專利名稱：可斷裂信號元件裝置和方法
相關(guān)申請交叉文獻本申請是美國臨時申請No.60/021,367(1996年7月8日提交)和60/030,416(1996年11月1日提交)的部分續(xù)展申請，其內(nèi)容納入本文作參考。
1．引言本發(fā)明涉及診斷和檢測液體中的少量物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于測定裝置的可斷裂信號元件，尤其是一種可斷裂的、信號反射元件。在本發(fā)明的較佳實例中，采用這種信號元件的測定裝置用標準的激光為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)(如CD-ROM讀頭、DVD讀頭等)進行檢測。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的測定裝置來檢測分析物的分析方法。本發(fā)明的信號元件、測定裝置和測定方法能檢測一份試樣中多種不同的分析物以及多份樣品中的一種分析物。
2．發(fā)明背景2.1小規(guī)模臨床測定直到最近，用來檢測液體中少量分析物的大多數(shù)臨床診斷測定還只是采用單獨的測試；即，對單份樣品進行單獨測試來檢測個別的分析物。近來，通過設(shè)計出了制備多份樣品和自動加入試劑的裝置以及能平行或迅速連續(xù)地快速分析多種試樣的裝置，提高了效率，節(jié)約了成本。這些自動制備試劑裝置和多重自動分析儀通常被整合成一個裝置。
這類大型臨床實驗室分析儀可在一個小時內(nèi)自動或半自動地進行數(shù)百次準確測定。然而，這些分析儀十分昂貴，只有集中化實驗室和大型醫(yī)院才有。分析儀集中就必須要運送樣品，這樣就不能經(jīng)常對時間緊迫的樣品作應(yīng)急分析。
因此，能降低該專用分析儀的成本且分布更廣的簡化臨床測定就顯得更為必需。這種努力的局限性在于臨床測試的設(shè)計，測試方法應(yīng)適合在患者身旁或在患者的房內(nèi)使用而不需有專用的檢測儀。血糖和妊娠試驗是熟知的例子。
盡管該類有用的試驗已有多年，但是自大約1980年起，主要的技術(shù)革新是固相免疫測定和其它條帶測試(strip test)。最值得注意的是Advance＂試驗(Johnson&Johnson)、RAMP＂hCG測定(Monoclonal Antibodies,Inc.),Clear Blue Easy＂(Unipath Ltd.)和ICON(Hybritech)。
Clear Blue Easy＂的所有試劑在層壓膜上，它用交聯(lián)的著色膠乳微球作為信號試劑。它采用毛細管遷移免疫濃縮形式。ICON是雙重單克隆夾心式免疫濃縮測定。該測定方法曾經(jīng)采用反射率小的儀器來定量測定。否則，所有這些方法均只是定性的。
遷移距離可作為定量測定的基礎(chǔ)。商業(yè)上可購得的是Quantab＂(EnvironmentalTest Systems),AccuLevel＂(Syva),AccuMeter＂(ChemTrak),Clinimeter＂(CrystalDiagnostics)和Q.E.D.＂(Enzymatics)。最新的一種是溫度計型測定裝置(Ertinghausen G.美國專利No.5,087,556)，該裝置目前還沒有市售。這些系統(tǒng)可用來測定常規(guī)的化學(xué)分析物，如膽固醇以及治療藥物的血液水平。
這些方式的一個缺點是，只可同時方便地進行一個或幾個測定。
為了填補大批量分析儀和條帶測試之間的空白，一些小型的儀器被開發(fā)出來。最值得注意的Eclipse ICA＂(Biotope,Inc.)。該裝置是臺式、隨機存取的自動離心免疫測定和化學(xué)系統(tǒng)。將患者的樣品吸入置于轉(zhuǎn)子中的盒中。在約17分鐘內(nèi)可進行16次測試。結(jié)果用UV/可見光光譜測定或熒光測定。測試中需要四種不同類型的盒。每種盒有相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。
盡管已經(jīng)有了這些進展，但是仍然需要有一種簡單的裝置，該裝置容易用于多重定量測定，最好不需要專門的檢測器。
2.2空間可尋址探針陣列最近已經(jīng)在固體載體上構(gòu)造出了不同生物材料的空間可尋址陣列。這些探針陣列可同時分析多種分析物。例子是固定在固體載體上捕獲互補分析物的寡核苷酸或肽陣列。Fodor等(Nature,Vol.364,1993年8月5日)描述了這樣一種系統(tǒng)。連接在固體載體上的短的寡核苷酸探針與液體樣品中長的DNA鏈中的互補序列結(jié)合；然后根據(jù)收集的雜交數(shù)據(jù)用計算機來計算核酸樣品的序列。
在Fodor等描述的測定系統(tǒng)中，陣列被倒置在緊靠含有標記靶分子的貯液槽上的溫度調(diào)節(jié)流動單元上。為了區(qū)分表面結(jié)合的分子，系統(tǒng)需要一個非常靈敏的檢測儀。
因此，仍需要一種經(jīng)濟的系統(tǒng)，以簡化形式制成空間可尋址的探針陣列，該陣列既容易檢測又能在一步或盡可能少的步驟中測定液體試樣中的多種測試物(即分析物)或多種液體試樣中的一種測試物或分析物。
2.3空間可尋址的激光為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)一些用于電子應(yīng)用的裝置能對數(shù)字信息進行空間尋址檢測。特別是，根據(jù)差示反射性和透射性的信息記錄潛在力，已經(jīng)開發(fā)出了幾種格式。
在常規(guī)音頻或CD-ROM光盤上，通過在盤上形成凹痕將數(shù)字信息或數(shù)字編碼的模擬信息編碼在圓形塑料盤上。這些凹痕通常約為用來讀取盤上信息的激光入射光束波長的八分之一至四分之一。盤上的凹痕在反射光束中引起破壞性干擾，該干擾對應(yīng)于二進制的“0”位。平的盤表面將激光反射回檢測器，檢測器給予相應(yīng)的二進制“1”位。
在另一常規(guī)情況中，反射光密度有改變的為“1”，而光密度恒定的對應(yīng)于“0”。
由于盤中已經(jīng)形成的有規(guī)則的凹痕來自“0”位和“1”位預(yù)定分布的母拷貝，因此能對產(chǎn)生的被檢測器收到的信號進行處理，以再現(xiàn)母盤中編碼的相同信息。
標準的光盤用12cm聚碳酸酯基材、金屬化反射層以及保護性漆涂層制成。目前CD和CD-ROM的格式在ISO9660工業(yè)標準中有所描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
聚碳酸酯基材是光學(xué)質(zhì)量清晰的聚碳酸酯。在標準的壓制或大批量制備的CD中，數(shù)據(jù)層是聚碳酸酯基材的一部分，在模塑過程中用印模(stamper)將數(shù)據(jù)壓成一系列凹痕格式。在該過程中，通常是在高壓下將熔融的聚碳酸酯注入模具中，然后冷卻，使聚碳酸酯具有模具(或者說“印?！?的鏡像圖形；因而，在盤上產(chǎn)生了代表盤基材上二進制數(shù)據(jù)的凹痕，在母盤制作過程中，這些凹痕以印模凹痕的鏡像圖象格式被保留在聚碳酸酯基材中。印模母盤通常是玻璃。
凹痕以連續(xù)螺旋形式壓制在CD基材中。施加在其上的金屬反射層(通常是鋁)確定了固體聚碳酸酯基材的形狀，并且根據(jù)“凹痕”的有元將激光束差示地反射到讀取裝置上。在金屬反射層上旋涂(spincoat)丙烯酸天然漆薄層，保護其免受磨損和腐蝕。
盡管內(nèi)容相同并與CD讀頭兼容，但是可擦寫光盤(CD-R)中的信息是以不同方式記錄的。在CD-R中，數(shù)據(jù)層與聚碳酸酯基材分開。聚碳酸酯基材上壓有連續(xù)的螺旋凹槽作為引導(dǎo)入射激光的地址。數(shù)據(jù)層用有機染料制成。盡管花青是用于這些盤的首選材料，但是通常用金屬穩(wěn)定化的花青化合物來代替“原料”花青。另一種材料是酞菁。在美國專利No.5,580,696中描述了一種金屬酞菁化合物。
在CD-R中，有機染料層被夾在聚碳酸酯基材和金屬化反射層之間，該金屬反射層的介質(zhì)通常是24克拉金，但也可以是銀。信息通過有合適預(yù)選波長的刻錄激光來刻錄，激光選擇性地在染料層中熔融形成“凹痕”，而不在染料中燒出通孔，它只是使染料稍稍熔化，使其變得非半透明，這樣就使得讀取激光束被折射而不是象標準壓制的CD中的物理凹痕那樣被反射回讀頭的傳感器上。如同標準CD中那樣，漆涂層可保護攜帶信息的層。
基于與光盤相同的理論，目前正在開發(fā)其它用來刻錄和儲存信息的物理格式在基材上產(chǎn)生差示反射率或折射率并用激光來讀取。
這樣一種格式稱為數(shù)字視頻盤(DVD)。DVD的外觀與標準CD相似它的直徑為120mm(4.75英寸)，外表象銀色的盤子，中間有一個通孔用來嚙合可旋轉(zhuǎn)的驅(qū)動裝置。和CD一樣，數(shù)據(jù)記錄在盤上微小凹痕的螺旋軌跡中，盤用激光束來讀取。與CD(在ISO9660標準下，可大約儲存約6億8千萬數(shù)字字節(jié))相反，DVD可儲存47-170億數(shù)字字節(jié)。DVD的更大容量是通過將凹痕制得更小、螺旋制得更緊密(即，減少螺旋間距)和將數(shù)據(jù)記錄在多達四層中(盤每面各兩層)來實現(xiàn)的。凹痕越小，間距越緊密，讀取激光波長就越要小。盡管較小的波長與標準壓制的CD兼容，但是它與目前的染料為基的CD-R卻不兼容。
下表比較了DVD和CD的特點
因此，單面/單層DVD可有4.7GB的數(shù)字信息。單面/雙層DVD可有8.5GB的信息。雙面/單層盤可有9.4GB信息，而雙面/雙層DVD有高達17GB的信息。
每種DVD由兩片0.6mm厚的基材粘結(jié)在一起組成。根據(jù)容量的不同，盤可以有1-4層信息層。在8.5GB和17GB選項中，采用了一種半反射體，以便從盤一面進入兩層信息層。
對于8.5GB和17GB的DVD選項來說，每一面的第二信息層可注塑在第二基材中，或可以光聚合物層的形式添加。在任何一種情況下，均需要一層半反射物層使兩信息層可從盤的一面讀取。對于17GB的DVD來說，需要制成雙層基材并將它們粘結(jié)起來。
DVD激光讀頭被設(shè)計成能將其焦距調(diào)節(jié)至任一層的厚度，這樣就能迅速、自動地讀取兩層。
所有上述三種格式均需要圓盤能旋轉(zhuǎn)。DVD系統(tǒng)的標稱恒定線速度為3.5-4.0米/秒(比雙層級中較大凹痕稍快)，它是標準CD速度(1.2mps)的3倍多。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了用于定量和定性測定裝置和方法的可斷裂信號元件。
