專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和glgf(pdz/dhr)區(qū)域之間相互作用的化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是得到美國(guó)政府的支持，由美國(guó)衛(wèi)生與人類(lèi)事業(yè)局的國(guó)立衛(wèi)生研究所(NIH)提供資助。基金號(hào)為RO1GM55147-01。因此，美國(guó)政府在此發(fā)明中擁有特定權(quán)利。背景在本申請(qǐng)全文中，各種出版物引證了其作者和年代，其全部引文是按字母順序列于本申請(qǐng)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的結(jié)尾，緊靠在所列的序列和權(quán)利要求之前。這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本申請(qǐng)，以便于更全面地?cái)⑹鲈诒疚乃龅陌l(fā)明完成時(shí)普通技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)。
Fas(APO-1/CD95)和它的配體被認(rèn)為是凋亡(apoptosis)中重要的信號(hào)中介體(Itoh，et al.1991)，F(xiàn)as(Apo-1/CD95)的結(jié)構(gòu)組織形式提示它是腫瘤壞死因子受體超家族中的一個(gè)成員，該超家族還包括p75神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)(Johnson，et al.1986)，T-細(xì)胞-活性標(biāo)記CD27(Camerini，et al..1991)，何杰金-淋巴瘤-相關(guān)抗原CD30(Smith，et al.1993)，人類(lèi)B細(xì)胞抗原CD40(Stamenkovic，etal..1989)，T細(xì)胞抗原OX40(Mallett，et al.1990).Fas以及它的配體的遺傳突變均與小鼠的淋巴組織增殖失調(diào)和自身免疫失調(diào)有關(guān)(Watanabe-Fukunaga，et al.1992；Takahashi，et al.1994)。而且，當(dāng)T-細(xì)胞感染人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)時(shí)，F(xiàn)as表達(dá)水平改變被認(rèn)為是誘導(dǎo)凋亡(Westendorp，et al.1995)。用酵母雙雜交和生化方法已鑒定出幾種Fas-相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)分子，如Fas-結(jié)合的磷酸酶-1(FAP-1)(

圖1)(Sato，et al.1995)，F(xiàn)ADD/MORT1/CAP-1/CAP-2(Chinnaiyan，et al.1995；Boldin，etal.1995；Kischkel，et al.1995) 和RIP(Stanger，et al.1995)。除了FAP-1以外，所有分子都與Fas功能性細(xì)胞死亡區(qū)域有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染了這些蛋白質(zhì)時(shí)，還與FADD/MORT1或RIP過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。相反，F(xiàn)AP-1是唯一的與Fas的負(fù)調(diào)控區(qū)(C-端15氨基酸)有關(guān)(Ito，et al.1993)，并且抑制Fas-誘導(dǎo)的凋亡的蛋白質(zhì)。
FAP-1(PTPN13)有幾種替換的剪接形式與PTP-BAS/hPTPlE/PTPL1一致(Maekawa，et al.1994；Banville，et al. 1994；Saras，etal.1994)。并含有一個(gè)膜結(jié)合區(qū)，它與在細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，ezrin(Gould et al.1989)，radixin(Funayama et al.1991)，moesin(Lankes，et al.1991)，II型神經(jīng)纖維瘤基因產(chǎn)物(NFII)(Rouleau，et al.1993)，和4.1蛋白(Conboy，et al.1991)，以及在PTP酶PTPH1(Yang，et al.1991)，PTP-MEG(Gu，et al.1991)，和PTPD1(Vogel，et al.1993)中發(fā)現(xiàn)的相似。FAP-1包括了令人感興趣6個(gè)GLGF(PDZ/DHR)重復(fù)，被認(rèn)為在蛋白區(qū)域中介導(dǎo)分子內(nèi)和分子間的相互作用。FAP-1的第三個(gè)GLGF重復(fù)首先被確認(rèn)為與Fas受體的C-端具有特異的相互作用區(qū)域(Sato，et al.1995).提示了GLGF區(qū)在將這些蛋白定位于亞膜細(xì)胞骨架和/或調(diào)節(jié)生化活性上起著重要作用。GLGF重復(fù)最初是在鳥(niǎo)苷酸激酶和大鼠的后突觸密度蛋白中(PSD-95)(Cho，et al.1992)發(fā)現(xiàn)的，與果蠅腫瘤抑制蛋白，Lethal-(1)-disc-large-1〔dlg-1〕同源，(Woods，et al.1991；Kitamura，etal.1994)。這些重復(fù)可以介導(dǎo)同源和異源二聚化，此二聚化能強(qiáng)烈地影響PTP酶的活性、影響與Fas結(jié)合、和/或FAP-1同其他信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的相互作用。最近，報(bào)道了這些蛋白的不同PDZ區(qū)域與離子通道和其他蛋白C-端的相互作用(圖1)(表1)(Kornau，et al.1995；Kim，etal.1995；Matsumine，et al.1996)。
表1.與PDZ區(qū)域相互作用的蛋白蛋白C-端序列 相關(guān)蛋白參考文獻(xiàn)Fas(APO-1/CD95) SLV FAP-12NMDA受體 SDV PSD953NR2亞單位Shaker-型K+通道 TDV PSD95&DLG4APC TEV DLG 5發(fā)明概述本發(fā)明提供了一個(gè)組合物，它能夠抑制一種信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和一種含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)(SEQ ID NO1號(hào))氨基酸序列的胞漿蛋白間特異結(jié)合。而且，該胞漿蛋白可認(rèn)包括(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列(SEQ ID NO2號(hào))，其中，“X”代表任何一種從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的氨基酸，“n”代表大于等于2小于等于4。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該氨基酸序列是SLGI(SEQ ID NO3號(hào))。此外，本發(fā)明提供了該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白的羧基端含有(S/T)-X-(V/I/L)(SEQ ID NO4號(hào))氨基酸序列的一種組合物，其中，每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)包含了可相互替換的氨基酸，括號(hào)內(nèi)每個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的，“X”代表任何一種從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的氨基酸。
本發(fā)明也提供一種鑒定化合物的方法，該化合物能夠抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞漿蛋白間的特異結(jié)合。此外，本發(fā)明提供了一個(gè)鑒定化合物的方法，該化合物能夠抑制羧基端含有(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白間的特異結(jié)合。
本發(fā)明也提供了一個(gè)抑制癌細(xì)胞增殖的方法，特別是，所述癌細(xì)胞來(lái)自包括結(jié)腸、肝臟、乳腺、卵巢、睪丸、肺、胃、脾、腎、前列腺、子宮、皮膚、頭部、胸腺和頸部的器官，或這些細(xì)胞來(lái)自T-細(xì)胞或B-細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種對(duì)患者以可有效使所述細(xì)胞發(fā)生凋亡的量的組合物治療癌癥的方法，特別是，癌細(xì)胞來(lái)源于以下器官，包括胸腺、結(jié)腸、肝臟、乳腺、卵巢、睪丸、肺、胃、脾、腎、前列腺、子宮、皮膚、頭部、和頸部，或來(lái)自T-細(xì)胞或B-細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法，特別是，病毒性感染的細(xì)胞是被B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人類(lèi)T-細(xì)胞親淋巴性病毒、I型或HIV感染的。
本發(fā)明也提供一種藥用性組合物，該組合物包含能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白間的特異結(jié)合的組合物。
本發(fā)明也提供一種藥用性組合物，包含被鑒定為能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白間的特異結(jié)合的化合物。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.Fas-結(jié)合的磷酸蛋白酶-1的圖，表明有6個(gè)GLGF(PDZ/DHR)區(qū)重復(fù)；與其他蛋白和含有GLGF(PDZ/DHR)重復(fù)的蛋白的膜結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行相似性比較。
圖2A，2B，2C和2D。Fas C端與FAP-1結(jié)合所需的最小區(qū)域圖譜。右側(cè)的數(shù)字代表每個(gè)單獨(dú)的克隆(圖2C和2D)。
2A用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選隨機(jī)肽基因文庫(kù)的策略。
2B人類(lèi)(SEQ ID NO5號(hào))，大鼠(SEQ ID NO6號(hào))，和小鼠(SEQ ID NO7號(hào))Fas C端15個(gè)氨基酸的排列。
2C篩選半隨機(jī)肽基因文庫(kù)的結(jié)果。頂上一排表示人類(lèi)和大鼠固定同源的氨基酸。破折號(hào)線表示未改變的氨基酸。
2D 篩選隨機(jī)肽文庫(kù)的結(jié)果(分別為SEQ ID NO8號(hào)，SEQ ID NO9號(hào)，SEQ ID NO10號(hào)，SEQ ID NO11號(hào)， SEQ ID NO12號(hào)， SEQ ID NO13號(hào)，SEQ ID NO14號(hào)， SEQ ID NO15號(hào)， SEQ ID NO16號(hào)，
SEQ ID NO17號(hào)，)3A，3B和3C.Fas/FAP-1體外結(jié)合的抑制試驗(yàn)3A 使用Fas C端15個(gè)氨基酸對(duì)Fas/FAP-1結(jié)合的抑制試驗(yàn)。GST-Fas融合蛋白(191-355)用于體外結(jié)合試驗(yàn)(1，3-10泳道)。GST-Fas融合蛋白(191-320)(2泳道)和1mM人類(lèi)PAMP(腎上腺髓質(zhì)素原的N-端20個(gè)氨基酸，分子量2460.9)(3泳道)作為陰性對(duì)照。加入的C-端15個(gè)氨基酸濃度是1μM(4泳道)，3μM(5泳道)，10μM(6泳道)，30μM(7泳道)，100μM(8泳道)，300μM(9泳道)，1000μM(10泳道)。
3B使用相應(yīng)于Fas的C-末端15個(gè)氨基酸的肽進(jìn)行的Fas/FAP-1結(jié)合抑制試驗(yàn)。在這個(gè)抑制試驗(yàn)中所有的合成肽都被乙?；?分別為，SEQ ID NO4號(hào)，SEQ ID NO18號(hào)，SEQ ID NO19號(hào)，SEQ ID NO20號(hào)，SEQ ID NO21號(hào)，SEQ ID NO22號(hào)，SEQ ID NO23號(hào))。
3C將三肽中的一種替換后，對(duì)Fas/FAP-1結(jié)合的抑制效應(yīng)。
