異顯示PCR(DDPCR)。用HIEROPLPH mRNA Profile試劑盒(Beckman公司)，兩種細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別選1個(gè)3′端錨定引物與16個(gè)5′端隨機(jī)引物配對(duì)后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共32個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)總體積為10μl，內(nèi)含1×buffer，3.75mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、熒光錨定引物和隨機(jī)引物各0.35μmol/L、1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.05U/μl高保真Taq DNA聚合酶(Takara公司)。反應(yīng)程序95℃ 2min，1個(gè)循環(huán)；92℃ 15s、50℃ 30s、72℃ 2min，4個(gè)循環(huán)；92℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。
5.分離差異片段。配制5.6％非變性聚丙烯酰胺凝膠，長61cm，寬33cm。擴(kuò)增產(chǎn)物加熒光染料變性處理后，經(jīng)Genomyx LR電泳儀上樣及Genomyx SC熒光成像系統(tǒng)掃描儀(Beckman公司)獲取圖像，顯示差異片段。
6.差異片段的回收及再擴(kuò)增。經(jīng)割膠系統(tǒng)(Beckman公司)切割差異片段凝膠，用T7及M13引物(Beckman公司)對(duì)差異片段再擴(kuò)增，然后用QIAquick Gel抽提試劑盒(QIAGEN公司)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
7.再擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及序列分析將純化產(chǎn)物連接到pGEM-T載體(Promega公司)，轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板篩選單克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，然后酶切鑒定。用末端熒光標(biāo)記法進(jìn)行DNA序列分析。所獲測序結(jié)果通過Blast軟件與GenBank收錄序列進(jìn)行同源性比較。
8.Northern blot鑒定取RNA 15μg，經(jīng)1.2％瓊脂糖變性電泳后，用虹吸法將變性RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Sigma公司)。以ROK再擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記(Roche公司)RNA探針。雜交，洗膜，與抗地高辛抗體免疫反應(yīng)，顯影。
9.細(xì)胞總蛋白抽提。以lysis buffer(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％SDS、1％TritonX-100、10ng/ml Aprotinin、2ug/ml Leupeptin、1mM PMSF)抽提細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量。
10.Western blot。取細(xì)胞總蛋白行SDS PAGE(檢測-SM-肌動(dòng)蛋白用1μg總蛋白行10％SDS PAGE；檢測RhoA用20μg總蛋白行12％SDS PAGE)，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(Amersham公司)，封閉，α-SM-肌動(dòng)蛋白一抗1∶3000(Sigma公司)，羊抗鼠二抗1∶10000(Santa Cruz公司)，RhoA一抗1∶1000(Santa Cruz公司)，羊抗鼠二抗1∶2000(Santa Cruz公司)各室溫下工作一小時(shí)，加Western ECL發(fā)光劑(Amersham公司)，曝光成像。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.細(xì)胞表型鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1(10ng/ml)誘導(dǎo)AF細(xì)胞平滑肌α肌動(dòng)蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示(圖1)，經(jīng)TGF-β1處理24小時(shí)的細(xì)胞中，α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽性，胞漿中見大量微肌絲；而在未經(jīng)TGF-β1處理的AF細(xì)胞，則α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)呈陰性。Western blot顯示(圖2)，經(jīng)TGF-β1處理24小時(shí)的細(xì)胞α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量明顯上升(P＜0.05，n＝3)，較未處理的AF細(xì)胞升高達(dá)約3倍。表明TGF-β1成功誘導(dǎo)AF轉(zhuǎn)化為MF。
2.差異片段的分離和識(shí)別由圖3可見，雖然AF及MF兩種表型細(xì)胞間大部分?jǐn)U增片段無顯著差異，但仍顯示部分明顯的差異片段。本圖為一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，熒光掃描顯示6個(gè)cDNA差異片段，全部以箭頭標(biāo)出。三次實(shí)驗(yàn)共找到20個(gè)差異片段，全部克隆至pGEM-T載體(Promega公司)，并測序。
3.差異片段的序列分析測序結(jié)果與GenBank進(jìn)行序列同源性比對(duì)，除一個(gè)克隆為線粒體基因組DNA外，15個(gè)片段為已知基因(同源性＞95％)，4個(gè)為表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。其中11個(gè)已知基因在MF上調(diào)，4個(gè)已知基因在MF下調(diào)。其中在MF上調(diào)的一個(gè)片段與ROKα基因同源性為99％(475bp/478bp)。表1和表2顯示在MF上調(diào)及下調(diào)的基因，表3為這些已知基因的功能分類。
表1.在MF表達(dá)上調(diào)的基因


表2.在MF表達(dá)下調(diào)的基因

表3.15條已知基因的功能分類


4.Northern blot分析如圖4所示，ROKα基因表達(dá)在TGF-β1刺激2小時(shí)后即明顯上升(p＜0.05，n＝4)，并隨TGF-β1刺激時(shí)間延長而逐步增加，至24-48小時(shí)達(dá)高峰，表達(dá)量為未刺激時(shí)的5倍(p＜0.01，n＝4)。18s RNA作為內(nèi)參照。
5.RhoA免疫印跡如圖5所示，AF細(xì)胞經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)刺激30分鐘后RhoA表達(dá)開始上調(diào)，2小時(shí)達(dá)到最大值(p＜0.05，n＝3)。6小時(shí)表達(dá)開始下降，但仍高于AF水平。12小時(shí)進(jìn)一步下降，至24小時(shí)RhoA表達(dá)量與AF細(xì)胞RhoA表達(dá)量基本一致。