可斷裂信號元件包含一個可斷裂的間隔物(spacer)，該間隔物有一個與基材連接的末端，一個響應(yīng)信號的末端，以及基材連接末端和信號響應(yīng)末端間的斷裂位點。該可斷裂信號元件還包括與可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端相連的信號響應(yīng)物。
信號元件上有與所選分析物第一位點連接的第一側(cè)鏈成員以及與所述分析物第二位點相連接的第二側(cè)鏈成員。第一和第二側(cè)鏈成員賦予對可斷裂信號元件的分析物專一性。
第一側(cè)鏈成員與所述信號響應(yīng)末端和所述斷裂位點間的可斷裂間隔物相連，而第二側(cè)鏈成員與所述斷裂位點和所述基材連接末端間的可斷裂間隔物相連。
盡管所述第一和第二成員間的斷裂位點隨后會發(fā)生斷裂，但是所選分析物同時與可斷裂元件第一側(cè)鏈成員和第二側(cè)鏈成員的結(jié)合仍可將信號響應(yīng)物束縛在信號元件的基材連接末端上；相反，如果所選分析物不能與可斷裂信號元件的第一和第二側(cè)鏈成員同時結(jié)合，則通過斷裂會失去信號元件的信號響應(yīng)物。在樣品和斷裂劑接觸后，信號的有無可分別表示分析物的存在與否。
另一方面，本發(fā)明提供了一種測定裝置，該裝置包括一個固體載體基材，其上有多個可斷裂信號元件以空間可尋址方式與之相連。在一些測定裝置實例中，固體載體宜為塑料，而在這些例子中，最佳的是聚碳酸酯。在一些實例中，固體載體被制成碟狀，其尺寸最好能兼容于已有的激光反射為基礎(chǔ)的檢測器(如音頻光盤(CD)讀頭、只讀存儲器光盤(CD-ROM)讀頭、數(shù)字視頻盤(DVD)讀頭等)的檢測。
在某些較佳的測定裝置實例中，連接的可斷裂信號元件的信號響應(yīng)物可反射或散射入射光，尤其是入射激光。在這些可斷裂的反射信號元件實例中，信號響應(yīng)物可以是金屬微球，較佳的是基本由金組成的微球，最佳的是直徑為1-3μm的金微球。這些實例適用于在已有的激光反射為基礎(chǔ)的裝置(如音頻CD、CD-ROM或DVD讀頭)中檢測。
本發(fā)明另一方面是在已有的測定方法中采用本發(fā)明的可斷裂信號元件為基礎(chǔ)的測定裝置。通常，適于用本發(fā)明可斷裂信號元件為基礎(chǔ)的測定裝置的測定方法包括下列步驟使測定裝置與液體樣品接觸，使測定裝置與能夠斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測連接在固體載體基材上的、受分析物束縛的、斷裂的信號元件的信號響應(yīng)物是否存在。
測定裝置上的信號元件的空間可尋址性允許鑒定與不同信號元件結(jié)合的分析物，包括在單個測定中鑒定多種分析物。
因此，本發(fā)明在一個實例中提供了核酸雜交測定方法，其中可斷裂信號元件的第一和第二側(cè)鏈元件包括寡核苷酸。測定樣品中的核酸與可斷裂信號元件的第一和第二側(cè)鏈元件同時結(jié)合可防止信號元件的信號響應(yīng)末端通過斷裂而丟失。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種測定裝置，該裝置包含響應(yīng)多個核酸序列的可斷裂信號元件。本發(fā)明這一方面提供了一種裝置和方法，通過與含核酸樣品接觸時產(chǎn)生的信號的空間可尋址性，可對核酸進行測序。
本發(fā)明還提供了免疫測定方法。在這些實例中，可斷裂信號元件中賦予專一性的側(cè)鏈元件包括抗體、抗體片段或抗體衍生物。分析物同時與第一側(cè)鏈元件抗體以及第二側(cè)鏈元件抗體結(jié)合可防止信號元件的信號響應(yīng)末端通過斷裂而丟失。
另一方面，本發(fā)明提供了一種測定裝置，該裝置包含一個固體載體基材，該基材與多個可斷裂的信號元件相連，該基材上還編碼有計算機軟件形式的數(shù)字信息。
4．附圖簡述參看了下列附圖后就能更好地了解本發(fā)明。


圖1A是多個可斷裂間隔物的示意圖，間隔物的表面連接末端與測定裝置基材的衍生位點共價連接；圖1B描述了反射信號裝置(金屬微球)連接到多個可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端上形成可斷裂的反射信號元件；圖2A是核酸雜交測定的示意圖，測定在加入含有核酸的樣品后立即使用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件；圖2B表示圖2A所示測定步驟的下一步，其中樣品中的寡核苷酸結(jié)合到第一可斷裂信號元件的互補寡核苷酸側(cè)鏈元件上，但不與第二可斷裂信號元件中不同的第二組寡核苷酸側(cè)鏈元件結(jié)合；圖2C是圖2A和2B所示測定步驟在間隔物分子斷裂之后下一階段的示意圖。反射性金微球不受試樣中互補寡核苷酸專一性雜交的束縛，它從測定裝置的表面上除去，從而提供了空間可尋址、差異反射信號；圖2D-2E表示本發(fā)明的一個方面，其中在試樣中加入可溶的寡核苷酸能增加核酸雜交測定的靈敏度；圖2F表示，在采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件的核酸檢測測定裝置中，使用DNA連接酶可提高分析物專一性結(jié)合的強度，分析物專一性結(jié)合將可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端與測定裝置的衍生基材連接在一起，從而提高了洗滌嚴格性和測定專一性；圖3A表示采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件的免疫測定方法。圖3A描述了用連接在多個信號元件可斷裂間隔物側(cè)鏈元件上的抗體來結(jié)合可能存在于試樣中的抗原表位位點；圖3B表示圖3A所示測定步驟的下一步，它描述了樣品中的抗原與一個可斷裂信號元件中的兩個抗體結(jié)合，而樣品中的抗原不與連接在第二可斷裂信號元件上的第二組抗體側(cè)鏈元件結(jié)合；圖3C表示圖3A和3B所示測定方法在信號元件間隔物斷裂后的一個階段。反射性金微球不受試樣抗原與信號元件抗體專一性橋接的束縛，它從測定裝置表面中除去，從而提供了空間可尋址、差異反射的信號；圖4A到4G表示固體載體基材的制備過程，可斷裂反射信號元件按照預(yù)定樣式排列在該基材上，從而形成本發(fā)明的空間可尋址的測定裝置；圖5A示出了本發(fā)明中一個典型的可斷裂反射信號元件的可斷裂間隔物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化學(xué)結(jié)構(gòu)表示在連接測定裝置衍生塑料基材表面后且在用寡核苷酸側(cè)鏈成員衍生前的間隔物分子結(jié)構(gòu)，其中piv表示新戊酰保護基團，MMT表示單甲氧基三苯甲游基，n和m各自表示大于等于1的整數(shù)；圖6進一步表示可斷裂間隔物分子，該示意圖特別描述了間隔物分子上易斷裂的位點，并進一步指出受Piv和MMT基團保護的側(cè)鏈成員的連接部位；圖7A至7C表示可斷裂間隔物分子與測定裝置基材的活化表面連接的方式。在描述的實施例中，圖7A所示基材的胺化表面被轉(zhuǎn)變成圖7B所示的活性酯。如圖7C所示，可斷裂間隔物分子通過活化的酯被連接到固體載體上；圖8A和8B表示第一寡核苷酸側(cè)鏈成員連接多個可斷裂間隔物分子斷裂位點的表面連接側(cè)時的中間步驟；圖9A和9B表示第二寡核苷酸成員連接多個可斷裂間隔物分子斷裂位點的信號響應(yīng)側(cè)連接的中間步驟；圖10A表示本發(fā)明基本完整的可斷裂反射信號元件的可斷裂間隔物分子，其狀態(tài)為分子已連接到測定裝置的固體基材上并在微球與可斷裂間隔物分子的信號響應(yīng)末端連接前；圖10B表示單個反射性顆粒與圖10A中可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端的連接，該連接完成了本發(fā)明的可斷裂反射信號元件；圖11A至11G描述了可斷裂反射性元件在平的圓盤基材上的各種空間可尋址排列樣式，其中圖11A特別確定了盤基材上可編碼的地址線(adress line)，根據(jù)該地址線可以測定可斷裂間隔物的位置。在圖11A中，可斷裂間隔物分子排列在環(huán)形軌跡中；圖11B表示可斷裂信號元件的螺旋排列樣式，并且特別確定了特別適于嚙合旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置的盤圓環(huán)中央通孔；圖11C表示一種可斷裂信號元件的排列樣式，該樣式適于平行地測定多份樣品，并能同時在中央軌道中編碼解釋軟件；圖11D示出了一個實例，其中測定裝置基材被進一步細微制作以隔開各測定扇區(qū)(sector)，從而能在加樣時轉(zhuǎn)動測定裝置而不必混合樣品；圖11E示出了一個實例，其中測定裝置基材被進一步細微制作成迫使樣品在測定裝置旋轉(zhuǎn)時單向流動；圖11F表示可斷裂信號元件空間有組織地排列樣式，這種樣式每次能測定20份樣品中的每份樣品中的50種不同的分析物；圖11G示出了一種正交交叉的樣式，這種樣式通過螺旋與螺旋方向或螺旋特性相反的螺旋臂重疊產(chǎn)生；圖12是檢測圖11A測定裝置產(chǎn)生的分析物專一性信號的示意圖；圖13是用來在連接固體基材之前將寡核苷酸側(cè)鏈成員印到可斷裂間隔物上的印模(stamp)實例。如圖所示，印模由印模片和進料片組成。印模片有通孔，通孔內(nèi)裝有通過帶通道的進料片加入的所需化學(xué)物質(zhì)。通道再與一玻璃毛細管陣列連接。在這種排列方式中，一排孔中裝有相同的化學(xué)物質(zhì)?？梢愿鶕?jù)需要采用不同的孔和通道方式；
圖14表示寡核苷酸側(cè)鏈元件的排列樣式，該樣式是采用圖13所示印模用通過兩階段正交印制(orthogonal printing)來獲得的。數(shù)字1、2、3和4代表合成中采用的不同的亞磷酰胺序列。在采用三聚物(timer)的寡核苷酸合成中，例如，1可以是AAA,2可以是AAC,3是AAG,4是AAT。每個位置中的第一個數(shù)字給出了最接近可斷裂間隔物骨架的寡核苷酸構(gòu)建塊(building block)；第二個數(shù)字(如果有的話)代表下一個構(gòu)建塊。當要將本發(fā)明的可斷裂反射信號元件排列在盤狀基材上時，正交印制是特別有利的；圖15表示在連接固體基材之前，用于將大量寡核苷酸側(cè)鏈成員同時印制到可斷裂間隔物上的互補凹板印制過程(complementary concave printing process)。圖中沒有顯示出可斷裂間隔物本身；圖16示出了一種結(jié)構(gòu)，其中單個樣品被平行地引入測定裝置的四個不同的扇區(qū)。如果四個扇區(qū)中的生物碼元(biobit)的密度或親和性不同，則通過檢測每個陽性可斷裂信號元件扇區(qū)中距加樣位置最遠的位置，可以測定很大的動態(tài)濃度范圍；圖17表示分散有可斷裂間隔物的另一種測定裝置結(jié)構(gòu)，其中對第一分析物有專一性的側(cè)鏈元件與測定裝置基材直接連接，而對第二分析物有專一性的側(cè)鏈元件與信號響應(yīng)物直接連接，該信號響應(yīng)物在這里表示為塑料微球；圖18示出了分散有可斷裂間隔物的另一種結(jié)構(gòu)，其中第一側(cè)鏈元件與測定裝置基材直接連接，第二側(cè)鏈元件與信號響應(yīng)物直接連接，分析物使信號響應(yīng)物凝集。