圖4A，4B，4C和4D。
4A 在酵母中，F(xiàn)as C-端3個(gè)氨基酸與FAP-1的相互作用。
4B 在體外，F(xiàn)as C-端3個(gè)氨基酸與FAP-1的相互作用。
4C 天然的Fas和GST-FAP-1的免疫沉淀反應(yīng)。
4D Fas/FAP-1與Ac-SLV或Ac-SLY結(jié)合的抑制作用。
圖5A，5B，5C，5D，5E和5F。通過(guò)微注射將Ac-SLV導(dǎo)入DLD-1細(xì)胞系中。三角形表示是可被微注射Ac-SLV的細(xì)胞系并表現(xiàn)出可以鑒定的染色質(zhì)凝集。另一方面，當(dāng)微注射Ac-SLY后，這個(gè)視野內(nèi)僅有一個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
5A相差顯微鏡顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的細(xì)胞的范例。
5B相差顯微鏡顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLV的細(xì)胞的范例。
5C FITC染色顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的細(xì)胞的范例。
5D FITC染色顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLV的細(xì)胞的范例。
5E Hoechst 33342 DNA熒光染色顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLV的細(xì)胞的范例。
5F Hoechst 33342 DNA熒光染色顯示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的細(xì)胞的范例。
圖6 在微注射DLD-1的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的定量測(cè)定。
圖7A，7B，7C，7D，7E，7F，7G，和7H。
7A 人類(lèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的氨基酸序列(序列I，D，24號(hào))。
7B 人類(lèi)CD4受體的氨基酸序列(序列I，D，25號(hào))。
7C Fas-結(jié)合的磷酸蛋白酶-1和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體C-端(NGFR)(p75)的相互作用。
7D 人類(lèi)結(jié)腸直腸突變癌蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO26號(hào))。
7E α型蛋白激酶C的氨基酸序列。
7F 5-羥色胺2A受體的氨基酸序列(SEQ ID NO27號(hào))。
7G 5-羥色胺2B受體的氨基酸序列(SEQ ID NO28號(hào))。
7H 腺上皮結(jié)腸息肉瘤蛋白的氨基酸序列(I.D.29號(hào))。
圖8 p75 NGFR(低-親和性神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體)的結(jié)構(gòu)特征。
圖9 Fas C-末端和p75 NGFR的比較。
圖1035S-標(biāo)記的FAP-1與各種以GST融合蛋白形式表達(dá)的受體在體外的相互作用。該GST融合蛋白是固定在谷胱苷肽-瓊脂糖凝膠珠上，與體外轉(zhuǎn)錄的，35S-標(biāo)記的FAP-1蛋白一起孵育。洗過(guò)珠以后，通過(guò)SDS-PAGE和放射自顯影分析保留的FAP-1蛋白。
圖11A和11B。35S-標(biāo)記的FAP-1與GST-p75缺失突變?cè)隗w外的相互作用。
11A表明含有p75和p75缺失突變的胞漿區(qū)的GST融合蛋白圖解。右側(cè)所描繪的是FAP-1與具有各種p75缺失突變的GST融合蛋白的結(jié)合，根據(jù)(11B)的數(shù)據(jù)。
11B體外轉(zhuǎn)錄的35S-標(biāo)記FAP-1蛋白與固定在谷胱苷肽-瓊脂糖凝膠珠上的各種GST融合蛋白的相互作用。洗過(guò)珠以后，用SDS-PAGE和放射自顯影方法分析保留FAP-1蛋白。
圖12 p75 NGFR的LexA-C-端胞漿區(qū)和VP16-FAP-1之間的結(jié)合。酵母株是通過(guò)轉(zhuǎn)化構(gòu)建的，并檢測(cè)克隆的生長(zhǎng)。+/-表示在His-板上克隆生長(zhǎng)的情況發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在本發(fā)明中，所用的氨基酸殘基縮寫(xiě)如下A，Ala；C，Cys；D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；和Y，Tyr.
為了便于了解以下的實(shí)驗(yàn)材料，常規(guī)的方法和/或?qū)I(yè)術(shù)語(yǔ)，請(qǐng)參閱Sambrook，et al.1989。
本發(fā)明提供了一種組合物，它能夠抑制一種信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞漿蛋白間的特異結(jié)合，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)內(nèi)每個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的。此外，該胞漿蛋白可以含(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，其中，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的，″n″代表大于等于2小于等于4。特別是，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該胞漿蛋白含SLGI的氨基酸序列。
(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列在現(xiàn)有技術(shù)中也被稱(chēng)作“GLGF(PDZ/DHR)氨基酸區(qū)域”。如本申請(qǐng)中所用的“GLGF(PDZ/DHR)氨基酸區(qū)域”意思是指(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白在羧基端有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每一個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的。其中，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。
本發(fā)明的組合物可以是，不僅限于，抗體，無(wú)機(jī)化合物，有機(jī)化合物，肽，模擬肽化合物，多肽或蛋白，共有一些或全部特性的片段或衍生物，如，融合蛋白。該組合物可以是天然存在的并通過(guò)純化得到，或非天然存在通過(guò)合成得到的。
特別是，該組合物可以是含有(S/T)-X-(V/I/L)-COOH序列的肽，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每一個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的?！錢(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽包括下列序列之一DSENSNFRNEIQSLV，RNEIQSLV，NEIQSLV，EIQSLV，IQSLV，QSLV，SLV，IPPDSEDGNEEQSLV，DSEMYNFRSQLASVV，IDLASEFLFLSNSFL，PPTCSQANSGRISTL，SDSNMNMNELSEV，QNFRTYIVSFV，RETIESTV，RGFISSLV，TIQSVI，ESLV。更優(yōu)選的實(shí)施方案是一種有機(jī)化合物，它含有Ac-SLV-COOH序列，其中，Ac代表一個(gè)乙?；總€(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵。
下文中提供了本發(fā)明的一個(gè)例子。乙?；目梢栽诟倪M(jìn)的ChemTechACT357儀器上，按以前發(fā)表的程序以類(lèi)推的方法自動(dòng)合成。每個(gè)循環(huán)用Wang樹(shù)脂，所有的氨基酸用Nα-Fmoc保護(hù)，然后是20％六氫吡啶/DMF，偶聯(lián)是用DIC/HOBt，隨后用HBTU/DIEA完成。最后的氨基酸偶聯(lián)上后，在樹(shù)脂上延伸的肽用Ac2O/DMF乙?；Ｓ肏PLC純化乙?；碾?，通過(guò)FAB-MS和1H-NMR鑒定其特征。
而且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通曉上述與非-乙酰基，例如，氨基，偶聯(lián)的合成肽的構(gòu)建方法。
本發(fā)明也提供了一種組合物，它能抑制羧基端帶有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和一種胞漿蛋白間特異結(jié)合，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)內(nèi)的每個(gè)斜線將可相互替代的氨基酸分開(kāi)，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。
本發(fā)明的組合物包括抗體，無(wú)機(jī)化合物，有機(jī)化合物，肽，模擬肽化合物，多肽或蛋白，共有一些或全部特性的片段或衍生物，例如，融合蛋白。
本發(fā)明也提供一種鑒定一種化合物的方法，該化合物能抑制一種信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞漿蛋白間的特異結(jié)合，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的。該方法包括(a)在允許一種已知的化合物，該化合物曾經(jīng)顯示能替換結(jié)合了胞漿蛋白的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白，和被結(jié)合胞漿蛋白形成復(fù)合物的條件下，將已結(jié)合了信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白的胞漿蛋白與各種化合物接觸；和(b)檢測(cè)步驟(a)中被替換的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白或形成的復(fù)合物，其中，替換作用表示這種化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合。
抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合可以影響報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。
此外，在步驟(b)中，通過(guò)比較在步驟(a)中連接化合物前后報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)鑒定替換的胞漿蛋白或復(fù)合物。這種活性的改變表明信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白間特異結(jié)合受抑制以及信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白被替換。
正如本文中所用的“報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性”表示當(dāng)信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白結(jié)合時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)可在觀察到的水平上改變。人們也可以通過(guò)檢測(cè)基于信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間結(jié)合的其他生物功能來(lái)鑒定這種化合物。報(bào)告基因的例子很多而且技術(shù)上是眾所周知，包括但不僅限于，組氨酸抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，β-半乳糖苷酶基因。
另外，胞漿蛋白是可以結(jié)合在固相支持物上。這種化合物也可以結(jié)合在固相支持物上并包括一種抗體，一種無(wú)機(jī)化合物，一種有機(jī)化合物，一種肽，一種模擬肽化合物，一種多肽或蛋白。