本實(shí)施例采用熒光差異顯示PCR(DDPCR)的方法來篩選血管外膜成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)14條已知基因和5條EST，在14條已知基因中10條在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，4條在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。這14條已知基因功能涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)和基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾。本發(fā)明人進(jìn)一步選取參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的差異表達(dá)基因ROKα，以Northern blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果顯示TGF-β10ng/ml)刺激2小時(shí)后ROKα mRNA表達(dá)量開始上升，至24小時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，48小時(shí)持續(xù)高表達(dá)，表明DDPCR的結(jié)果可信。
實(shí)施例2篩選通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物候選化合物Y27632，胞外酶C3。
對(duì)照組不用候選物處理AF細(xì)胞。
測試組用前述候選物處理AF細(xì)胞。AF細(xì)胞經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)刺激24小時(shí)后，α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。接著，用Y27632預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，胞外酶C3使用Lipofectamine2000導(dǎo)入細(xì)胞(參見Tsutsumi S，Gupta SK，et al.Activation of small GTPase Rho is required for autocrine motility factor signaling.Cancer Res.2002 Aug 1；62(15)4484-4490)，預(yù)處理5小時(shí)。再取10ng的TGF-β1溶于50ul DMEM培養(yǎng)液中，添加于培養(yǎng)皿中，混勻，37℃培養(yǎng)。
首先，在測試組中，向血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測血管外膜成纖維細(xì)胞中ROKα的表達(dá)量；接著，將測試組中ROKα的表達(dá)量與未添加候選物的對(duì)照組中ROKα的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表明該候選物是促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的促進(jìn)劑；如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑制血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的抑制劑。
如圖6所示，AF細(xì)胞經(jīng)TGF-β1(10ng/ml)刺激24小時(shí)后，α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而ROKα的抑制劑Y27632劑量依賴性地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的AF細(xì)胞α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。0.1uM濃度的Y27632對(duì)α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)沒有抑制作用；1uM的Y27632開始抑制α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)；10uM的Y27632明顯抑制α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05，n＝3)；100uM的Y27632可完全抑制α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。證明，ROKα的抑制劑Y27632抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。
使用Lipofectamine將RhoA抑制劑胞外酶C3導(dǎo)入AF細(xì)胞。如圖7所示，AF細(xì)胞經(jīng)TGF-β(10ng/ml)刺激24小時(shí)后α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而RhoA的抑制劑胞外酶C3劑量依賴性地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的AF細(xì)胞α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。0.1ug/ml濃度的胞外酶C3對(duì)α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)沒有抑制作用；1ug/ml的胞外酶C3開始抑制α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)；3ug/ml的胞外酶C3明顯抑制α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05，n＝3)。證明，RhoA抑制劑胞外酶C3抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)。
討論肌成纖維細(xì)胞(MF)最初發(fā)現(xiàn)于損傷后的肉芽組織，這類細(xì)胞由局部的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。它們具有平滑肌細(xì)胞的特征，能夠表達(dá)一些平滑肌細(xì)胞特有的蛋白分子，例如α-SM-肌動(dòng)蛋白，這些蛋白賦予肌成纖維細(xì)胞收縮、遷移的能力，從而促使傷口愈合。之后在許多組織、器官諸如肝臟、肺臟、腎臟等都發(fā)現(xiàn)了肌成纖維細(xì)胞存在并且參與肝纖維化、肺纖維化及腎間質(zhì)纖維化的病理、病理生理過程。
目前在不同的組織、器官發(fā)現(xiàn)了至少5種不同的肌成纖維細(xì)胞，分類的標(biāo)準(zhǔn)取決于肌成纖維細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞特征蛋白α-SM-肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)的差異情況。例如，在腫瘤組織的肌成纖維細(xì)胞表達(dá)desmin(Hirose T，Kudo E，et al.Expression of intermediate filaments inmalignant fibrous histiocytomas.Hum Pathol.1989 Sep；20(9)871-877)，而血管外膜肌成纖維細(xì)胞只表達(dá)α-SM-肌動(dòng)蛋白和波形蛋白，不表達(dá)肌間線蛋白。因此血管外膜肌成纖維細(xì)胞具有不同于其他肌成纖維細(xì)胞的特征，并且鑒于外膜肌成纖維細(xì)胞對(duì)于血管重塑的重要性，因此盡管對(duì)于肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究已經(jīng)比較深入，但研究血管外膜肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機(jī)制仍然十分必要。