5．發(fā)明詳述本發(fā)明的測定裝置和測定方法是用可斷裂信號元件來檢測液體試樣中的分析物。與預(yù)選的受檢測分析物的結(jié)合防止了信號元件中信號響應(yīng)物通過斷裂而丟失。然后，通過受束縛信號元件的信號響應(yīng)物產(chǎn)生信號來報告樣品中有分析物存在。
在一個較佳的實例中，信號響應(yīng)物反射或散射入射光，或者可用光來尋址。與預(yù)選的受檢測分析物的結(jié)合防止了信號元件光響應(yīng)物通過斷裂而丟失。然后，通過受束縛信號元件的反射物使入射光(較佳的是入射激光)反射或散射來報告樣品中有分析物存在。
本發(fā)明的可斷裂反射信號元件特別適于采用已有的激光反射為基礎(chǔ)的檢測器(包括音頻光盤(CD)讀頭、CD-ROM(只讀光盤)讀頭、激光盤讀頭、DVD(數(shù)字視頻盤)讀頭等)來檢測。因此，通過采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件，就很容易使已有的測定化學(xué)物質(zhì)和測定方案能利用普遍安裝的已有的激光反射為基礎(chǔ)的檢測器來進行檢測。這樣就使得每個測定的成本要低于采用專用檢測器的標準測定。
而且，激光反射為基礎(chǔ)的檢測器的普遍分布還使采用本發(fā)明可斷裂反射信號元件的測定能現(xiàn)場使用(目前則必須在有專用檢測器的地方進行)。這些測定是免疫測定、細胞計數(shù)、基于雜交的遺傳檢測、基于核酸測序的遺傳檢測、核酸測序等。因此，本發(fā)明使得這些目前還必須在大型實驗室中進行的測定能在研究實驗室、診所和個人家中進行。
上述的各種激光反射為基礎(chǔ)的檢測器(包括CD-ROM讀頭、DVD讀頭等)適于檢測、辨別和解釋其各自介質(zhì)上的空間可尋址的數(shù)字信息音頻CD讀頭能專一性地、單獨地尋址單獨數(shù)字編碼的聲道；CD-ROM讀頭能專一性地、單獨地尋址多個二進制文件，其中包括編碼計算機程序的二進制文件(ISO9660，納入本文作參考，該標準確定了常見的可尋址文件結(jié)構(gòu))；DVD讀頭能專一性地、單獨地尋址二進制文件和MPEG-編碼的數(shù)字視頻信號。
激光反射為基礎(chǔ)的檢測器的空間尋址能力目前是用來檢測和解釋CD上編碼的信息等，它為采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件的測定提供了特別的優(yōu)點。
因此，通過多個信號元件在一個載體成員或基材上的排列樣式與尋址這些單個信號元件空間位置的檢測器使用相結(jié)合，就能同時測定一份樣品中多種不同的分析物。因此，本發(fā)明還涉及測定裝置，這些裝置在這里統(tǒng)稱為盤(disk)、生物光盤(bio-compact disk)、生物CD(bio-CD)或生物DVD(bio-CD)，其包含具有不同分析物專一性的可斷裂反射信號元件的空間可尋址組合。這些有用的組合包括提高每個單獨測定的預(yù)定值或?qū)Ｒ恍缘慕M合、在不同診斷中包括(inculpate)或不包括(exculpate)特定診斷的組合、提供廣泛的常規(guī)篩選工具的組合等。
專一性相同的多個信號元件按一定樣式的排列還使得能用一個測定裝置來檢測單份分析物較大的濃度范圍。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種測定裝置，該裝置包含專一性相同的空間可尋址的、可斷裂反射信號元件，反射信號元件的物理位置能表達濃度信息。
激光反射為基礎(chǔ)的數(shù)字檢測器的空間可尋址能力還能將解釋軟件和測定元件結(jié)合在一個測定裝置上。因此，本發(fā)明另一方面是一種測定裝置，在該裝置上，軟件被編碼在不同于可斷裂反射信號元件排列樣式區(qū)域的區(qū)域中。軟件可以包括校正入射激光軌跡的重要信息、測定的解釋算法、標準對照值、自診斷等。軟件可以包括裝置的驅(qū)動程序和能遠程傳送診斷信息的軟件。軟件可以包括臨床測定用的患者教育信息，并能選擇觀眾。
本發(fā)明的可斷裂反射信號元件展示的基本上為二進制的測定數(shù)據(jù)還使測定有顯著的抗儀器噪擾的優(yōu)點。例如，小的光反射偏差(有激光源光強度的微小偏差和反射顆粒大小的微小偏差)通常不會影響測定結(jié)果，因為當光反射達到臨界值時檢測器只會記錄一個信號。同樣，檢測裝置本身的電子噪擾以及與模-數(shù)轉(zhuǎn)換有關(guān)的噪擾也不會影響測定結(jié)果。這個優(yōu)點在設(shè)計和生產(chǎn)用于現(xiàn)場測定或在困難環(huán)境操作條件下進行測定的功能增強的檢測儀器時是特別希望的。
5.1空間可尋址的、可斷裂的反射信號元件在參看了附圖1-3后，就能更加了解本發(fā)明的可斷裂反射信號元件(也稱為生物碼元“bio-bit”)的大致操作，這些附圖示出了本發(fā)明的兩個實例。如圖1所示，基材20上有一個衍生的表面21，該表面與可斷裂間隔物分子30相連，每個可斷裂間隔物除了有一個與表面連接的末端外，還有一個靠近金屬微球40的信號響應(yīng)末端。基材可以是多孔的或是固體(但固體較佳)，它可以選自各種材料，如塑料、玻璃、云母、硅等。然而，由于塑料價格便宜、易衍生來連接間隔物分子至表面，并且與已有的激光反射為基礎(chǔ)的檢測器(如CD-ROM和DVD讀頭)兼容，因此塑料是較佳的?？刹捎玫牡湫偷乃芰鲜蔷郾⒕郾┧狨?、聚乙烯醇、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯。較佳的是聚丙烯和聚碳酸酯，最佳的為聚碳酸酯。
基材20的表面21可方便地衍生來為每個可斷裂間隔物分子30提供共價鍵。金屬球為檢測與測定裝置基材20結(jié)合的間隔物分子存在與否提供了方便的反射性信號產(chǎn)生方式。典型的金屬是金、銀、鎳、鉻、鉑、銅等，而金是較佳的，因為它容易且牢固結(jié)合(例如通過配價結(jié)合)可斷裂間隔物信號響應(yīng)末端的游離的SH基團。金屬球可以是固體金屬，或由塑料、玻璃珠等制成然后熔敷一層金屬層。也可用其它反射性材料來代替金屬。較佳的金球應(yīng)直接結(jié)合到可斷裂間隔物信號響應(yīng)末端的巰基上。
每個可斷裂間隔物分子的一端31與載體表面21相連(例如通過酰胺鍵)，另一端32與信號產(chǎn)生裝置(也稱為信號響應(yīng)物)相連(例如通過巰基殘基與反射性金屬微球40相連)。間隔物分子有一個斷裂位點33，在測定步驟中，該斷裂位點易受化學(xué)方式或酶方式、熱、光等作用(這要視斷裂位點的性質(zhì)而定)而斷裂?；瘜W(xué)方式宜采用硅氧烷斷裂基團和氟化鈉溶液(它們分別是典型的化學(xué)斷裂位點和化學(xué)斷裂劑)。也可采用其它易斷裂的基團，如酯基團或聯(lián)硫基團。如果在使間隔物斷裂后加入金球，則聯(lián)硫基團是特別佳的。
斷裂位點33在可斷裂間隔物分子30的表面連接第一末端31和信號響應(yīng)第二末端32之間。間隔物可含有兩個或多個斷裂位點以優(yōu)化所有間隔物的全部斷裂。
側(cè)鏈成員(也稱為側(cè)臂)34a和34b為可斷裂間隔物提供了分析物專一性，它們位于斷裂位點33的相對側(cè)；即，分別靠近可斷裂間隔物分子30的表面連接末端和信號響應(yīng)末端。側(cè)鏈成員34a和34b的典型構(gòu)型包括寡核苷酸，通常為5-20聚物，較佳的為8-17聚物，最佳的為8-12聚物，但是也可采用更長的寡核苷酸。側(cè)鏈成員也可包括(沒有限制，根據(jù)需要確定)肽、肽的有機連接物或蛋白質(zhì)等。測定裝置(也稱為盤、生物相容的盤或BCD)固體表面21的任何特定衍生部位上均有大量可斷裂間隔物分子30存在。
本發(fā)明一方面是使寡核苷酸側(cè)鏈成員適于結(jié)合試樣中存在的互補單鏈核酸?；パa寡核苷酸包括專一性結(jié)合堿基對的成員，即一個寡核苷酸會與第二個互補的寡核苷酸結(jié)合。
如圖2A至2C中更具體的描述(表示本發(fā)明的一個實例)，測定裝置表面上不同部位的可斷裂間隔物分子有不同的寡核苷酸側(cè)鏈成員。如圖2A所示，一個可斷裂信號元件有寡核苷酸側(cè)鏈成員34a和34b，而第二個可斷裂信號元件有寡核苷酸側(cè)鏈成員35a和35b。
如圖2A至2C中進一步表述的，當與含寡核苷酸36的試樣接觸時，互補的寡核苷酸側(cè)鏈成員34a和34b會結(jié)合樣品中的寡核苷酸，形成如圖2B所示的雙螺旋。由于寡核苷酸36與寡核苷酸側(cè)鏈成員35a和35b之間沒有互補性，所以這些基團之間沒有結(jié)合(如圖2B中進一步描述的)。
當斷裂位點33斷開時，如果沒有雙螺旋結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合的話，金屬微球40會脫離表面。這在圖2C中有更詳細地描述。如果希望測定多份樣品中的一種寡核苷酸，則不同部位的間隔物分子大致有相同的寡核苷酸側(cè)鏈成員。然后可通過入射光(尤其是入射激光)是否有反射來檢測金屬微球40的存在與否。
圖2F表示本發(fā)明的另一核酸檢測實例中采用DNA連接酶來提高分析物專一性結(jié)合(該結(jié)合將可斷裂間隔物信號響應(yīng)末端與測定裝置衍生基材連接起來)的強度，因此該實施例提高了洗滌嚴格性和測定專一性。
核酸檢測領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當知道，本發(fā)明的可斷裂反射信號元件特別適用于檢測有確定大小的擴增核酸，尤其是用各種形式的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、采用T7和SP6 RNA聚合酶擴增方案等擴增的核酸。