下面提供一個(gè)方法的例子。人們可以用直接鑒定的方法去確認(rèn)一種化合物，該化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，如該胞漿蛋白與結(jié)合了一種可檢測(cè)標(biāo)記的化合物之間的免疫-沉淀。此外，可以使用非直接檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)基因表達(dá)水平的提高或減少。正如下面所討論的，人們能構(gòu)建融合到LexA DNA結(jié)合區(qū)的合成肽。這些構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化到L40-細(xì)胞株的帶有報(bào)告基因的適當(dāng)細(xì)胞系中。然后可以通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平檢測(cè)抑制是否發(fā)生。為了檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平，技術(shù)上熟練的人能應(yīng)用各種熟知的方法，例如，用酵母、哺乳類(lèi)或其他細(xì)胞中的雙雜交系統(tǒng)。
另外，步驟(a)中的接觸可以在體外、體內(nèi)，具體地說(shuō)是在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，如，酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，不僅限于，小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，CHO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，Ltk-細(xì)胞，Cos細(xì)胞等。
其他合適的細(xì)胞包括，但不僅限于，原核或真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞)，真菌細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，或其他動(dòng)物細(xì)胞。
此外，信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白可以是一個(gè)細(xì)胞表面受體，信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，或腫瘤抑制蛋白。特別是，該細(xì)胞表面蛋白是Fas受體，可以在下列細(xì)胞中表達(dá)，該細(xì)胞來(lái)源于下列器官，但不僅限于，胸腺，肝臟，腎臟，結(jié)腸，卵巢，乳腺，睪丸，脾，肺，胃，前列腺，子宮，皮膚，頭部和頸部，或在包含T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，T-細(xì)胞是Jurkat T-細(xì)胞。
另外，細(xì)胞表面受體可以是CD4受體，p75受體，5-羥色胺2A受體，或5-羥色胺2B受體。
此外，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白可以是α-型蛋白激酶C。
另外，腫瘤抑制蛋白可以是腺上皮結(jié)腸息肉瘤抑制蛋白或結(jié)腸直腸突變癌蛋白。
此外，該胞漿蛋白包含SLGI氨基酸序列，特別是，F(xiàn)as-結(jié)合的磷酸酶-1。
本發(fā)明也提供一種鑒定一種化合物的方法，該化合物能抑制羧基端帶有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和一種胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的?！錢(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選出來(lái)的。該方法包括(a)在允許一種已知的化合物，該化合物曾經(jīng)顯示能替換結(jié)合了信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白的胞漿蛋白和被結(jié)合的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白形成復(fù)合物的條件下，將已結(jié)合了胞漿蛋白的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白與各種化合物接觸；和(b)鑒定步驟(a)中被替換的胞漿蛋白或形成的復(fù)合物。其中，替換表示這種化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合。
抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合可以影響報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，在步驟(b)中，通過(guò)比較在步驟(a)中接觸化合物前后報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)鑒定被替換的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白或復(fù)合物，其中，活性的改變表明信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合受抑制和胞漿蛋白被替換。
另外，在步驟(b)中，通過(guò)比較在步驟(a)中接觸化合物前后報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)鑒定被替換的胞漿蛋白或復(fù)合物，其中，活性的改變表示信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白間特異結(jié)合受到抑制和信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白被替換。
正如本文中所用的“報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性”表示當(dāng)信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白結(jié)合時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)可在觀察到的水平上改變。人們也可以通過(guò)檢測(cè)基于信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白的結(jié)合的其他生物功能來(lái)鑒定這種化合物。報(bào)告基因的例子很多而且技術(shù)上是眾所周知，包括，但不僅限于，組氨酸抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，β-半乳糖苷酶基因。
另外，胞漿蛋白是可以結(jié)合在固相支持物上，或這種化合物也可以結(jié)合在固相支持物上，包括一種抗體，一種無(wú)機(jī)化合物，一種有機(jī)化合物，一種肽，一種模擬肽化合物，一種多肽或蛋白。
下面提供一個(gè)方法的例子。人們可以用直接鑒定的方法去確認(rèn)一種化合物，該化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，如該胞漿蛋白和結(jié)合了一種可檢測(cè)標(biāo)記的該化合物的免疫-沉淀反應(yīng)。此外，人們也可用非直接鑒定方法，該方法檢測(cè)基因表達(dá)水平的增加或減少。正如下面所討論的，人們能構(gòu)建融合到LexA DNA結(jié)合區(qū)的合成肽。這些構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化到L40-株的帶有報(bào)告基因的適當(dāng)細(xì)胞系。然后，人們通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)鑒定是否發(fā)生抑制。在本技術(shù)中應(yīng)用各種不同眾所周知的方法，例如，用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平。
另外，步驟(a)中的接觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行，具體地說(shuō)是在酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，不僅限于，小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，CHO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，Ltk-細(xì)胞，Cos細(xì)胞等。
其他合適的細(xì)胞包括，但不僅限于，原核或真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞)，真菌細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，或其他動(dòng)物細(xì)胞。
此外，信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白可以是一個(gè)細(xì)胞表面受體，信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，或腫瘤抑制蛋白。特別是，該細(xì)胞表面蛋白是Fas受體，可以在下列細(xì)胞中表達(dá)，該細(xì)胞來(lái)源于下列器官，但不僅限于，胸腺，肝臟，腎臟，結(jié)腸，卵巢，乳腺，睪丸，脾，肺，胃，前列腺，子宮，皮膚，頭部和頸部，或在包含T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，T-細(xì)胞是Jurkat T-細(xì)胞。
另外，細(xì)胞表面受體可以是CD4受體，p75受體，5-羥色胺2A受體，或5-羥色胺2B受體。
此外，信號(hào)傳導(dǎo)蛋白可以是α-型蛋白激酶C。
另外，腫瘤抑制蛋白可以是腺上皮結(jié)腸息肉瘤抑制蛋白或結(jié)腸直腸突變癌蛋白。
此外胞漿蛋白包含SLGI氨基酸序列，特別是，F(xiàn)as-結(jié)合的磷酸酶-1。
本發(fā)明也提供一種這些細(xì)胞的抑制癌細(xì)胞增殖的方法，特別是所述癌細(xì)胞來(lái)源于，但不限于，胸腺，肝臟，腎臟，結(jié)腸，卵巢，乳腺，睪丸，脾臟，胃，前列腺，子宮，皮膚，頭部和頸部，或這種癌細(xì)胞來(lái)源于包含T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的細(xì)胞。
本發(fā)明提供一種包含用上述方法鑒定的化合物的抑制癌細(xì)胞增殖的方法，其中，癌細(xì)胞來(lái)源于以下器官，但不僅限于此，胸腺，肝臟，腎臟，結(jié)腸，卵巢，乳腺，睪丸，脾臟，胃，前列腺，子宮，皮膚，頭部和頸部，或癌細(xì)胞來(lái)源于包含T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的細(xì)胞。
本發(fā)明也提供一種治療癌癥的方法，包括向患者的癌細(xì)胞中導(dǎo)入以上描述的，能有效引起細(xì)胞凋亡的組合物。其中，癌細(xì)胞來(lái)源于下列器官，但不僅限于此，胸腺，肝臟，腎臟，結(jié)腸，卵巢，乳腺，睪丸，脾臟，胃，前列腺，子宮，皮膚，頭部和頸部，或癌細(xì)胞來(lái)源于包含T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的細(xì)胞。
在本文中所用的，“凋亡”為細(xì)胞程序死亡。細(xì)胞程序死亡的機(jī)制和效應(yīng)不同于細(xì)胞溶解。凋亡的一些可觀察的效應(yīng)是DNA片段化和分解成稱(chēng)之謂凋亡小體的小的膜結(jié)合片段。
鑒定組合物是否能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法在技術(shù)上是眾所周知的。一種方法是用相差或熒光顯微鏡判斷染色質(zhì)形態(tài)學(xué)變化。
本發(fā)明也提供一種抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法，包含上面描述的組合物或上述方法鑒定出的化合物，其中，所述病毒感染的細(xì)胞包括B型肝炎病毒，EB病毒，流感病毒，乳頭瘤病毒，腺病毒，人類(lèi)T-細(xì)胞親淋巴性病毒，1型或HIV感染的細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了一種治療病毒-感染患者的方法。包含向患者被病毒感染的細(xì)胞中導(dǎo)入以上描述的，能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的組合物或以上描述的權(quán)利要求27中的方法鑒定的化合物。其中，病毒感染細(xì)胞包含B型肝炎病毒，EB病毒，流感病毒，乳頭瘤病毒，腺病毒，人類(lèi)T-細(xì)胞親淋巴性病毒，1型或HIV感染的細(xì)胞。