本發(fā)明采用熒光差異顯示PCR(DDPCR)的方法來篩選血管外膜成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)14條已知基因和5條EST，在14條已知基因中10條在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，4條在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。這14條已知基因功能涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)和基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾。本發(fā)明人進(jìn)一步選取參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的差異表達(dá)基因ROKα，以Northern blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示TGF-β10ng/ml)刺激2小時(shí)后ROKα mRNA表達(dá)量開始上升，至24小時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，48小時(shí)持續(xù)高表達(dá)。表明DDPCR的結(jié)果可信。
ROKα(Rho binding kinase alpha)是一分子量為160KD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，1995年Leung等首先克隆該基因。ROKα與其上游的胞漿內(nèi)小分子G蛋白R(shí)hoA共同組成RhoA-ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。目前的研究表明RhoA-ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路最主要的功能是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排。多種刺激因子如凝血酶、溶血磷脂酸(LPA)，F(xiàn)GF，PDGF和TGF-β均可激活該信號(hào)通路，激活的方式包括加強(qiáng)的ROKα激酶活性，或是上調(diào)RhoA與ROKα的表達(dá)，從而引起細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明采用熒光DDPCR方法篩選到并由Northern blot證實(shí)ROKα在肌成纖維細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)合RhoA的表達(dá)在AF/MF表型轉(zhuǎn)化過程中也上調(diào)。盡管ROKα的蛋白表達(dá)在AF/MF表型轉(zhuǎn)化過程中沒有變化(結(jié)果未顯示)，但使用ROKα和RhoA的特異性抑制劑Y27632和胞外酶C3阻斷了AF/MF表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SM-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，表明RhoA-ROKα信號(hào)通路確實(shí)參與了AF/MF表型轉(zhuǎn)化過程。而ROKα的蛋白表達(dá)無變化提示TGF-β可能通過加強(qiáng)的ROKα激酶活性來激活該信號(hào)通路。
總之，本發(fā)明證實(shí)了血管外膜存在RhoA/ROKα信號(hào)傳導(dǎo)通路，并且該信號(hào)通路參與了AF向MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程，針對(duì)該信號(hào)通路的研究就可能發(fā)現(xiàn)阻斷乃至逆轉(zhuǎn)AF向MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的方法，從而為逆轉(zhuǎn)血管重塑提供新的策略和思路。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測試組中，向血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測血管外膜成纖維細(xì)胞中ROKα的表達(dá)量；(b)將步驟(a)測試組中ROKα的表達(dá)量與未添加候選物的對(duì)照組中ROKα的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表明該候選物是促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的促進(jìn)劑；如果測試組的ROKα表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑制血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中還包括檢測測試組血管外膜成纖維細(xì)胞中α-SM-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量，并與對(duì)照組中α-SM-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行比較。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中培養(yǎng)物中還添加了α-SM-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的TGF-β1。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血管外膜成纖維細(xì)胞是人、大鼠、小鼠的血管外膜成纖維細(xì)胞。
5.一種RhoA/ROKα通路抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自Y27632胞外酶C、ROKα蛋白的抗體、ROKα的反義核酸。
7.一種RhoA/ROKα通路促進(jìn)劑的用途，其特征在于，用于制備促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的藥物。
8.一種用權(quán)利要求1所述的方法獲得的通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物。
9.一種篩選調(diào)節(jié)血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)的基因的方法，其特征在于，包括步驟(a)建立AF/MF轉(zhuǎn)化模型；(b)用TGF-β1處理AF/MF細(xì)胞；(c)對(duì)AF/MF細(xì)胞進(jìn)行基因分析，分離差異片斷；(d)對(duì)差異片斷測序鑒定，序列分析，獲得MF上調(diào)或下調(diào)基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選通過RhoA/ROKα通路影響血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的化合物的方法，包括步驟(a)在測試組中，向血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測血管外膜成纖維細(xì)胞中ROKα的表達(dá)量；(b)將步驟(a)測試組中ROKα的表達(dá)量與未添加候選物的對(duì)照組中ROKα的表達(dá)量進(jìn)行比較，獲得血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的促進(jìn)劑或抑制劑。本發(fā)明還公開了RhoA/ROKα通路促進(jìn)劑和/或抑制劑的用途。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1928113SQ20051002953
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者高平進(jìn), 朱鼎良, 陳聞東, 張怡, 周曉鷗 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海市高血壓研究所