在圖3A至3C描述的本發(fā)明另一個實例中，寡核苷酸側(cè)鏈成員34a、34b、35a和35b與修飾的抗體38a、38b、38c和38d非共價連接，從而能進行免疫測定。修飾的抗體與側(cè)鏈成員間的非共價連接通過可斷裂間隔物側(cè)鏈成員寡核苷酸與共價連接到抗體上的寡核苷酸之間的互補性來介導(dǎo)。用互補核酸分子來實現(xiàn)超分子結(jié)構(gòu)的非共價、組合裝配的方法在共有的待批美國專利申請08/332,514(1994年10月31日提交)、08/424,874(1995年4月19日提交)、08/627,695(1996年3月29日提交)中有更詳細的描述，這些內(nèi)容納入本文作參考。在另一個實例中，抗體可用常規(guī)交聯(lián)劑直接或通過接頭與可斷裂間隔物共價連接。
抗體包括第一專一性結(jié)合對的第一個成員和第二專一性結(jié)合對的第一個成員。第一專一性結(jié)合對的第二個成員以及第二專一性結(jié)合對的第二個成員是感興趣抗原的不同表位位點。更具體地講，寡核苷酸側(cè)鏈成員35a與抗體-寡核苷酸38c相連，而寡核苷酸側(cè)鏈成員35b與抗體-寡核苷酸38d相連。抗體38c和38d可與可能存在于試樣中的抗原的不同表位位點結(jié)合?！翱乖喜煌谋砦晃稽c”指相同表位上或不同部位的不同表位中不同的、空間上分開的位點。在第二個測定元件中，寡核苷酸側(cè)鏈成員34a和34b與不同的抗體38a和38b相連，而這些抗體的每一個與抗原的不同表位位點相連。
進一步參看圖3A-3C表示的免疫測定，在將含有抗原39的測試溶液施加到圖3A所示的一批可斷裂反射信號元件上時，抗原39與抗體34a和34b結(jié)合，從而防止了金屬微球40在斷裂位點33斷裂(例如通過與化學(xué)斷裂劑的接觸)時從測定裝置表面20上解耦下來。相反，第二可斷裂信號元件由于抗體35a和35b沒有與抗原39結(jié)合的親和力而不與抗原39結(jié)合，從而使金屬微球40與固體表面分開并從樣品中除去。
然后可通過入射光(尤其是入射激光)反射存在與否來檢測金屬微球40的存在與否。
很明顯，如圖所示的抗體的結(jié)合很容易使標準免疫測定化學(xué)物質(zhì)和免疫測定空間結(jié)構(gòu)能采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件。在這些經(jīng)典的免疫測定結(jié)構(gòu)中，有一些在美國專利No.5,168,057(1992年12月1日公開，納入本文作參考)中有進一步的描述。因此很明顯，圖3中示意的分析物直接測定方法唯一適用于本發(fā)明可斷裂反射信號元件和測定裝置的免疫測定幾何結(jié)構(gòu)。本發(fā)明在篩選人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人皰疹病毒的免疫測定中特別有價值。
更應(yīng)明白，抗體只是廣義的專一性結(jié)合對中的典型，其中抗體可被認為是專一性結(jié)合對的第一成員，而它結(jié)合的抗原是專一性結(jié)合對的第二成員。通常，專一性結(jié)合對可定義為兩個分子，這兩個分子間的相互親和性具有足夠的親和性和專一性來實現(xiàn)本發(fā)明。因此，本發(fā)明的可斷裂反射信號元件可包括其它專一性結(jié)合對成員作為側(cè)鏈元件。在這些實例中，可斷裂信號元件的第一側(cè)鏈成員是第一專一性結(jié)合對的第一成員，可斷裂間隔物的第二側(cè)鏈成員是第二專一性結(jié)合對的第一成員，其中所述第一專一性結(jié)合對的所述第二成員和所述第二專一性結(jié)合對的所述第二成員相互連接，形成有以下通式的系鏈環(huán)第一專一性結(jié)合對的第一成員-第一專一性結(jié)合對的第二成員-第二專一性結(jié)合對的第二成員-第二專一性結(jié)合對的第一成員。
該領(lǐng)域熟知的專一性結(jié)合對是生物受體及其天然的拮抗劑和拮抗配體、蛋白質(zhì)和輔因子、生物素和親和素或鏈霉親和素、α血影蛋白和β血影蛋白單體、抗體Fc部分和Fc受體。
盡管上述列舉的實例(核酸分析物定向檢測和定向免疫測定)描述成在進行測定前使反射金屬球與可斷裂間隔物分子連接，但是在本文中作進一步描述的這些以及其它實例中，可以考慮首先使缺少信號產(chǎn)生裝置的可斷裂間隔物分子暴露在樣品中，然后使間隔物分子斷裂，這樣，后加入的金屬球只與殘留在表面上的那些間隔物分子連接。在加入金屬球后，可以用合適的檢測器來檢測表面，以確定結(jié)合的間隔物分子和分析物。
在本發(fā)明的每個測定方法實例中，待測樣品必須首先加入。一方面，測定裝置是轉(zhuǎn)動的，液體樣品(最好是稀釋的)加在圓形測定裝置基材的中心附近。測定裝置盤轉(zhuǎn)動產(chǎn)生的離心力使液體樣品分布在固體基材的平的表面上。通過這種方式，基材表面被均勻地覆蓋上恒定、均勻分布的液體樣品。
在這種施加樣品的方法中，將試樣(最初約為100μl)稀釋成約1ml以便進行處理。將該溶液滴加在轉(zhuǎn)動盤的中心附近。測定部位(可能是盤表面)是親水的，液體會在轉(zhuǎn)動的測定裝置盤上形成一層非常薄的層。液體層厚度可通過滴加頻率和盤轉(zhuǎn)動頻率來調(diào)節(jié)。較佳的厚度應(yīng)小于10μm，這樣，樣品中所有的分子就能和間隔物連接的靜止分子相互作用。覆蓋盤需要約100μl的樣品溶液。
施加樣品的其它方法可以和本發(fā)明的可斷裂反射信號元件以及測定裝置一起使用。特別是，應(yīng)當明白，上述轉(zhuǎn)動施加主要適用于在每個測定裝置中施加單份樣品。本發(fā)明另一方面可能需要將不同樣品施加到靜止盤的具體區(qū)域。在這種情況下，測定系統(tǒng)可以測定大約1000種不同的樣品。每種樣品可用大約100萬個施加在盤上預(yù)定區(qū)域中的金球。
圖11D顯示了有16個不同測定區(qū)的本發(fā)明測定裝置。圖11E顯示了樣品流動方向的一種可能，其中直線表示阻礙液體流動的擋板。
因此，在本發(fā)明的一個實例，測定裝置被設(shè)計成每個測定裝置(盤)能同時測定例如1024位患者樣品中的一種分析物(即每個盤包含多個賦予相同分析物專一性的相同側(cè)鏈成員的可斷裂間隔物)。在這樣的實例中，盤上的每個間隔物分子可以相同，以便測定相同的分析物；盤上特定位置處的間隔物分子與盤上其它位置處間隔物分子相同。這種應(yīng)用特別適用于臨床實驗室中進行的大批量分析(同時測定大量患者樣品中是否有單個分析物存在)。
也應(yīng)理解，在包括不同分析物專一性的可斷裂反射信號元件的單個測定裝置中可測定多份樣品中的多種分析物。圖11F顯示了可用來篩選20份樣品中50種不同的生物分子的測定裝置。
在以下的例子中，可以測定多份試樣中限制量的相同分析物。患者的樣品可以通過熟知的方法(如噴墨印制(ink jet printing)和有一次性滴頭的微量移液管陣列或它們的組合)施加到盤的特定部位。對于大批量的操作，測定盤可以裝在盒子，試樣可以直接密封載在盤上或圓形平板的孔內(nèi)。
在培育合適的時間(只需幾秒，使樣品在載體表面上橫向移動)后，進行洗滌(但是在一些實例中不需要洗滌)，除去未結(jié)合的樣品。如同常規(guī)測定那樣調(diào)節(jié)洗滌嚴格性，以調(diào)節(jié)靈敏度和專一性。例如，在核酸檢測實例中，可以降低洗滌溶液的鹽濃度以提高洗滌嚴格性，減少分析物和賦予專一性的側(cè)鏈成員間的不匹配；或可增加鹽濃度，降低洗滌嚴格性，允許不匹配發(fā)生。在本發(fā)明的核酸雜交和免疫測定實例中，洗滌嚴格性的調(diào)節(jié)是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
一方面，在需要時，可以將洗滌溶液加到轉(zhuǎn)動盤中心附近來洗滌圓形盤的表面。樣品溶液在推出盤周圍離開盤，并被收集。由于盤的轉(zhuǎn)動，如果液體樣品能用正常的離心力從盤上除去且不需要調(diào)節(jié)洗滌嚴格性的話，則可以不進行洗滌。
在洗滌(如果有的話)后，加入包含斷裂劑的溶液，并再次分布在盤表面上。參看圖1-3，間隔物分子有一個斷裂位點33，在測定步驟中，該斷裂位點易受化學(xué)或酶方式、熱、光等作用(這要視斷裂位點的性質(zhì)而定)而斷裂。化學(xué)方式宜采用硅氧烷斷裂基團，而氟化鈉溶液是針對硅氧烷基團的典型的化學(xué)斷裂劑。也可采用其它易斷裂的基團，如酯基團或聯(lián)硫基團。如果在斷裂間隔物后加入金球，則聯(lián)硫基團是特別佳的。
當斷裂位點是硅氧烷(它對自發(fā)水解非常穩(wěn)定，但是在少量濃度的氟離子下很容易斷裂)時，加入氟化鈉溶液，溶液的濃度為1mM-1M，較佳的為50mM-500mM，最佳的為100mM(0.1M)。斷裂步驟只持續(xù)幾秒。盡管在該步驟中所有的間隔物都已被斷裂，但是可斷裂間隔物與測定裝置衍生基材間的酰胺鍵仍在這些條件下保持穩(wěn)定。
在施加樣品并斷裂間隔物后，必須除去分離的信號產(chǎn)生物(較佳的是反射物，更佳的是金屬球，最佳的是金球)，以便在檢測時提供差異信號。除去的步驟可以包括引入洗滌溶液的第二次洗滌步驟。
由于采用不同的洗滌嚴格性，在測定的該步驟中可以有幾種方法，從而使不同的測定方法有不同的專一性和靈敏度。
一方面，可以通過轉(zhuǎn)動測定裝置(加入或不加入洗滌溶液)來除去分離的反射物。在這一方面，三個參數(shù)(金顆粒大小、轉(zhuǎn)動速度和間隔物連接的化合價)可以不同，以提供不同的嚴格性。
適用于本發(fā)明的可斷裂反射信號元件和測定裝置的不同直徑(直徑在1nm至0.5-5微米)的金球易從Aldrich Chemical Company,British BioCell International,Nanoprobes,Inc.及其它處購得。生產(chǎn)本發(fā)明所需的更大或更小的金球是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。在一固定的轉(zhuǎn)動速度下，最大的金球受到的更大的離心力(與r3成比例)和阻力(與r成比例)，它在有相同鍵合程度的較小的球之前離開。這就為洗滌與定量分析的不同嚴格性提供了基礎(chǔ)。
通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動頻率也可調(diào)節(jié)影響金球的離心力，以除去較松的、結(jié)合較弱的金球。只有已經(jīng)與樣品中互補分子結(jié)合的間隔物才能繼續(xù)使金球結(jié)合到基材上。