鑒定組合物是否有效抑制細(xì)胞凋亡的方法在技術(shù)上是眾所周知的。一個(gè)方法是用相差或熒光顯微鏡來(lái)判斷染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)的變化。
本發(fā)明提供了一種藥物性組合物，包含有效劑量和在一個(gè)合適藥物性載體的上述的組合物。
本發(fā)明也提供一種藥物性組合物，包含有效劑量的上述方法鑒定出的化合物和一種藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種組合物，它能特異結(jié)合羧基端含有(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每一個(gè)括號(hào)內(nèi)包括了可以相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每一個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。這種組合物可以包括(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每一個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物包括(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。其中，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。“n”代表大于等于2小于等于4。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物包括SLGI氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種鑒定化合物的方法，該化合物能結(jié)合羧基端含(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白，其中，每個(gè)″-″代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包括可相互替換的氨基酸，括號(hào)里的每一個(gè)斜線分開(kāi)的氨基酸是可以替換的，″X(qián)″代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組包含20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。該方法包含(a)，在允許與一種已知的化合物，該化合物曾顯示能結(jié)合信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白并形成一個(gè)復(fù)合物，結(jié)合的條件下，將信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白與多種化合物接觸；和(b)，檢測(cè)步驟(a)中形成的復(fù)合物，以鑒別能與該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白結(jié)合的化合物。特別是，被鑒定的化合物包括(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，被鑒定的化合物包括SLGI氨基酸序列。
此外，以上描述的方法中，該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白可以結(jié)合在一個(gè)固相支持物上。該化合物也可以結(jié)合在一個(gè)固相支持物上，包含抗體，無(wú)機(jī)化合物，有機(jī)化合物，肽，模擬肽化合物，多肽或蛋白。
另外，該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白可以是一個(gè)細(xì)胞-表面受體或信號(hào)傳導(dǎo)體。特別是，該信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白可能是Fas受體，CD4受體，p75受體，5-羥色胺2A受體，5-羥色胺2B受體，或α-型蛋白激酶-C。
本發(fā)明也提供了一種恢復(fù)細(xì)胞中凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)的方法，包含以上描述的組合物或被以上方法鑒定的化合物。
在本文中，“恢復(fù)凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)”是指使細(xì)胞能夠阻止細(xì)胞程序死亡的進(jìn)行。
例如，具有功能性Fas受體和Fas-結(jié)合的磷酸酶-1的細(xì)胞由于通過(guò)磷酸酶引起Fas的負(fù)調(diào)節(jié)，而不能進(jìn)入程序細(xì)胞死亡或凋亡。然而，如果Fas-結(jié)合的磷酸酶1不能結(jié)合到Fas受體的羧基端((S/T)-X-(V/L/I)區(qū))，也就是，在(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列中，至少一個(gè)發(fā)生突變或缺失，細(xì)胞進(jìn)入凋亡。通過(guò)導(dǎo)入能結(jié)合Fas受體的羧基端的化合物，人們能模擬一個(gè)功能性磷酸酶的效應(yīng)，這樣就恢復(fù)了凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)。
本發(fā)明提供了一種預(yù)防細(xì)胞凋亡的方法，包含上述描述的組合物或被以上描述方法鑒定的化合物。
本發(fā)明提供了一種控制由相關(guān)細(xì)胞凋亡引起的疾病，包含以上所描述的組合物或由以上描述的方法鑒定的化合物。
本發(fā)明在以下的具體實(shí)驗(yàn)部分中有詳細(xì)說(shuō)明。這些是為了有助于了解本發(fā)明，但并不意味著，也不應(yīng)當(dāng)被解釋為，限制本發(fā)明的權(quán)利要求。第一部分實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作材料和方法1.篩選半隨機(jī)和隨機(jī)肽基因文庫(kù)為了在限制性的DNA序列中產(chǎn)生許多突變，根據(jù)文獻(xiàn)(Hill等，1987)所敘述的程序，用簡(jiǎn)并寡核苷酸引起突變的PCR方法，基于人與大鼠之間的同源性，設(shè)計(jì)兩種回文序列，用于構(gòu)建半隨機(jī)的基因文庫(kù)。所用的兩個(gè)引物是5’-CGGAATTCNNNNNNNNNAACAGCNNNNNNNNNAATGAANNNCAAAGTCTGNNNTGAGGATCCTCA-3’(Seq.I.D.No.30)和5’-CGGAATTCGACTCAGAANNNNNNAACTTCAGANNNNNNATCNNNNNNNNNGTCTGAGGATCCTCA-3’(Seq.I.D.31)簡(jiǎn)述如下，經(jīng)過(guò)HPLC純化的這兩種引物(每種200pmol)在70℃退火，5分鐘，于23℃冷卻60分鐘，然后在Klenow DNA聚合酶作用下(5u)，于23℃，60分鐘，.用4種核苷酸混合物補(bǔ)平，(每種核苷酸最終濃度為1mM)。加入1μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。乙醇沉淀來(lái)純化DNA。將得到的雙鏈DNA用EcoRI和BamHI酶切。然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)一步純化然后將雙鏈寡核苷酸與pBTM116質(zhì)粒在EcoRI-BamHI位點(diǎn)進(jìn)行連接。將連接混合物電轉(zhuǎn)移到E.Coli XLl-Blue MRF’(Stratagene)菌中以構(gòu)建質(zhì)?；蛭膸?kù)。按以前報(bào)道的方法進(jìn)行大批量轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化到L40細(xì)胞中(MATa，trp1，leu2，his3，ade2，LYS2；(lexAop)4-HIS3，URA3(LexAop)8-LacZ)。該細(xì)胞株攜帶有含有FAP-1cDNA的PVP16-31質(zhì)粒(Sato等，1995)。將在組氨酸-缺陷的培養(yǎng)基中(His+)形成的克隆轉(zhuǎn)移到含有40μg/ml x-gal的平板上，以測(cè)定在平板濾膜實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的蘭色反應(yīng)產(chǎn)物(β-gal+)。對(duì)所篩選的His+和β-gal+克隆進(jìn)行檢測(cè)以用于進(jìn)一步分析。有回文結(jié)構(gòu)的寡核苷酸5’-CGGAATTC-(NNH)4-15-TGAGGATCCTCA-3’(seq.I.D.No32)用于構(gòu)建隨機(jī)的肽基因文庫(kù)。2.肽的合成肽的合成是在新型Chemtech ACT357自動(dòng)合成儀按照以前發(fā)表的類(lèi)似的操作程序自動(dòng)合成(Schnorrenberg和Gerhardt，1989)。每次循環(huán)用Wang樹(shù)脂(用量為0.2-0.3mmole)，所有氨基酸用Nα-Fmoc進(jìn)行保護(hù)。再用20％六氫吡啶/DMF處理去除保護(hù)，用DIC/HOBt然后用HBTU/DIEA進(jìn)行偶聯(lián)。當(dāng)最后一個(gè)氨基酸被偶聯(lián)上之后，用Ac2O/DMF對(duì)樹(shù)脂上延長(zhǎng)的肽進(jìn)行乙?；Ｗ詈笥肨FA處理共同去除所有的保護(hù)基團(tuán)將該肽從樹(shù)脂上分離下來(lái)。乙?；碾慕?jīng)過(guò)HPLC純化后，通過(guò)FAB-MS和1H-NMR鑒定其特征。3.利用Fas C端15個(gè)氨基酸對(duì)Fas/FAP-1結(jié)合進(jìn)行抑制作用的檢測(cè)亞克隆到Bluescript pSK-II載體上的HFAP-10 cDNA的體外翻譯是利用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega TNT lysate)和T7RNA聚合酶在35S-L-甲硫氨酸存在下，從內(nèi)部的甲硫氨酸密碼子開(kāi)始翻譯，得到的35S-標(biāo)記蛋白與GST-Fas融合蛋白于4℃共同孵育16小時(shí)，該GST-Fas融合蛋白在含150mM NaCl，50mM Tris(pH8.0)，5mM DTT，2mM EDTA，0.1％NP-40，1mM PMSF，50μg/ml亮抑素，1mM聯(lián)苯胺和7μg/ml抑肽素的緩沖液中，固定在GST-Sepharose 4B親和層析珠上(Pharmacia)，用同樣的緩沖液徹底洗4次，通過(guò)離心回收帶有谷胱甘肽-Sepharose珠的結(jié)合蛋白，在煮沸的Laemmili緩沖液中洗脫下來(lái)，然后通過(guò)SDS-PAGE和熒光學(xué)的方法進(jìn)行分析。4.Fas末端15個(gè)氨基酸的抑制作用的檢測(cè)和利用各種三肽對(duì)Fas/FAP-1結(jié)合的抑制影響體外翻譯的[35S]HFAP-1經(jīng)過(guò)NAP-5柱的純化后(pharmacia)，與3μM的GST-融合蛋白在4℃孵育16小時(shí)，用結(jié)合緩沖液洗4次，在b計(jì)數(shù)器測(cè)定參入的放射性活性。結(jié)合抑制的百分率按下式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)％＝[使用GST-Fas(19-335)和肽參入的放射活性-使用GST-Fas(191-320)和肽參入的放射活性]/[使用GST-Fas(191-335)沒(méi)有肽時(shí)參入的放射活性-使用GST-Fas(191-320)沒(méi)有肽時(shí)參入的放射活性]。n＝3。5.結(jié)合FAP-1的Fas C端3個(gè)氨基酸在體外和在酵母中的相互作用。