另外，盡管本發(fā)明的上述實例描述了一個金球與一個可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端連接，但是應(yīng)當理解，當本發(fā)明的較佳實施例中采用金時，根據(jù)金球的不同，成千個間隔物可以結(jié)合一個金球。這樣，通過改變金球的直徑，另外還改變可斷裂間隔物與金球的相對密度，就可調(diào)節(jié)給定轉(zhuǎn)動速度下的測定洗滌嚴格性。
因此，如果某個金球下基本上所有的間隔物均與互補分子連接的話，那么結(jié)合是非常強的。如果某一金球下只有部分間隔物被固定，則根據(jù)球徑和轉(zhuǎn)動頻率的不同，金球可能被保留或除去。
在極端的情況下，所有的球體均被固定或是除去。這也是DNA分析所希望的。在免疫測定中，中間情況是較佳的。因此，應(yīng)優(yōu)化系統(tǒng)，使正?？刂扑脚c50％金球固定水平對應(yīng)。在如圖3所示用兩個抗體來結(jié)合時，較高或較低的固定水平分別對應(yīng)于較高或較低的分析物濃度。
可用大的離心力來除去結(jié)合弱的金球。推動一個金球的離心力大約為0.1nN，但是該數(shù)值可以根據(jù)金球重量和盤轉(zhuǎn)動頻率在很大范圍內(nèi)變動。離心力應(yīng)足以破壞抗體的非專一性結(jié)合并使不匹配的寡核苷酸機械變性。這是提高分析物與本發(fā)明可斷裂信號元件間相互作用的專一性的重要因素。
當本發(fā)明的實例中可斷裂間隔物的反射物是鐵磁性的物質(zhì)(例如是涂布金的鐵珠或鐵合金)時，那些通過斷裂而分離的不再被分析物固定在測定裝置基材上的反射物可以通過施加磁場來除去。在這種實例中，那些仍連接在測定裝置(盤)基材上的信號元件也會響應(yīng)金屬場，但是它們的行動會受第一側(cè)鏈成員-分析物-第二側(cè)鏈成員的環(huán)的長度和柔度制約。在本實例中，即使移動必將受第一側(cè)鏈成員-分析物-第二側(cè)鏈成員的環(huán)的長度和柔度的制約，通過施加外部磁場來移動所有連接信號元件的位置也可增加其它信息。尤其是，簡單地施加一個磁場可以辨別分析物誘導(dǎo)的信號和隨機噪擾(該噪擾并不響應(yīng)外部磁場的施加)。
在除去不受分析物專一性結(jié)合保護的斷裂的反射信號物后，可以直接對盤進行讀取?；蛘?，在讀取前先對盤消毒。在還有一個實例中，盤上可以覆蓋一層透明的塑料涂層，以防止金球由于旋涂可聚合的漆(用紫外光聚合)而被進一步除去。光盤的旋涂是該領(lǐng)域中熟知的。預(yù)計測定盤的使用期超過10年。
然后，用激光讀頭掃描盤，該讀頭會通過反射來檢測不同空間預(yù)定位置中微球或其它反射元件是否存在。根據(jù)微球距離盤旋轉(zhuǎn)軸的距離以及距離地址線(地址線在盤上形成徑線)的角距離，就可以具體地確定特定金屬球的位置。根據(jù)該具體位置以及專一性結(jié)合對的預(yù)定位置與主分布圖的比較，就可確定結(jié)合材料的相同性。因此，通過前述方式，就可以在一份液體樣品中同時分析上千甚至更多的分析物。
5.2基材的衍生圖4A至4G描述了固體載體基材的制備過程，基材上排列有可斷裂反射信號元件從而制成本發(fā)明的測定裝置。圖4A示出了一部分大致平的固體載體。如圖4B所示，載體的表面上涂布一層抗蝕膜22(如高熔點蠟等)。然后，用有突起24的印模23在抗蝕膜中壓印制成凹痕或通孔25的圖案，如圖4C所示。圖案非常有規(guī)則，并在載體表面上希望放置可斷裂間隔物分子的所有部位形成凹痕。如圖4E所示，除去圖4D中所示的凹痕底部所有的抗蝕膜。對基材外露的區(qū)域21(如圖4E所示)進行活化或衍生，以使結(jié)合基團(如氨基)與基材表面和任何剩余的抗蝕膜22連接(如圖4F所示)。最后，除去剩下的抗蝕膜，使基材原來的表面外露，該基材表面的某些預(yù)定位點處連接有氨基(如圖4G所示)。
空白盤購自Disc Manufacturing,Inc.(Wilmington,delaware)。氨基衍生可以用氨等離子體通過射頻等離子體發(fā)生器(ENI,Rochester,NY)來進行。
5.3可斷裂間隔物的合成和連接圖1以及圖5和6描述了一種典型的可斷裂間隔物分子。大多數(shù)間隔物(稱為骨架)是聚(亞烷基二醇)(例如聚乙二醇)，其分子量為400-10000，較佳的為400-2000。骨架的第一末端31與基材20的表面21上衍生的胺基團連接，第二末端32通過硫鍵51與金屬微球40的表面41相連接。骨架包括一個斷裂位點33，該位點在間隔物分子30的第一末端31和第二末端32之間。另外，在末端31和斷裂位點33之間是側(cè)鏈成員34a，該側(cè)鏈成員通常由寡核苷酸構(gòu)成；在斷裂位點33和末端32間是另一個側(cè)鏈成員34b，它通常由寡核苷酸構(gòu)成?；蛘哌@些側(cè)鏈成員可以是肽或其它有機分子?？梢杂袃蓚€以上的側(cè)鏈成員，但是只需要兩個成員就能在斷裂位點周圍形成一個連接的分子環(huán)，從而使得在斷裂位點斷裂后間隔物分子仍與基材表面相連。這些側(cè)鏈成員可以通過接頭(如聚乙二醇)與間隔物骨架相連。
圖5所示的可斷裂間隔物分子30的一種合成方式基本上大致如下將二甲基氯硅烷連接在一個聚乙二醇分子的兩端。摻入分子的硅烷基團在催化量的氯鉑酸存在下在N-丙烯酰絲氨酸中反應(yīng)。兩個絲氨酸部分的羥基在以后的合成中用來構(gòu)建寡核苷酸側(cè)鏈成員。先用單甲氧基三苯基甲基來保護一個羥基，產(chǎn)物用液相層析純化。然后用新戊?；蜍袒籽豸驶?FMOC)來保護另一個羥基。絲氨酸的羧基與聚乙二醇的氨基末端相連。另一端的氨基用3-(2-吡啶聯(lián)硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯作進一步衍生。另一氨基不進行反應(yīng)，以便在以后自由地與衍生的基材反應(yīng)。
下面更詳細地描述了另一種但基本相似的間隔物分子的合成及其制備方法。間隔物分子的結(jié)構(gòu)如圖5所示。合成開始先構(gòu)建間隔物分子的中間部分。然后，用例如二甲基氯硅烷來硅烷化聚乙二醇的兩端，以提供化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)式的化合物。
然后用直鏈或支鏈、有末端雙鍵的諸如乙烯乙酸的鏈烯酸(如CH=CH(CH2)nCOOH,n=1-11，但是碳原子數(shù)并不重要，例如乙烯乙酸、丙烯酸等)對硅烷基團進行衍生，以形成有化合物Ⅱ結(jié)構(gòu)式的化合物，然后進一步反應(yīng)，在硅烷兩端保護羥基，以便使化合物Ⅲ結(jié)構(gòu)式的化合物以后連接寡核苷酸。
可采用各種常見的反應(yīng)劑來實現(xiàn)這個目的，當在催化劑(如氯鉑酸)存在下進行反應(yīng)時，N-丙烯?；z氨酸和TMT-絲氨酸甲酯是典型的較佳反應(yīng)劑。加入醇溶劑中的堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉)，使獲得的酯部分水解，而鄰近的受保護的羥基最好水解產(chǎn)生化合物Ⅳ結(jié)構(gòu)式表示的化合物。
末端為氨基的聚乙二醇的一端用硫酯(如3-(2-吡啶聯(lián)硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)衍生，并與化合物Ⅳ連接，產(chǎn)生化合物Ⅵ結(jié)構(gòu)式表示的化合物。使末端酯基團水解，產(chǎn)生酸，然后再與甲氧基乙酸反應(yīng)，從而獲得化合物Ⅷ結(jié)構(gòu)式表示的化合物。用胺化的聚乙二醇處理該化合物，生成基本上如圖5所示的完整的間隔物分子。
制備1化合物Ⅰ在100ml二氯甲烷(DCM)中的聚乙二醇(10g,10mmol，平均分子量1000Aldrich Chemical Company)和三乙胺(TEA)(2.1g,21mmol)的混合物中，滴加入冰浴冷卻的20ml的DCM中2.0g二甲基氯硅烷。10分鐘后，過濾反應(yīng)混合物，將過濾物上柱于200g二氧化硅柱。用DCM/MeOH(19∶1)洗脫，獲得聚乙二醇、二(二甲基甲硅烷基)醚和化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)式表示的化合物。
化合物Ⅰ制備2化合物Ⅱ?qū)⒒衔铫?10g,9mmol)和乙烯基乙酸(1.72g,20mmol)溶解在60ml乙酸乙酯(EtoAc)中。加入催化量(40mg)的氯鉑酸，將混合物加熱至沸騰，并沸騰1小時。冷卻后，直接將溶液加入200g二氧化硅柱中。柱用EtoAc和EtoAc/MeOH(9∶1)洗脫，獲得聚乙二醇、二(2-羧乙基二甲基甲硅烷基)醚和混合物Ⅱ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅱ制備3化合物Ⅲ將化合物Ⅱ(9.5g,8mmol)和三甲氧基三苯甲游基絲氨酸甲酯(7.0g,16mmol)溶解在100ml DCM中。在室溫下滴加30ml DCM中的二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)(3.25g,16mmol)。1小時后，過濾反應(yīng)混合物。將過濾物直接加入300g二氧化硅柱中。柱用DCM/TEA(99∶1)洗脫，再用DCM/MeOH/TEA(94∶5∶1)洗脫。獲得化合物Ⅲ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅲ制備4化合物Ⅵ將化合物Ⅲ(10g,5mmol)溶解在100ml EtOH中，加入10ml 0.5M EtOH中的NaOH使其部分水解。加入300mg(5mm0l)乙酸使混合物稍稍酸化。鄰近羧酸基團的TMT-基團最好被水解。30分鐘后，加入0.5ml四乙胺(TEA)使混合物稍稍呈堿性。用反相柱HPLC來對EtOH溶液分級，柱用EtOH/水/TEA(90∶9∶1)來洗脫。獲得化合物Ⅳ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅳ制備5化合物Ⅴ將O,O＇-二(氨基丙基)聚乙二醇(9.5g,5mmol，平均分子量1900)、三乙胺(0.5g,5mmol)和3-(2-吡啶聯(lián)硫基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(0.77g,2.5mmol)溶解在150ml DCM中。混合物在室溫下攪拌1小時，使體積濃縮一半，然后在200g二氧化硅柱中分級。柱用DCM/MeOH(95∶5)洗脫，獲得化合物Ⅴ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅴ制備6化合物Ⅵ化合物Ⅳ(3.5g,2mmol)和化合物Ⅴ(4.4g,2mmol)溶解在100ml DCM中，加入在5ml DCM中的450mg(2.2mmol)DCC。1小時后，過濾混合物，并在150g二氧化硅柱中分級。柱用DCM/MeOH/TEA(94/5/1)洗脫，獲得化合物Ⅵ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅵ制備7化合物Ⅶ將化合物Ⅵ(6.0g,1.5mmol)溶解在50ml EtOH中，加入3ml 0.5M的NaOH乙醇溶液。30分鐘后，用反相HPLC純化產(chǎn)物，用EtOH/水/TEA EtOH/水/TEA(90∶9∶1)作為洗脫劑，獲得化學(xué)式Ⅶ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅶ制備8化合物Ⅷ將化合物Ⅶ(4.0g,1mmol)溶解在80ml DCM。加入5ml DCM中的320mg(2mmol)甲氧基乙酸酸酐和202mg(2mmol)三乙胺。用旋轉(zhuǎn)式汽化器將化合物蒸干。殘余物用反相HPLC純化，用EtOH/水/TEA EtOH/水/TEA(90∶9∶1)洗脫，獲得化合物Ⅷ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅷ制備9化合物Ⅸ將化合物Ⅷ(4.0g,1mmol)和O,O＇-二(氨基丙基)聚乙二醇(4.8g,2.5mmol，平均分子量為1900)溶解在100ml DCM中，加入5ml DCM中的230mg(1,1mmol)DCC。1小時后，過濾混合物，使混合物在100g二氧化硅柱中分級，用DCM/MeOH/TEA(94/5/1)洗脫，獲得基本上如圖5所示的化合物Ⅸ結(jié)構(gòu)式代表的化合物。
化合物Ⅸ5.4可斷裂間隔物與基材的連接每個間隔物分子的一個末端31(例如通過酰胺鍵)與基材表面21相連。為了使間隔物分子與氨基活化的基材相連，使戊二酐與氨基反應(yīng)，暴露出羧化物基團(圖7A和7B中更具體地示出)。羧化物基團可用五氟苯酚酯化。間隔物分子上游離的氨基會與該活性酯連接。圖7C中特別顯示出了間隔物分子及其與固體載體表面21具體部位的連接。在制備的這一階段中，羥基仍被保護。盡管寡核苷酸側(cè)鏈成員可以在連接到固體表面載體21上之前預(yù)先合成到間隔物上，但是較佳的是在將間隔物分子30連接到固體載體上后再連接寡核苷酸側(cè)鏈成員。
5.5信號響應(yīng)物的設(shè)計和連接本發(fā)明的一個特點是信號響應(yīng)物的檢測與以預(yù)定的空間可尋址樣式排列在測定裝置表面上的可斷裂間隔物分子相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明提供了用于連接信號響應(yīng)物和檢測與可斷裂間隔物分子相關(guān)的信號的方法、組合物和裝置。
5.5.1作為信號響應(yīng)物的金顆粒在本發(fā)明的一些較佳的實例中，采用能反射或散射光的顆粒作為信號響立物。反射和/或散射光的顆粒是能彈性地(即基本上不吸收光能)反射或散射入射光的分子或材料。這些光反射和/或散射顆粒包括，例如，金屬顆粒、膠態(tài)金屬(如膠態(tài)金)、膠態(tài)非金屬標記(如膠態(tài)硒)、乳液制成的染色塑料顆粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯或類似材料。
這些顆粒的大小在1nm-10μm范圍內(nèi)，較佳的在500nm-5μm間，最佳的在1-3μm間。顆粒越大，光散射作用就越大。然而，由于結(jié)合的以及松散的溶液顆粒均是如此，因此隨著用來散射信號的顆粒大小的增加，背景也會增加。
直徑為1nm-10μm(微米)(較佳的為0.5-5μm，最佳的為1-3μm)的金屬微球在本發(fā)明的光反射/光散射實例中是較佳的。金屬球為檢測斷裂的但仍受分析物束縛的、結(jié)合在盤上的間隔物分子提供了一種方便的信號響應(yīng)物。典型的材料是金、銀、鎳、鉻、鉑、銅等，或其合金，其中金是較佳的。金屬球可以是固體金屬，或是由塑料或玻璃珠等制成，然后在上面涂布一層金屬。類似地，不同組成的金屬微球上可以有光反射金屬表面。金屬球也可以是合金或聚集物。
從Aldrich Chemical Company,British BioCell International,Nanoprobes,Inc.及其它處可以購得適用于本發(fā)明的可斷裂反射信號元件和測定裝置的不同直徑(直徑在1nm至0.5-5微米)的金球。生產(chǎn)本發(fā)明所需的更大或更小的金球是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。
當用近場光學(xué)顯微鏡、紫外光、電子束或掃描探測顯微鏡進行讀取時，采用小得多的球體是非常有利的。較小的球體是以下這些實例中較佳的，因為在基材給定區(qū)域內(nèi)可以辨別更多的可斷裂間隔物。
盡管圓形顆粒是較佳的，但是在一些實例中也可采用非圓形的顆粒。
在生物應(yīng)用中，信號響應(yīng)物(尤其是金或膠乳微球)最好涂布有去污劑或進行衍生，以使其有表面電荷。這是為了防止這些顆粒與表面或相互之間非專一性地連接。
較佳的金球直接與可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端的硫代基團結(jié)合，形成非常強的鍵。
在寡核苷酸側(cè)臂的合成完成后，如下文所述的，用二硫赤蘚糖醇等來還原間隔物分子30的信號響應(yīng)末端上的吡啶聯(lián)硫基。反應(yīng)非常迅速，而且是定量的，獲得的還原的硫代基團對金的親和性非常高。類似地，鹵代基團對金也有很高的親和性。因此，通過將懸浮液加到固體載體21的表面上，使金球作為液體(如蒸餾水)中的懸浮液形式分散。金球只與末端為巰基的間隔物占據(jù)的部位連接，而不與基材的其余表面連接。
另外，盡管本發(fā)明上述實例已經(jīng)描述了單個金屬球可與單個可斷裂間隔物的信號響應(yīng)末端連接，但是應(yīng)當理解，當在本發(fā)明較佳實例中采用金時，根據(jù)金球直徑的不同，數(shù)千個間隔物可以與一個金球相連。估計1-3μm的球可以結(jié)合約1000-10000可斷裂間隔物。
這樣，通過改變金球直徑以及可斷裂間隔物與金球的相對密度，就可調(diào)節(jié)任何給定轉(zhuǎn)動速度下的測定洗滌嚴格性。
因此，如果某個金球下基本上所有的間隔物均與互補分子連接，則結(jié)合是非常強的。如果某一金球下只有部分間隔物被固定，則根據(jù)球徑和轉(zhuǎn)動頻率的不同，金球可能被保留或除去。
5.5.2其它響應(yīng)光的信號響應(yīng)物在本發(fā)明的可斷裂信號元件和測定裝置的其它一些實例中，可以采用光吸收而不是光反射材料作為信號響應(yīng)物。在該實例中，尋址位置沒有反射光(而不是有反射光)表明捕獲了分析物。盡管形式有些不同，但是該方法與可擦寫光盤采用的方法類似。
盡管內(nèi)容相似且與CD讀頭兼容，但是與標準的壓制的CD中通過凹痕來編碼信息相比，可擦寫光盤(CD-R)是以不同的方式來記錄信息的。在CD-R中，數(shù)據(jù)層與聚碳酸酯基材分開。聚碳酸酯基材壓制有連續(xù)的螺旋槽作為入射激光的參照定位指南。用一種有機染料來制成數(shù)據(jù)層。盡管花青是用于這些盤的首選材料，但是通常用金屬穩(wěn)定化的花青化合物來代替“原始的”花青。另一種材料是酞菁。在美國專利No.5,580,696中描述了這樣一種金屬酞菁。
在CD-R中，有機染料層被夾在聚碳酸酯基材和金屬化反射層之間，該金屬化反射層的介質(zhì)通常是24克拉的金，但也可以是銀。信息是這樣被記錄的用具有合適的預(yù)選波長的記錄激光在染料層中選擇性地熔融形成“凹痕”(并不是在染料中燒出通孔，而只是稍稍熔融)，使其變得不透明，這樣讀取激光束被折射而不是象標準壓制的CD中的物理凹痕那樣被反射回讀頭傳感器。和標準CD中一樣，用漆涂層來保護攜帶信息的層。
本發(fā)明的這個實例中采用的光吸收染料多于CD-R中采用的染料。光吸收染料是能從電磁波譜(理想的是在對應(yīng)于光源波長的波長下)吸收能量的任何化合物。如該領(lǐng)域中所知的那樣，染料通常包括共軛的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，下面是典型的染料種類偶氮類染料、重氮類染料、三嗪類染料、食用色素或生物染色劑。具體的染料包括考馬斯亮藍R-250染料(Biorad Labs,Richmond,Calif.)、Reactive Red2(Sigma chemical Company,St.Louis,Mo.)、溴酚藍(Sigma)、二甲苯苯胺(Sigma)和酚酞(Sigma)。Floyd J.Green的Sigma-Aldrich Handbook of Stains,Dyes andIndicators(Aldrich Chemical Company,Inc.,Milwaukee,Wis)提供了其它染料的許多數(shù)據(jù)。通過這些數(shù)據(jù)，可以選擇有合適光吸收性能的染料來符合光源發(fā)出的波長。
在這些實例中，可將不透明的含有染料的顆粒(而不是反射顆粒)作為響應(yīng)光的信號物，從而逆轉(zhuǎn)編碼信息相。膠乳球的直徑在1-100μm之間，較佳的為10-90μm，最佳的為10-50μm。染料可防止激光從盤基材的金屬層反射。
在其它實例中，信號響應(yīng)元件可以是熒光劑(如熒光素)、propidium iodide或藻紅蛋白、化學(xué)熒光劑(如響應(yīng)入射光的熒光素)、或?qū)⒖扇艿臒晒獾孜飻嗔殉刹蝗苄问降闹甘久浮＿m用于該實例的其它熒光染料包括得克薩斯紅、若丹明、綠色熒光蛋白等。當藍色激光被廣泛使用時，熒光染料將是特別有用的。
本發(fā)明的光反射、光散射和光吸收實例最好采用圓形測定裝置作為基材，按照一定樣式排列可斷裂信號元件。在一個特別佳的實例中，測定裝置與已有的光盤讀頭(如光盤(CD)讀頭或數(shù)字視頻盤(DVD)讀頭)兼容，因此它最好是直徑約為120mm、厚約1.2mm的盤。盤也指圓環(huán)。
然而，應(yīng)當理解，本發(fā)明的可斷裂反射信號元件也可以空間可尋址方式排列在非圓形的、基本平的基材上，并且這種測定裝置必須用適合基材形狀的檢測器來讀取。