構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pBTM116(LexA)-SLV，-PLV，-SLY/，和SLA并轉(zhuǎn)化到帶有pVP16-FAP-1或ras的L40菌株中，從每種轉(zhuǎn)化體中挑出6個(gè)單獨(dú)的克隆，在組氨酸-缺陷的培養(yǎng)基中分析其生長(zhǎng)情況。用GST-Sepharose4B親和層析珠(Pharmacia)純化GST-Fas，-SLV和PLV。體外結(jié)合的方法如上所述。6.天然的Fas與GST-FAP-1的免疫沉淀反應(yīng)和Fas/FAP-1與Ac-SLV結(jié)合的抑制作用有FAP-和沒(méi)有FAP-1的GST-融合蛋白與表達(dá)Fas的Jurkat T細(xì)胞的細(xì)胞提取物共同孵育。利用抗-Fas單克隆抗體進(jìn)行Western雜交分析以檢測(cè)結(jié)合的Fas(F22120，Transduction Lab)。AC-SLV和AC-SLY三肽用于Fas/FAP-1結(jié)合抑制作用的檢測(cè)。7.顯微注射Ac-SLV到DLD-1細(xì)胞株。將DLD-1人腸癌細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。微注射時(shí)，在35m m的塑料培養(yǎng)皿上，以1×105細(xì)胞/2ml的密度，將細(xì)胞接種在CELLoate(Eppendorf)上，生長(zhǎng)一天。恰好在進(jìn)行微注射之前，加入500 ng/ml的Fas單克隆抗體CH11(MBLinternational)。所有微注射實(shí)驗(yàn)均用自動(dòng)微注射系統(tǒng)操作(Eppendorf transjector 5246 micro-manipalator5171 和Femtotips)(pantel，等，1995)。合成的三肽以100mM的濃度懸浮在0.1％(W/V)FITC-硫酸葡聚糖(Sigma)/K-PBS中。將樣品微注射到DLD-1細(xì)胞漿內(nèi)。注射16-20小時(shí)后，用PBS洗細(xì)胞，然后用PBS配制的10μg/ml Hoechst33342染細(xì)胞。37℃孵育30分鐘后，對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行照相，計(jì)數(shù)染色質(zhì)濃縮的細(xì)胞作為凋亡的細(xì)胞8微注射的DLD-1細(xì)胞中凋亡的定量分析每次實(shí)驗(yàn)，微注射 25-100個(gè)細(xì)胞。微注射后細(xì)胞的凋亡的檢測(cè)是利用相差以及熒光顯微鏡對(duì)形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行評(píng)價(jià)(Wang等，1995)(McGahon，等1995)。數(shù)據(jù)分析是統(tǒng)計(jì)2-3次單獨(dú)測(cè)定的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤。討論為了簽定FAP-1結(jié)合所必須的Fas受體C端區(qū)域的最小肽，我們利用一系列合成的肽和酵母雙雜交系統(tǒng)肽的基因文庫(kù)(圖24)，在體外檢測(cè)Fas/FAP-1結(jié)合的抑制作用。首先構(gòu)建了15種氨基酸融合到LexA DNA結(jié)合區(qū)域的半隨機(jī)基因文庫(kù)(基于人與大鼠之間Fas的同源性)(圖2B和2C)，然后與起初作為FAP-1分離的pVP16-31(Sato，等，1995)共同轉(zhuǎn)化到L40酵母菌中。從5.0×106轉(zhuǎn)化體中(Johnson等1986)篩選出200His+克隆后，挑出100個(gè)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性的克隆用于進(jìn)一步分析。編碼C端15個(gè)氨基酸的文庫(kù)質(zhì)粒的序列分析揭示了所有的C端氨基酸或是纈氨酸，亮氨酸或是異亮氨酸殘基。第二，構(gòu)建了4-15個(gè)氨基酸與LexADNA結(jié)合區(qū)域相融合的隨機(jī)基因文庫(kù)，然后按圖2D的策略進(jìn)行篩選。令人驚奇的是所有C端的第三個(gè)氨基酸都是絲氨酸，而且C端氨基酸分析結(jié)果與半隨機(jī)cDNA文庫(kù)篩選的結(jié)果是一致的。在篩選這些基因文庫(kù)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他的有意義的氨基酸序列，提示最后3個(gè)氨基酸(ts-X-V/L/I)基序?qū)τ谂cFAP-1的第三PDZ區(qū)域的結(jié)合非常重要，并且在蛋白-蛋白之間相互作用以及調(diào)節(jié)由Fas誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步確定是否這最后的3個(gè)氨基酸對(duì)于Fas/FAP-1的結(jié)合是必需的，而且足以滿足其結(jié)合，我們構(gòu)建了LexA-SLV，-PLV，-PLY，-SLY和-SLA融合蛋白的質(zhì)粒，然后與PVP16-FAP-1共轉(zhuǎn)化到酵母中。結(jié)果表明只有LexA-SLV與FAP-1結(jié)合，而LexA-PLV，-PLY，-SLY和-SLA不能結(jié)合(圖4A)。用各種GST-三肽融合體研究體外結(jié)合和在體外翻譯的FAP-1所得的結(jié)果是一致的(圖4B)。
除了酵母雙雜交系統(tǒng)外，也利用了Fas/FAP-1結(jié)合的體外抑制作用檢測(cè)。首先，檢測(cè)C-端15個(gè)氨基酸的合成肽是否能在體外抑制Fas和FAP-1的結(jié)合(圖3A)。體外翻譯的FAP-1與GST-Fas的結(jié)合也顯著地降低而且與合成的FAS的15個(gè)氨基酸的濃度有關(guān)。與這些結(jié)果相比，在同樣的生物化學(xué)條件下，人的PAMP肽(Kitamuta，等1994)作為陰性對(duì)照對(duì)Fas/FAP-1的結(jié)合活性沒(méi)有影響。第二，檢測(cè)截短的Fas C-末端合成肽對(duì)Fas/FAP-1體外結(jié)合的效應(yīng)。正如圖3B所示，對(duì)于Fas/FAP-1的結(jié)合，在C-端只有3個(gè)氨基酸(Ac-SLV)就足以得到與合成的4-15肽所起的抑制影響。進(jìn)一步利用三肽的替換肽，研究Fas/FAP-1的結(jié)合，以決定對(duì)抑制作用所必須的重要的氨基酸(圖3C)。這些結(jié)果揭示了C端的第三個(gè)氨基酸和C-末端氨基酸分別為絲氨酸或蘇氨酸；以及纈氨酸，亮氨酸，或異亮氨酸時(shí)具有最強(qiáng)的抑制效應(yīng)。但是C端第二個(gè)氨基酸中對(duì)于它們的Fas/FAP-1結(jié)合抑制效應(yīng)沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果與酵母雙雜交系統(tǒng)所得結(jié)果(圖2C，2D)是一致的。因此，結(jié)論是C端的三個(gè)氨基酸(SLV)對(duì)于Fas與FAP-1蛋白的第三個(gè)PDZ區(qū)域結(jié)合是決定性的。
為了進(jìn)一步研究在更天然條件下PD Z區(qū)域與ts/T-X-V/L./I之間相互作用的重要意義，我們檢測(cè)了GST融合的FAP-1蛋白與JurkatT細(xì)胞表達(dá)的Fas相互作用的能力。結(jié)果揭示了是Ac-SLV三肽，而不是Ac-SLY三肽取消了FAP-1與從Jurkat T細(xì)胞中提取的Fas蛋白以劑量依賴(lài)的方式相結(jié)合的活性(圖4C和4D)。這些結(jié)果揭示了C-端氨基酸t(yī)SLV對(duì)于FAP-1是最小的結(jié)合位點(diǎn)。而且絲氨酸和頡氨酸對(duì)于這種物理性的結(jié)合是至關(guān)重要的。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推論，即FasC端的3個(gè)氨基酸與FAP-1第三個(gè)PDZ區(qū)域之間的物理結(jié)合對(duì)于體內(nèi)FAP-1作為由Fas介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子的功能是必需的，應(yīng)用微注射的實(shí)驗(yàn)，將合成的三肽注射到大腸癌細(xì)胞株DLD-1，該細(xì)胞株能表達(dá)Fas和FAP-1，并抵抗由Fas誘導(dǎo)的凋亡。這些實(shí)驗(yàn)包括直接將合成的三肽注射到單個(gè)細(xì)胞的胞漿，檢測(cè)體內(nèi)由Fas-誘導(dǎo)的凋亡的生理性反映。結(jié)果顯示，將Ac-SLV微注射到DLD-1細(xì)胞時(shí)有Fas-單克隆抗體存在的情況下(CH11，500ng/ml)，可以顯著地誘導(dǎo)凋亡(圖5A，5E，和圖6)，但是微注射Ac-SLY和PBS/K則不能誘導(dǎo)凋亡(圖5B，5F和圖6)。這些結(jié)果有力地支持了這種推論，即FAP-1與FasC端物理性結(jié)合對(duì)于防止細(xì)胞被Fas-誘導(dǎo)引起凋亡是必需的。
總之，我們發(fā)現(xiàn)了FasC端的SLV對(duì)于結(jié)合到FAP-1第三個(gè)PDZ區(qū)域是唯一必須的，并能滿足其需要。第二，提出了新的tS/T-X-V/L/I的共用基序，而不是tS/T-X-V，被用于與PDZ區(qū)域的結(jié)合。因此很可能除了FAP-1與Fas物理性相互作用外，F(xiàn)AP-1在信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)作用中也起很重要的作用。第三，證明了在大腸癌細(xì)胞中直接注射三肽Ac-SLV可以定向地誘導(dǎo)由Fas-介導(dǎo)的凋亡。進(jìn)一步的研究包括確定FAP-1的底物和結(jié)構(gòu)功能的分析，在癌細(xì)胞中利用Fas/FAP-1的相互作用用于治療以及提供證據(jù)更好地了解FAP-1對(duì)由Fas介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用。第二部分實(shí)驗(yàn)FAP-1原是鑒定為膜結(jié)合蛋白酪氨酸磷酸酶，它與Fas的C端相結(jié)合，有6個(gè)PDZ區(qū)域(也被稱(chēng)作DHR區(qū)域或GLGF重復(fù))。最近研究表明PDZ區(qū)域是作為一種新的特異的蛋白-蛋白之間相互作用模件，而且看來(lái)在膜蛋白的裝配，和在多蛋白的復(fù)合物中與信號(hào)分子連接的過(guò)程中起重要作用。
最近的綜合研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAP-1的第三個(gè)PDZ區(qū)域特異地識(shí)別一個(gè)序列基序t(S/T)-X-V，并與Fas的C-端3個(gè)氨基酸相互作用(圖9)。為了研究FAP-1也與p75NGFR C端區(qū)域相互作用的可能性(圖8)，利用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及通過(guò)用酵母的雙雜交系統(tǒng)將一系列的p75NGFR缺失突變后進(jìn)行分析。結(jié)果揭示p75NGFR C-端胞漿部分與FAP-1相互作用，該p75NGFR C-端胞漿部分在所有的種類(lèi)中是高度保守的(圖10)。而且，p75NCFR C-端的三個(gè)氨基酸SPV是必須的，且足以滿足與FAP-1的第三個(gè)PDZ區(qū)域都相互作用(圖11A，11B)。由于FAP-1在胎兒腦的表達(dá)最高，所以這些結(jié)果暗示FAP-1與p75NGFR之間的相互作用在神經(jīng)細(xì)胞中通過(guò)p75NGFR的途徑進(jìn)行信號(hào)傳遞的過(guò)程中以及在p75NGFR啟始信號(hào)轉(zhuǎn)變復(fù)合物的形成中起重要作用。參考文獻(xiàn)1.Banyille，D.，et al.J.Biol.Chem.26922320-22327(1994).2.Boldin，M.P.et al.J.Biol.Chem.2707795-7798(1995).3.Camerini，D.，et al.J.Immunol.1473165-3169(1991).4.Chao，M.V.and B.L.HempsteadTINS18321-326(1995).5.Chinnaiyan，A.M.，et al.Cell81505-512(1995).6.Cho，K.-O.，et al.Neuron9929-942(1992).7.Conboy，J.G.，et al.J.Biol.Chem.2668273-8280(1991).8.Doyle，D.A.，et al.Cell851067-1076(1996).9.Funayama，N.，et al.J.Cell Biol.1151039-1048(1991).10. Gould，K.L.，et al.EMBO J.84133-4142(1989).11. Gu，M.X.，et ak.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.885867-5871(1991).12. Hill，D.E.，et al.Meth Enzymol.155，558-568(1987).13. Ito，N.，and Nagata，S.J.Biol.Chem.26810932-10937(1993)14.1Itoh，N.et al.Cell66233-243(1991).15.Johnson，D.et al.Cell47545-554(1986).16.Kim，E.，et al.Nature37885-88(1995).17.Kischkel，F(xiàn).C.et al.EMBO J.145579-5588(1995).18.Kitamura，K.et al.FEBS Lett.35135-37(1994).19.Kornau，H.-C.，et al.Science2691737-1740(1995).20.Lankes，W. T.，and Furthmayr，H.Proc.Natl.Acad.
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序列表(1)總信息(i)申請(qǐng)人紐約市哥倫比亞大學(xué)信托人(ii)發(fā)明名稱(chēng)一種抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和GLGF(PDZ/DHR)區(qū)域之間相互作用的化合物及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)目33(iv)通信地址(A)收信人Cooper&Dunham LLP(B)街道1185 Avenue of the Americas(C)城市New York(D)州New York(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵編10036(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0.Version#1.30(vi)目前申請(qǐng)狀態(tài)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1997年7月18日(C)分類(lèi)(viii)代理信息(A)姓名White，John P(B)登記號(hào)28678(C)案號(hào)0575/48962-A PCT/JPW/JKM(ix)通訊資料(A)電話(212)278-0400(B)傳真(212)391-0525(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly/Ser/Ala/Glu Leu Gly Phe/Ile/Leu1(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys/Arg/Gln Xaa(n)Gly/Ser/Ala/Glu Leu Gly Phe/Ile/Leu1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Leu Gly Ile1(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4Ser/Thr Xaa Val/Ile/Leu1(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Ile Ser Asn Ser Arg Asn Glu Asn Glu Gly Gln Ser Leu Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Ser Thr Pro Asp Thr Gly Asn Glu Asn Glu Gly Gln Cys Leu Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Glu Ser Leu Val1(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Thr Ile GlnSer Val Ile1 5(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Arg Gly Phe Ile Ser Ser Leu Val1 5(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ IArg Glu Thr Ile Glu Ser Thr Val1 5(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Gln Asn Phe Arg Thr Tyr Ile Val Ser Phe Val1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Ser Asp Ser Asn Met Asn Met Asn Glu Leu Ser Glu Val1 5 10(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Pro Pro Thr Cys Ser Gln Ala Asn Ser Gly Arg Ile Ser Thr Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ile Asp Leu Ala Ser Glu Phe Leu Phe Leu Ser Asn Ser Phe Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Asp Ser Glu Met Tyr Asn Phe Arg Ser Gln Leu Ala Ser Val Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Ile Pro Pro Asp Ser Glu Asp Gly Asn Glu Glu Gln Ser Leu Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Gln Ser Leu Val1(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Ile Gln Ser Leu Val1 5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Glu Ile Gln Ser Leu Val1 5(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val1 5(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22
Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val1 5(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度427氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys20 25 30Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn35 40 45Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys50 55 60Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr65 70 75 80Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser85 90 95Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly100 105 110Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys115 120 125Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr130 135 140Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His145 150 155 160Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln165 170 175Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr195 200 205Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile210 215 220Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln225 230 235 240Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys245 250 255Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe260 265 270Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gly Gly Ala Asn Ser Arg275 280 285Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Ile His Ser Asp290 295 300Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His305 310 315 320Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr325 330 335Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn340 345 350Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr355 360 365Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg370 375 380Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala385 390 395 400Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser405 410 415Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val420 425(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度458氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys20 25 30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser35 40 45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn50 55 60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65 70 75 80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile85 90 95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu100 105 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn115 120 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Ile Thr Leu Glu130 135 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145 150 155 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu165 170 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys180 185 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser195 200 205Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro210 215 220Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp225 230 235 240Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu245 250 255Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu260 265 270Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu275 280 285Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys290 295 300Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Asn Val Leu Val Val Met Arg Ala Thr305 310 315 320Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro325 330 335Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser340 345 350Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp355 360 365Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile370 375 380Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile385 390 395 400Va1 Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile
405 410 415Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met420 425 430Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Glu Cys Gln Cys Pro435 440 445His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile450 455(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度828氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Asn Ser Gly Val Ala Met Lys Tyr Gly Asn Asp Ser Ser Ala Glu1 5 10 15Leu Ser Glu Leu His Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Lys Gly Asp Ile20 25 30Val Glu Leu Asn Lys Arg Leu Gln Gln Thr Glu Arg Glu Asp Leu Leu35 40 45Glu Lys Lys Leu Ala Lys Ala Gln Cys Glu Gln Ser His Leu Met Arg50 55 60Glu His Glu Asp Val Gln Glu Arg Thr Thr Leu Arg Tyr Glu Glu Arg65 70 75 80Ile Thr Glu Leu His Ser Val Ile Ala Glu Leu Asn Lys Lys Ile Asp85 90 95Arg Leu Gln Gly Thr Thr Ile Arg Glu Glu Asp Glu Tyr Ser Glu Leu100 105 110Arg Ser Glu Leu Ser Gln Ser Gln His Glu Val Asn Glu Asp Ser Arg115 120 125Ser Met Asp Gln Asp Gln Thr Ser Val Ser Ile Pro Glu Asn Gln Ser130 135 140Thr Met Val Thr Ala Asp 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575Asn Asp Arg Ala Ala Val Lys Leu Thr Met Leu Glu Leu Glu Ser Ile580 585 590His Ile Asp Pro Leu Ser Tyr Asp Val Lys Pro Arg Gly Asp Ser Gln595 600 605Arg Leu Asp Leu Glu Asn Ala Val Leu Met Gln Glu Leu Met Ala Met610 615 620Lys Glu Glu Met Ala Glu Leu Lys Ala Gln Leu Tyr Leu Leu Glu Lys625 630 635 640Glu Lys Lys Ala Leu Glu Leu Lys Leu Ser Thr Arg Glu Ala Gln Glu645 650 655Gln Ala Tyr Leu Val His Ile Glu His Leu Lys Ser Glu Val Glu Glu660 665 670Gln Lys Glu Gln Arg Met Arg Ser Leu Ser Ser Thr Ser Ser Gly Ser675 680 685Lys Asp Lys Pro Gly Lys Glu Cys Ala Asp Ala Ala Ser Pro Ala Leu690 695 700Ser Leu Ala Glu Leu Arg Thr Thr Cys Ser Glu Asn Glu Leu Ala Ala705 710 715 720Glu Phe Thr Asn Ala Ile Arg Arg Glu Lys Lys Leu Lys Ala Arg Val725 730 735Gln Glu Leu Val Ser Ala Leu Glu Arg Leu Thr Lys Ser Ser Glu Ile740 745 750Arg His Gln Gln Ser Ala Glu Phe Val Asn Asp Leu Lys Arg Ala Asn755 760 765Ser Asn Leu Val Ala Ala Tyr Glu Lys Ala Lys Lys Lys His Gln Asn770 775 780Lys Leu Lys Lys Leu Glu Ser 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Lys Arg Gly145 150 155 160Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr165 170 175Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser180 185 190Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser195 200 205Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn210 215 220Glu Ser Phe Tnr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu225 230 235 240Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met245 250 255Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser260 265 270Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val275 280 285Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys290 295 300Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro305 310 315 320Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu325 330 335Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys340 345 350Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys355 360 365Ile 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141014151420Asp Ser Pro Gly Gln Thr Met Pro Pro Ser Arg Ser Lys Thr Pro Pro1425143014351440Pro Pro Pro Gln Thr Ala Gln Thr Lys Arg Glu Val Pro Lys Asn Lys144514501455Ala Pro Thr Ala Glu Lys Arg Glu Ser Gly Pro Lys Gln Ala Ala Val146014651470Asn Ala Ala Val Gln Arg Val Gln Val Leu Pro Asp Ala Asp Thr Leu147514801485Leu His Phe Ala Thr Glu Ser Thr Pro Asp Gly Phe Ser Cys Ser Ser149014951500Ser Leu Ser Ala Leu Ser Leu Asp Glu Pro Phe Ile Gln Lys Asp Val1505151015151520Glu Leu Arg Ile Met Pro Pro Val Gln Glu Asn Asp Asn Gly Asn Glu152515301535Thr Glu Ser Glu Gln Pro Lys Glu Ser Asn Glu