光盤上可空間辨別的可斷裂信號元件(或生物碼元)的最大數(shù)目與波長和物鏡的數(shù)值孔徑有函數(shù)關(guān)系。在所有種類的存儲器光盤(如CD-ROM、WROM(一次性寫入，多次讀取)盤和磁光盤)中，提高存儲器容量的一種方法是減少二極管(該二極管能照亮存儲器光盤的數(shù)據(jù)軌道)激光發(fā)射的光波長。波長越小，就越能辨別盤上更小的數(shù)據(jù)點(即分辨率較高)，從而提高了數(shù)據(jù)密度。目前的CD-ROM采用的是波長為780納米(nm)的激光。目前的DVD讀頭采用的是波長在635至650nm之間的激光。新的二極管激光(發(fā)射例如481nm附近的藍光)會增加能在本發(fā)明的信號測定裝置盤上空間尋址的信號元件數(shù)目。另一種獲得藍輻射的方法是用非線性光學(xué)材料使紅外激光的頻率加倍。
目前的CD-ROM讀頭采用反射讀取和透射讀取兩種方式。兩種獲取數(shù)據(jù)的方法均與本發(fā)明兼容。金顆粒尤其適于用作反射型CD-ROM讀頭的信號響應(yīng)物。光吸收染料特別適用于透射型讀頭(如美國專利No.4,037,257中所討論的那種)。
5.5.3其它的信號響應(yīng)物該領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，適用于本發(fā)明可斷裂間隔物的信號響應(yīng)物不局限于光反射或光吸收的金屬顆?；蛉玖?。合適的信號響應(yīng)物包括(但不局限于)可用光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電子、光學(xué)或化學(xué)方式檢測的任何組合物。在一些較佳的實例中，合適的信號響應(yīng)物包括比色標記如膠態(tài)金或著色的玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳液等)珠、用標記的鏈酶親和素共軛物著色的生物素、磁珠(如DynabeadsTM)、放射性標記(如3H、125I、35S、14C或32P)、以及酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它ELISA中常用的酶)。
該領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，各種信號間隔物適于改裝成本發(fā)明的可斷裂間隔物。例如，有許多專利提供了在生物測定中產(chǎn)生可檢測信號的各種廣泛的理論。這種信號響應(yīng)物通常適用于本發(fā)明的一些實例中。作為非限制性的描述，下面一份美國專利一覽表指出了適用于本發(fā)明一些實例中的幾種信號響應(yīng)物美國專利No.3,646,346，放射活性信號產(chǎn)生方式；3,654,090,3,791,932和3,817,838，酶聯(lián)信號產(chǎn)生裝置；3,996,345，熒光劑-淬滅劑信號產(chǎn)生方式；4,062,733，熒光劑或酶信號產(chǎn)生方式；4,104,029，化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生方式；4,160,645，非酶類催化劑產(chǎn)生方式；4,233,402，酶結(jié)合對信號產(chǎn)生方式；4,287,300，酶陰離子電荷標記。上述所有這些美國專利均全部納入本文作參考。
該領(lǐng)域已知的其它信號產(chǎn)生方式(例如美國專利No.5,021,236和4,472,509)也均由于所有這些目的而納入本文作參考?？捎媒饘衮吓浜衔飦硎剐盘柈a(chǎn)生方式與可斷裂間隔物分子連接，或與作為側(cè)鏈成員連接在間隔物分子上的抗體連接。用有機螫合劑(如連接抗體的DTPA)的方法在美國專利No.4,472,509中有所描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
在其它一些實例中，可用磁球來代替反射球，磁球可通過用足夠強度的磁場處理盤來取向。由于空的部位不存在任何磁性材料，因此可以檢測其它其余的間隔物分子位置，并處理信息以確定試樣中的物質(zhì)。另外，在樣品雜交后可加入反射或磁性物質(zhì)，以提供信號產(chǎn)生裝置。
可采用順磁離子作為信號產(chǎn)生裝置，這些離子例如是鉻(Ⅲ)、錳(Ⅱ)、鐵(Ⅲ)、鐵(Ⅱ)、鈷(Ⅱ)、鎳(Ⅱ)、銅(Ⅱ)、釹(Ⅲ)、釤(Ⅲ)、鐿(Ⅲ)、釓(Ⅲ)、釩(Ⅱ)、鋱(Ⅲ)、鏑(Ⅲ)、鈥(Ⅲ)和鉺(Ⅲ)，其中釓是特別佳的。適用于其它方面(如X-射線制圖)的離子包括(但不局限于)鑭(Ⅲ)、金(Ⅲ)、鉛(Ⅱ)，尤其是鉍(Ⅲ)。
檢測這些標記的方式是該領(lǐng)域中熟知的。因此，例如可以用照相膠片或閃爍計數(shù)檢測放射性標記，用檢測發(fā)射光的光檢測器檢測熒光標記。酶標記的檢測通常是通過為酶提供一個底物，然后通過檢測酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)物來實現(xiàn)的，比色標記通過簡單地觀察有顏色的標記來檢測。膠態(tài)金標記可通過測定散射光來檢測。
較佳的非反射信號產(chǎn)生方式是生物素，它可用親和素或鏈酶親和素來檢測。這種標記的應(yīng)用是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其在例如美國專利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241中有所描述；這些專利均納入本文作參考。
5.6可斷裂間隔物側(cè)鏈成員的連接可斷裂間隔物的側(cè)鏈成員賦予分析物專一性。在一個較佳的實例中，側(cè)鏈成員是寡核苷酸。
寡核苷酸可以在間隔物連接到測定裝置(盤)衍生基材上之前分步合成到可斷裂間隔物上。或者，在間隔物分子與測定裝置基材連接之前，完整制備的寡核苷酸可以在一個步驟中直接連接到間隔物分子上。在這種情況下，間隔物分子有受保護的氨基和/或巰基，而不是兩個受保護的羥基。除去一個保護基團，加入例如一端有異氰酸酯基團的寡核苷酸。第二個寡核苷酸以類似方式與可斷裂間隔物分子的第二個側(cè)鏈成員相連。
或者，側(cè)鏈成員寡核苷酸可在可斷裂間隔物連接到基材上后再合成，合成可以是用完整制備的寡核苷酸單步加入或分步加入。當在一個測定裝置基材上進行不同分析物專一性的多個測定時，預(yù)計后一種方案是較佳的。側(cè)鏈成員連接到先前固定在基材的可斷裂間隔物上的通用方法(無論是一步還是分步加入)在這里被稱為印制。
亞磷酰胺類化學(xué)物質(zhì)適于用來制備寡核苷酸側(cè)鏈成員，但是也可采用其它化學(xué)物質(zhì)。在常規(guī)的固相合成中，寡核苷酸是用單體亞磷酰胺類制得的。在常規(guī)的合成后，將寡核苷酸連接到樹脂載體上，用液相層析純化，除去反應(yīng)物(包括溶劑和未反應(yīng)的單核苷酸)，并除去不完全合成產(chǎn)生的較短的寡核苷酸。在一些情況下，寡核苷酸不能這樣來純化，因此較短的寡核苷酸會污染所需的寡核苷酸。這會導(dǎo)致不希望的雜交。比所需產(chǎn)物只少一個核苷酸的寡核苷酸污染物最難對付，因為它們的結(jié)合強度幾乎與正確序列的寡核苷酸相同。
在制備用作本發(fā)明可斷裂反射信號元件中側(cè)鏈成員的寡核苷酸時，用亞磷酰胺的三聚物或四聚物是有利的，較佳的。例如采用四聚物起始材料可以在三步內(nèi)合成制得12聚物。在這種情況下，不可避免的不完全合成產(chǎn)物是8聚物和4聚物，它們分別代表少1或2個合成步驟。由于8聚物的結(jié)合比12聚物弱得多，因此這些污染物不會產(chǎn)生明顯的干擾。
在通過分步加入將可斷裂間隔物的側(cè)鏈成員施加到固定在測定裝置基材表面上的間隔物上時，寡核苷酸宜通過化學(xué)印制(chemical printing)來連接到可斷裂間隔物上，化學(xué)印制是在印模上形成與固體基材上間隔物分子分布互補的所需寡核苷酸化學(xué)溶液。印制非常迅速，而且成本很低。它還能提供很高的分辨率。例如Science269卷664-665頁(1995)中描述了一種簡單的印制方法。
在這種印制方法中，測定裝置基材上間隔物分子的一個保護基團被除去。將所需的寡核苷酸施加到印模表面，使得印模上具體的預(yù)定位置上有專一性的寡核苷酸，然后將印模表面施加到間隔物覆蓋的基材載體表面上，從而使所需寡核苷酸排列在有間隔物分子存在的具體區(qū)域內(nèi)。隨后，除去第二個保護基團，再次用化學(xué)印模將不同寡核苷酸施加到活化的區(qū)域上。這些步驟在圖8A、8B、9A、9B、13和14中有具體的描述。
或者，可用噴墨印制來施加各寡核苷酸，如美國專利No.4,877,745和5,429,807中所述的方法，其公開納入本文作參考。
這些直接印制的方法均很迅速。當用三聚物或四聚物來構(gòu)建寡核苷酸時，進行兩次印制循環(huán)就能產(chǎn)生所有可能的6聚物至8聚物寡核苷酸的陣列。為了包含所有的8聚物，測定裝置必須含有256×256個不同的寡核苷酸。附加的印制循環(huán)可迅速地增加寡核苷酸的長度，雖然所有組合可能不會置于大小合適的表面上，因此可能需要用幾個測定裝置來表示所有這些組合。
圖15顯示了用于本發(fā)明的另一種印制方法，凹板互補印制。盡管只顯示出了兩個步驟，但是該方法能同時印制大量的寡核苷酸。合成寡核苷酸的混合物；例如，可在每一步中采用四個亞磷酰胺的混合物來合成12聚物，在合成的最后一步中將非常長的間隔物連接到每個寡核苷酸上。在另一端提供一個活性基團(如異硫氰酸酯)。使寡核苷酸混合物和結(jié)合確定部位的互補寡核苷酸的印模一起培育。在印制過程中，間隔物會與基材相連。例如，雙螺旋可通過加熱來變性，使印模和基材分離。
已經(jīng)開發(fā)出了許多合成寡核苷酸的方法，尤其是在固體表面上合成空間可尋址的寡核苷酸的方法，這些方法是該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。特別適用于本發(fā)明的方法在美國專利No.4,542,102；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,445,934；5,489,678；5,510,270；5,424,186；6,624,711中有更進一步的描述；這些內(nèi)容均納入本文作參考。
適用于本發(fā)明的其它方法大致包括(1)分步光化學(xué)合成、(2)分步噴射化學(xué)合成和(3)制備的寡核苷酸的固定。也可采用玻璃毛細管陣列系統(tǒng)。在后一種情況下，合成可以象在自動化DNA合成儀中那樣在所有毛細管平行地進行合成。