Asn Gln Glu Lys Glu154015451550Ala Glu Lys Thr Ile Asp Ser Glu Lys Asp Leu Leu Asp Asp Ser Asp155515601565Asp Asp Asp Ile Glu Ile Leu Glu Glu Cys Ile Ile Ser Ala Met Pro157015751580Thr Lys Ser Ser Arg Lys Ala Lys Lys Pro Ala Gln Thr Ala Ser Lys1585159015951600Leu Pro Pro Pro Val Ala Arg Lys Pro Ser Gln Leu Pro Val Tyr Lys160516101615Leu Leu Pro Ser Gln Asn Arg Leu Gln Pro Gln Lys His Val Ser Phe162016251630Thr Pro Gly Asp Asp Met Pro Arg Val Tyr Cys Val Glu Gly Thr Pro163516401645Ile Asn Phe Ser Thr Ala Thr Ser Leu Ser Asp Leu Thr Ile Glu Ser165016551660Pro Pro Asn Glu Leu Ala Ala Gly Glu Gly Val Arg Gly Gly Ala Gln1665167016751680Ser Gly Glu Phe Glu Lys Arg Asp Thr Ile Pro Thr Glu Gly Arg Ser168516901695Thr Asp Glu Ala Gln Gly Gly Lys Thr Ser Ser Val Thr Ile Pro Glu170017051710Leu Asp Asp Asn Lys Ala Glu Glu Gly Asp Ile Leu Ala Glu Cys Ile171517201725Asn Ser Ala Met Pro Lys Gly Lys Ser His Lys Pro Phe Arg Val Lys173017351740Lys Ile Met Asp Gln Val Gln Gln Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Pro1745175017551760Asn Lys Asn Gln Leu Asp Gly Lys Lys Lys Lys Pro Thr Ser Pro Val176517701775Lys Pro Ile Pro Gln Asn Thr Glu Tyr Arg Thr Arg Val Arg Lys Asn178017851790Ala Asp Ser Lys Asn Asn Leu Asn Ala Glu Arg Val Phe Ser Asp Asn179518001805Lys Asp Ser Lys Lys Gln Asn Leu Lys Asn Asn Ser Lys Asp Phe Asn181018151820Asp Lys Leu Pro Asn Asn Glu Asp Arg Val Arg Gly Ser Phe Ala Phe1825183018351840Asp Ser Pro His His Tyr Thr Pro Ile Glu Gly Thr Pro Tyr Cys Phe184518501855Ser Arg Asn Asp Ser Leu Ser Ser Leu Asp Phe Asp Asp Asp Asp Val186018651870Asp Leu Ser Arg Glu Lys Ala Glu Leu Arg Lys Ala Lys Glu Asn Lys187518801885Glu Ser Glu Ala Lys Val Thr Ser His Thr Glu Leu Thr Ser Asn Gln189018951900Gln Ser Ala Asn Lys Thr Gln Ala Ile Ala Lys Gln Pro Ile Asn Arg1905191019151920Gly Gln Pro Lys Pro Ile Leu Gln Lys Gln Ser Thr Phe Pro Gln Ser192519301935Ser Lys Asp Ile Pro Asp Arg Gly Ala Ala Thr Asp Glu Lys Leu Gln194019451950Asn Phe Ala Ile Glu Asn Thr Pro Val Cys Phe Ser His Asn Ser Ser195519601965Leu Ser Ser Leu Ser Asp Ile Asp Gln Glu Asn Asn Asn Lys Glu Asn197019751980Glu Pro Ile Lys Glu Thr Glu Pro Pro Asp Ser Gln Gly Glu Pro Ser1985199019952000Lys Pro Gln Ala Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Ser Phe His Val Glu Asp200520102015Thr Pro Val Cys Phe Ser Arg Asn Ser Ser Leu Ser Ser Leu Ser Ile202020252030Asp Ser Glu Asp Asp Leu Leu Gln Glu Cys Ile Ser Ser Ala Met Pro203520402045Lys Lys Lys Lys Pro Ser Arg Leu Lys Gly Asp Asn Glu Lys His Ser205020552060Pro Arg Asn Met Gly Gly Ile Leu Gly Glu Asp Leu Thr Leu Asp Leu2065207020752080Lys Asp Ile Gln Arg Pro Asp Ser Glu His Gly Leu Ser Pro Asp Ser208520902095Glu Asn Phe Asp Trp Lys Ala Ile Gln Glu Gly Ala Asn Ser Ile Val210021052110Ser Ser Leu His Gln Ala Ala Ala Ala Ala Cys Leu Ser Arg Gln Ala211521202125Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ile Leu Ser Leu Lys Ser Gly Ile Ser Leu
213021352140Gly Ser Pro Phe His Leu Thr Pro Asp Gln Glu Glu Lys Pro Phe Thr2145215021552160Ser Asn Lys Gly Pro Arg Ile Leu Lys Pro Gly Glu Lys Ser Thr Leu216521702175Glu Thr Lys Lys Ile Glu Ser Glu Ser Lys Gly Ile Lys Gly Gly Lys218021852190Lys Val Tyr Lys Ser Leu Ile Thr Gly Lys Val Arg Ser Asn Ser Glu219522002205Ile Ser Gly Gln Met Lys Gln Pro Leu Gln Ala Asn Met Pro Ser Ile221022152220Ser Arg Gly Arg Thr Met Ile His Ile Pro Gly Val Arg Asn Ser Ser2225223022352240Ser Ser Thr Ser Pro Val Ser Lys Lys Gly Pro Pro Leu Lys Thr Pro224522502255Ala Ser Lys Ser Pro Ser Glu Gly Gln Thr Ala Thr Thr Ser Pro Arg226022652270Gly Ala Lys Pro Ser Val Lys Ser Glu Leu Ser Pro Val Ala Arg Gln227522802285Thr Ser Gln Ile Gly Gly Ser Ser Lys Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser229022952300Arg Asp Ser Thr Pro Ser Arg Pro Ala Gln Gln Pro Leu Ser Arg Pro2305231023152320Ile Gln Ser Pro Gly Arg Asn Ser Ile Ser Pro Gly Arg Asn Gly Ile232523302335Ser Pro Pro Asn Lys Ile Ser Gln Leu Pro Arg Thr Ser Ser Pro Ser234023452350Thr Ala Ser Thr Lys Ser Ser Gly Ser Gly Lys Met Ser Tyr Thr Ser235523602365Pro Gly Arg Gln Met Ser Gln Gln Asn Leu Thr Lys Gln Thr Gly Leu237023752380Ser Lys Asn Ala Ser Ser Ile Pro Arg Ser Glu Ser Ala Ser Lys Gly2385239023952400Leu Asn Gln Met Asn Asn Gly Asn Gly Ala Asn Lys Lys Val Glu Leu240524102415Ser Arg Met Ser Ser Thr Lys Ser Ser Gly Ser Glu Ser Asp Arg Ser242024252430Glu Arg Pro Val Leu Val Arg Gln Ser Thr Phe Ile Lys Glu Ala Pro243524402445Ser Pro Thr Leu Arg Arg Lys Leu Glu Glu Ser Ala Ser Phe Glu Ser245024552460Leu Ser Pro Ser Ser Arg Pro Ala Ser Pro Thr Arg Ser Gln Ala Gln2465247024752480Thr Pro Val Leu Ser Pro Ser Leu Pro Asp Met Ser Leu Ser Thr His248524902495Ser Ser Val Gln Ala Gly Gly Trp Arg Lys Leu Pro Pro Asn Leu Ser250025052510Pro Thr Ile Glu Tyr Asn Asp Gly Arg Pro Ala Lys Arg His Asp Ile25152520 2525Ala Arg Ser His Ser Glu Ser Pro Ser Arg Leu Pro Ile Asn Arg Ser253025352540Gly Thr Trp Lys Arg Glu His Ser Lys His Ser Ser Ser Leu Pro Arg2545255025552560Val Ser Thr Trp Arg Arg Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ile Leu Ser Ala256525702575Ser Ser Glu Ser Ser Glu Lys Ala Lys Ser Glu Asp Glu Lys His Val258025852590Asn Ser Ile Ser Gly Thr Lys Gln Ser Lys Glu Asn Gln Val Ser Ala259526002605Lys Gly Thr Trp Arg Lys Ile Lys Glu Asn Glu Phe Ser Pro Thr Asn261026152620Ser Thr Ser Gln Thr Val Ser Ser Gly Ala Thr Asn Gly Ala Glu Ser2625263026352640Lys Thr Leu Ile Tyr Gln Met Ala Pro Ala Val Ser Lys Thr Glu Asp264526502655Val Trp Val Arg Ile Glu Asp Cys Pro Ile Asn Asn Pro Arg Ser Gly266026652670Arg Ser Pro Thr Gly Asn Thr Pro Pro Val Ile Asp Ser Val Ser Glu267526802685Lys Ala Asn Pro Asn Ile Lys Asp Ser Lys Asp Asn Gln Ala Lys Gln269026952700Asn Val Gly Asn Gly Ser Val Pro Met Arg Thr Val Gly Leu Glu Asn2705271027152720Arg Leu Asn Ser Phe Ile Gln Val Asp Ala Pro Asp Gln Lys Gly Thr272527302735Glu Ile Lys Pro Gly Gln Asn Asn Pro Val Pro Val Ser Glu Thr Asn274027452750Glu Ser Ser Ile Val Glu Arg Thr Pro Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser275527602765Lys His Ser Ser Pro Ser Gly Thr Val Ala Ala Arg Val Thr Pro Phe277027752780Asn Tyr Asn Pro Ser Pro Arg Lys Ser Ser Ala Asp Ser Thr Ser Ala2785279027952800Arg Pro Ser Gln Ile Pro Thr Pro Val Asn Asn Asn Thr Lys Lys Arg280528102815Asp Ser Lys Thr Asp Ser Thr Glu Ser Ser Gly Thr Gln Ser Pro Lys282028252830Arg His Ser Gly Ser Tyr Leu Val Thr Ser Val28352840(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度65堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO31CGGAATTCNN NNNNNNNAAC AGCNNNNNNN NNAATGAANN NCAAAGTCTG NNNTGAGGAT 60CCTCA 65(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度65堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO32CGGAATTCGA CTCAGAANNN NNNAACTTCA GANNNNNNAT GTCTGAGGAT 60CCTCA 65(2)SEQ ID NO33的信息(1)序列特(A)長(zhǎng)度65堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO33CGGAATTCNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNTGAGGAT 60CCTCA 6權(quán)利要求
1.一種組合物，它能抑制一種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和一種含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，其中，每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包含可以相互替換的氨基酸，以及括號(hào)內(nèi)斜線分開(kāi)的可相互替換的氨基酸。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中，該胞漿蛋白含有(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，“X”代表任何氨基酸，該氨基酸是從一組含有20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的，“n”大于等于2，小于等于4。
3.權(quán)利要求1的組合物，在該組合物中胞漿蛋白含有SLGI氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的組合物，在該組合物中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的羧基端具有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列，在該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包含可以相互替換的氨基酸，以及括號(hào)內(nèi)斜線分開(kāi)可相互替換的氨基酸，“X”代表任何氨基酸，該氨基酸是從一組含有20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中，該組合物包括一種抗體，一種無(wú)機(jī)化合物，一種有機(jī)化合物，一種肽，一種模擬肽，一種多肽，或一種蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中，該肽包含(s/T)-X-(V/I/L)-COOH序列，在該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)包含可以相互替換的氨基酸，以及括號(hào)內(nèi)斜線分開(kāi)可相互替換的氨基酸，“X”代表任何氨基酸，該氨基酸是從一組含有20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。
7.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含DSENSNFRNEIQSLV氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含RNEIQSLV氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含NEIQSLV氨基酸序列。
10.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含EIQSLV氨基酸序列。
11.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含IQSLV氨基酸序列。
12.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含QSLV氨基酸序列。
13.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含SLV氨基酸序列。
14.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含IPPDSEDGNEEQSLV氨基酸序列。
15.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含DSEMYNFRSQLASVV氨基酸序列。
16.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含IDLASEFLFLSNSFL氨基酸序列。
17.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含PPTCSQANSGRISTL氨基酸序列。
18.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含SDSNMNMNELSEV氨基酸序列。
19.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含QNFRTYIVSFV氨基酸序列。
20.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含RETIESTV氨基酸序列。
21.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含RGFISSLV氨基酸序列。
22.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含TIQSVI氨基酸序列。
23.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，這種肽含ESLV氨基酸序列。
24.權(quán)利要求6的組合物，在該組合物中，該有機(jī)化合物具有Ac-SLV-COOH序列，而Ac代表乙酰基，每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵。
25.一種組合物，它能夠抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和一種胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的羧基端具有氨基酸序列(S/T)-X-(V/I/L)，該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包含的氨基酸是可以相互替換的，每個(gè)括號(hào)內(nèi)用“/”分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的，“X”代表任何一種氨基酸，該氨基酸是從一組含有20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中，該組合物包括一種抗體，一種無(wú)機(jī)化合物，一種有機(jī)化合物，一種肽，一種模擬肽化合物，一種多肽或蛋白質(zhì)。
27.一種鑒定一種化合物的方法，該化合物能抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間特異結(jié)合，該胞漿蛋白含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，在該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包含的氨基酸是可以相互替換的，每個(gè)括號(hào)內(nèi)用“/”分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的，該方法包括(a)，在允許一種已知的化合物和被結(jié)合的胞漿蛋白之間結(jié)合形成復(fù)合物的條件下，該化合物曾經(jīng)顯示能替換結(jié)合了胞漿蛋白信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白，將已結(jié)合了信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白的胞漿蛋白的與各種已知的化合物接觸；和(b)鑒定步驟(a)中被替換的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白或形成的復(fù)合物，其中，替換作用表示這種化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合。
28.權(quán)利要求27的方法，其中，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和該胞漿蛋白之間的特異結(jié)合的抑制影響報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。
29.權(quán)利要求28的方法，在步驟(b)中被替換的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白或該復(fù)合物的檢測(cè)是通過(guò)比較步驟(a)中與該化合物接觸前后報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)進(jìn)行的，其中該活性的改變表明該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和該胞漿蛋白之間的特異結(jié)合被抑制而該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白被替換。
30.權(quán)利要求27的方法，該方法中胞漿蛋白是結(jié)合到固相支持物上。
31.權(quán)利要求27的方法，該方法中化合物是結(jié)合到固相支持物上。
32.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物包含一種抗體、一種無(wú)機(jī)化合物、一種有機(jī)化合物、一種肽、一種模擬肽化合物、一種多肽或蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求27的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在體外進(jìn)行的。
34.權(quán)利要求27的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在體內(nèi)進(jìn)行的。
35.權(quán)利要求34的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在酵母細(xì)胞中進(jìn)行的。
36.權(quán)利要求34的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行的。
37.權(quán)利要求27的方法，其中，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種細(xì)胞表面蛋白。
38.權(quán)利要求27的方法，該方法中該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種信號(hào)傳導(dǎo)子蛋白。
39.權(quán)利要求27的方法，其中，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種腫瘤抑制蛋白。
40.權(quán)利要求37的方法，該方法中該細(xì)胞表面蛋白是Fas受體。
41.權(quán)利要求40的方法，該方法中該Fas受體是在來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸器官的細(xì)胞中表達(dá)的。
42.權(quán)利要求40的方法，該方法中Fas受體是在包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)的。
43.權(quán)利要求37的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是CD4受體。
44.權(quán)利要求37的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是p75受體。
45.權(quán)利要求37的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是血小板素2A受體。
46.權(quán)利要求37的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是血小板素2B受體。
47.權(quán)利要求38的方法，該方法中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是蛋白激酶C-α型。
48.權(quán)利要求39的方法，該方法中腫瘤抑制蛋白是腺上皮息肉腸腫瘤抑制蛋白。
49.權(quán)利要求39的方法，該方法中腫瘤抑制蛋白的蛋白是結(jié)腸直腸突變癌蛋白。
50.權(quán)利要求27的方法，該方法中該胞漿蛋白含有SLGI氨基酸序列，在該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)內(nèi)包含可以相互替換的氨基酸，每個(gè)括號(hào)內(nèi)用“/”分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的。
51.權(quán)利要求40的方法，該方法中該胞漿蛋白是Fas結(jié)合的磷酸酶-1。
52.一種鑒定一種化合物的方法，該化合物能夠抑制在羧基端有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和一種胞漿蛋白之間的特異結(jié)合，在該氨基酸序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)包含可相互替換的氨基酸，每個(gè)“/”分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的，“X”代表任何氨基酸，該氨基酸是從一組含有20種天然存在的氨基酸中選擇出來(lái)的，包括(a)在允許一種已知的化合物和被結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白之間形成復(fù)合物的條件下，該化合物曾經(jīng)顯示能替換結(jié)合于信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白的胞漿蛋白，將已結(jié)合了該胞漿蛋白的信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白與各種化合物接觸；和(b)鑒定步驟(a)中被替換的胞漿蛋白或形成的復(fù)合物，其中，替換作用表示這種化合物能抑制信號(hào)-傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合。
53.權(quán)利要求52的方法，其中，信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合的抑制影響報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。
54.權(quán)利要求53的方法，在步驟(b)中被替換的胞漿蛋白或復(fù)合物的檢測(cè)是通過(guò)比較步驟(a)中與化合物接觸前后，報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)進(jìn)行的，其中該活性的改變表明信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合被抑制以及胞漿蛋白被替換。
55.權(quán)利要求52的方法，該方法中胞漿蛋白是結(jié)合到固相支持物上。
56.權(quán)利要求52的方法，該方法中化合物是結(jié)合到固相支持物上。
57.權(quán)利要求52的方法，該方法中該化合物包括一種抗體、一種無(wú)機(jī)化合物、一種有機(jī)化合物、一種肽、一種模擬肽化合物、一種多肽或蛋白質(zhì)。
58.權(quán)利要求52的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在體外進(jìn)行的。
59.權(quán)利要求52的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在體內(nèi)進(jìn)行的。
60.權(quán)利要求59的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在酵母細(xì)胞中進(jìn)行的。
61.權(quán)利要求59的方法，該方法中步驟(a)中的接觸是在哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行的。
62.權(quán)利要求52的方法，其中，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種細(xì)胞表面受體。
63.權(quán)利要求52的方法，該方法中該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種信號(hào)傳導(dǎo)子蛋白。
64.權(quán)利要求52的方法，其中，該信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是一種腫瘤抑制蛋白。
65.權(quán)利要求62的方法，該方法中該細(xì)胞表面蛋白是Fas受體。
66.權(quán)利要求65的方法，該方法中Fas受體是在來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸器官的細(xì)胞中表達(dá)的。
67.權(quán)利要求65的方法，該方法中該Fas受體是在含有T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)的。
68.權(quán)利要求62的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是CD4受體。
69.權(quán)利要求62的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是p75受體。
70.權(quán)利要求62的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是血小板素2A受體。
71.權(quán)利要求62的方法，該方法中細(xì)胞表面受體是血小板素2B受體。
72.權(quán)利要求63的方法，該方法中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是蛋白激酶C-α型。
73.權(quán)利要求64的方法，該方法中腫瘤抑制蛋白是腺上皮息肉腸腫瘤抑制蛋白。
74.權(quán)利要求64的方法，該方法中腫瘤抑制蛋白是結(jié)腸直腸突變癌蛋白。
75.權(quán)利要求52的方法，該方法中該胞漿蛋白含有SLGI氨基酸序列，在該序列中每個(gè)“-”代表一個(gè)肽鍵，每個(gè)括號(hào)包含可以相互替換的氨基酸，每個(gè)括號(hào)內(nèi)用“/”分開(kāi)的氨基酸是可以相互替換的。
76.權(quán)利要求52的方法，該方法中該胞漿蛋白是Fas結(jié)合的磷酸酶-1。
77.一種包含權(quán)利要求1組合物的抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
78.權(quán)利要求77的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
79.權(quán)利要求77的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
80.一種包含權(quán)利要求25組合物的抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
81.權(quán)利要求80的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
82.權(quán)利要求80的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
83.一種包含了通過(guò)權(quán)利要求27的方法所鑒定的化合物的抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
84.權(quán)利要求83的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
85.權(quán)利要求83的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
86.一種包含了通過(guò)權(quán)利要求52的方法所鑒定的化合物的抑制癌細(xì)胞增殖的方法。
87.權(quán)利要求86的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
88.權(quán)利要求86的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
89.一種對(duì)患者治療腫瘤的方法，包括向患者的癌細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求1的組合物。
90.權(quán)利要求89的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
91.權(quán)利要求89的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
92.一種對(duì)患者治療腫瘤的方法，包括向患者的癌細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求25的組合物。
93.權(quán)利要求92的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
94.權(quán)利要求92的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
95.一種對(duì)患者治療腫瘤的方法，包括向患者的癌細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求27的方法鑒定出的化合物。
96.權(quán)利要求95的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸的器官。
97.權(quán)利要求95的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
98.一種對(duì)患者治療腫瘤的方法，包括向患者的癌細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求52的方法簽定的化合物。
99.權(quán)利要求98的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括胸腺、肝臟、腎臟、腸、卵巢、乳腺、睪丸、脾臟、胃、前列腺、子宮、皮膚、頭、和頸器的器官。
100.權(quán)利要求98的方法，該方法中癌細(xì)胞來(lái)自包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞。
101.一種包含權(quán)利要求1的組合物的抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法。
102.一種包含權(quán)利要求25的組合物的抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法。
103.一種包含通過(guò)權(quán)利要求27的方法鑒定的化合物的抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法。
104.一種包含通過(guò)權(quán)利要求52的方法鑒定的化合物的抑制病毒感染細(xì)胞增殖的方法。
105.權(quán)利要求101的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
106.權(quán)利要求102的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
107.權(quán)利要求103的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
108.權(quán)利要求104的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
109.一種治療病毒感染患者的方法，包括向患者的病毒感染的細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求1的組合物。
110.一種治療病毒感染方法，包括向患者的病毒感染的細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求25的組合物。
111.一種治療病毒感染方法，包括向患者的病毒感染的細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求27的方法鑒定出的化合物。
112.一種治療病毒感染方法，包括向患者的病毒感染的細(xì)胞中導(dǎo)入可有效使該細(xì)胞凋亡的量的權(quán)利要求52的方法鑒定出的化合物。
113.權(quán)利要求109的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
114.權(quán)利要求110的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
115.權(quán)利要求111的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
116.權(quán)利要求112的方法，該方法中病毒感染細(xì)胞包括B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、人T細(xì)胞親淋巴病毒1型或HIV。
117.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求1的組合物和一種藥用可接受的載體。
118.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求25的組合物和一種藥用可接受的載體。
119.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求27的方法鑒定出的化合物和一種藥用可接受的載體。
120.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求52的方法鑒定出的化合物和一種藥用可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種組合物,它能夠抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合。本發(fā)明也提供了一種鑒定一種能夠抑制信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和胞漿蛋白之間的特異結(jié)合的化合物。本發(fā)明也提供了一種抑制癌細(xì)胞增殖的方法。本發(fā)明也提供了用一種化合物以可有效使細(xì)胞凋亡的量治療癌癥的方法。本發(fā)明也提供了一種抑制病毒感染的細(xì)胞繁殖的方法。本發(fā)明還提供了一種用一種化合物以可有效使細(xì)胞凋亡的量治療病毒感染患者的方法。本發(fā)明也提供了藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1230120SQ97197769
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年7月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月22日
發(fā)明者塔卡－阿克·薩托, 朱恩·柳-薩瓦 申請(qǐng)人:紐約市哥倫比亞大學(xué)信托人