盡管這里已經(jīng)描述了寡核苷酸側(cè)鏈成員是用標準的脫氧核糖核苷酸亞磷酰胺合成的DNA寡核苷酸，但是應(yīng)知道某些寡核苷酸類似物，例如吡喃糖基RNA(E.Szathmary,Nature 387:662-663(1997))和肽核酸，可以形成比天然寡核苷酸忠實性更高、結(jié)合更強的雙鏈。因此，這些人造的類似物也可用來構(gòu)建寡核苷酸側(cè)鏈元件。
盡管寡核苷酸側(cè)鏈成員可以與互補的寡核苷酸結(jié)合并因此可直接用于核酸探針測定，但是本發(fā)明還有一個方面是將這些寡核苷酸側(cè)鏈成員專一性結(jié)合對成員與其它測定的用途組合起來。
在后面的這些實例中，結(jié)合對成員(如抗體)與側(cè)鏈成員寡核苷酸的非共價連接是通過側(cè)鏈成員寡核苷酸與共價連接在結(jié)合對成員上的寡核苷酸間的互補性來介導(dǎo)的。關(guān)于用互補的核酸分子來實現(xiàn)超分子結(jié)構(gòu)的非共價、組合裝配的方法在共有的待批美國專利申請No.08/332,514(1994年10月31日提交)、08/424/874(1995年4月19日提交)、08/627,695(1996年3月29日提交)中有更詳細的描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
如圖3A和3C所示，寡核苷酸側(cè)鏈成員34a,34b,35a和35b與修飾的抗體38a,38b,38c和38d非共價連接，從而可以進行免疫測定。修飾的抗體與側(cè)鏈成員的非共價連接是通過側(cè)鏈成員和共價連接在抗體上的寡核苷酸間的互補性來實現(xiàn)的。
盡管圖3例舉了抗體的例子，但是可以知道，也能夠用抗體片段和衍生物(如Fab片段、單鏈抗體、嵌合抗體等)。通常，用于該實例中的結(jié)合對成員通常是第一和第二專一性結(jié)合對的第一成員，典型的例子是分別與抗原、配體等結(jié)合的抗體、受體等。
5.7測定裝置上可斷裂反射信號元件的圖案放置根據(jù)上面的討論可以知道，響應(yīng)分析物的可斷裂反射信號元件在測定裝置(盤基材)上的空間分步可以在兩個水平上決定可斷裂間隔物本身的連接水平，以及連接間隔物側(cè)鏈成員的水平。還應(yīng)理解，分析物靈敏度的空間分步也可通過這兩者的組合來確定。
控制可斷裂間隔物分布的方法的第一步是設(shè)計基材的親水和疏水區(qū)域。首先使疏水表面活化、親水表面失活，以產(chǎn)生一個與疏水的、不反應(yīng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分開的親水的功能點陣列。如果基材是玻璃、云母、硅、親水塑料或類似材料，則首先通過酸或堿處理使整個表面具有反應(yīng)性。使點之間的中間空間硅烷化。這最好是用網(wǎng)格作為印模。另一方面，如果基材是是疏水材料，它可以通過在氨存在下進行等離子體處理，然后作為親水基材進行硅烷化來加以活化。使抗蝕膜材料與石印或機械印刷結(jié)合，除去所需部分的抗蝕膜，就可在那些部位進行活化。
反應(yīng)點上宜連接有親水性間隔物如聚乙二醇(PEG)。如果基材含有氨基或巰基，則PEG的另一端可預(yù)先用各種已知能與氨基或巰基連接的官能團活化。這些官能團包括異氰酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙?；顽牾啺孵セ鶊F。
光致抗蝕膜也適用于制作可斷裂信號元件的排列圖案。在制作時，入射激光使光致抗蝕膜部分解聚，使得這些區(qū)域的光致抗蝕膜溶解。對外露的塑料或金屬化塑料進行化學(xué)處理(如用氨等離子體進行胺化)。在除去抗蝕膜后，就可以按照需要將間隔物、側(cè)鏈成員和信號物連接到處理過的區(qū)域上。用光致抗蝕膜來設(shè)計母盤圖案的方法是光盤制作領(lǐng)域中熟知的。
或者，在氨等離子體處理時，可用含有小孔和其它必需特征的固體掩模來代替抗蝕膜?？椎闹睆郊s為1-3微米。孔在掩模中呈圓形，它形成了螺旋的軌跡或是螺旋和圓形軌跡的組合圖案。掩?？梢允墙饘倩蛩芰??？刹捎脦追N金屬，如鋁、鎳或金。聚碳酸酯是較佳的塑料，因為它能很好地保持外形。然而，塑料可與氨等離子體反應(yīng)，因此采用塑料掩模的較佳方法是，通過蒸發(fā)、濺鍍或本領(lǐng)域已知的其它方法在塑料上沉積一層金屬。掩模中的孔可用激光制成。該領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，在1秒鐘內(nèi)可在薄的金屬或塑料板中產(chǎn)生1000個大小為1μm的孔?；蛘?，可用半導(dǎo)體工業(yè)中熟知的常規(guī)方法來蝕刻出孔。在設(shè)計信號元件的排列圖案的掩模方法中，是將掩模壓在基材上，然后施加氨等離子體。掩?？梢灾貜?fù)使用。
應(yīng)當理解，分析物靈敏度的空間分布也可通過按一定樣式施加間隔物側(cè)臂來實現(xiàn)。
參照上述的印制方法，圖13中顯示了一種可能的寡核苷酸印模的示意圖。印模有通孔，通孔內(nèi)裝有用來為待合成寡核苷酸提供所需構(gòu)建塊的某一化學(xué)物質(zhì)。在圖13中，每列中裝有相同的化學(xué)物質(zhì)，因此在圖13給出的實施例中，一次印模循環(huán)可以用四種不同的化學(xué)物質(zhì)。在商用系統(tǒng)中，列數(shù)相當高，通常為64-256，但是在特殊的情況下也可以用較低和較高的列數(shù)。如果要將一定大小的所有可能的寡核苷酸制備到測定裝置基材上，則線性印模是較佳的。
通過這種方式，就可以制得給定的一組寡核苷酸構(gòu)建塊六聚物的所有可能組合。例如，通過兩個采用64-列線性印模的反應(yīng)循環(huán)，可以制得三聚物。在一排通孔中加入64種不同的三聚物亞磷酰胺的每一種。在印制亞磷酰胺后，印制氧化劑、解封閉劑和加蓋劑(cap reagent)。由于每個點中的這些化學(xué)物質(zhì)是相同的，因此印模可以是平板，或整個基材可以簡單地浸入試劑溶液中。旋轉(zhuǎn)基材90°，重復(fù)同一步驟。這樣就可以制得三聚物所有可能的組合。類似地，可以制得任何系列的寡核苷酸亞酰胺的所有組合。
圖14所示例子顯示了四種不同的寡核苷酸亞酰胺的所有可能組合的制備。在第一次印制循環(huán)后，水平行中的每個點含有相同的寡核苷酸，但是每一行的寡核苷酸不同。這些寡核苷酸片段在圖14中用數(shù)字1、2、3和4表示。當將印模旋轉(zhuǎn)90°，重復(fù)印制循環(huán)后，就形成了四種寡核苷酸的所有組合。
前述的正交印制方法在盤實例中生產(chǎn)本發(fā)明的信號元件中是特別有利的。正交印制使得間隔物分子的列以同心圓方式分布，其與音頻或CD-ROM光盤中環(huán)狀放置的信息類似。正交印制方法的一種較佳方案是將兩種空間螺旋方向相反的螺旋印模重疊起來。
印模的位置必須精確在約1μm內(nèi)。這可以通過在機械上用2-4個導(dǎo)向針孔對或光電導(dǎo)向微型翻譯器(microtranslator)來實現(xiàn)。在基材和印模的兩個垂直側(cè)上可以沉積一層可移動的反射涂層，它們的相對位置可用干涉儀來測定?；暮陀∧Ｒ部梢杂幸粚ξ⒗忡R，這對微棱鏡必須完全對準，以便使光通過光檢測器。
圖11A至11G描述了可斷裂反射信號元件在圓形平盤基材上按照空間可尋址樣式排列的各種樣式。圖11A特別確定了盤基材上可編碼的地址線，從該地址線可以測定可斷裂間隔物的位置。在圖11A中，可斷裂間隔物分子以環(huán)形軌跡樣式放置。圖11B示出了可斷裂信號元件的螺旋放置樣式，并且特別確定了特別用來嚙合旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置的盤圓環(huán)的中央通孔。圖11C示出了一種可斷裂信號元件的排列樣式，該樣式適于平行地測定多個樣品，并能同時在中央軌道中編碼解釋軟件。圖11D示出了一個實例，其中測定裝置基材被進一步細微制作成將各測定部分隔開，從而能使測定裝置在加樣時轉(zhuǎn)動而不必混合樣品。
圖11E示出了一個實例，其中測定裝置基材被進一步細微制作成迫使樣品在測定裝置旋轉(zhuǎn)時單向流動。細微制作固體表面的技術(shù)是該領(lǐng)域已知的，在美國專利No.5,462,839；5,112,134；5,164,319；5,278,048；5,334,837；5,345,213中特別進行了描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
圖11F示出了可斷裂信號元件空間有組織的排列樣式，這種樣式每次能測定20份樣品中的50個不同的分析物。圖11G示出了一種正交交叉樣式，這種樣式是通過螺旋圖案與方向相反或螺旋特性相反的螺旋臂疊加產(chǎn)生的。
可斷裂反射信號元件(或生物碼元)在測定裝置表面上的空間分布可以設(shè)計成能定量測定分析物的濃度。
因此，在一些實例中，通過捕獲分析物來進行定量測定。在一個實施方案中，測定裝置上裝有專門用于每種所選分析物的均勻密度的生物碼元。將試樣引入盤中央。通過施加旋轉(zhuǎn)力使試樣迅速分散到四周。在分散的過程中，分析物被可斷裂信號元件的各自同源側(cè)鏈元件捕獲，從而使樣品前緣的分析物濃度減少。
如果生物碼元的密度相對于加入物的濃度是足夠的話，則所有分析物會在樣品前緣到達測定裝置周圍前被捕獲。然后可以根據(jù)離樣品引入部位最遠的陽性生物碼元的位置來確定每種分析物的濃度。
應(yīng)該理解，如果專門用于檢測分析物的生物碼元更多，則可檢測的分析物濃度的動態(tài)范圍就更大。在前述的實例中，生物碼元的均勻密度會增加。然而還應(yīng)理解，生物碼元的密度不必是恒定的，還可采用線型或指數(shù)型變化的生物碼元密度(從盤中央到周圍測得)，以改變濃度檢測的動態(tài)范圍。
在本發(fā)明的其它實例和方面，將對所選分析物有不同親和性的生物碼元連接到測定裝置上可以有類似效果，即，提高濃度檢測的動態(tài)范圍。
還可考慮采用其它結(jié)構(gòu)來表達濃度信息。圖16示出了一種結(jié)構(gòu)，其中單個樣品被平行地引入測定裝置的四個不同的扇區(qū)。如果四個扇區(qū)中的生物碼元的密度或親和性其中一個不同，或密度和親和性均不同，則通過檢測每個正性生物碼元扇區(qū)中距加樣位置最遠的位置，可以測定很大的動態(tài)濃度范圍。
在其它實例中，可考慮采用平衡測定。因此，通過對整個盤取樣并測定每個分析物的陽性生物碼元百分比，就可確定濃度。
在每個實例中，通常有大量生物碼元專門用來檢測正負對照。
在其它實例中，對多個不同的分析物有專一性的可斷裂反射信號元件(生物碼元)可按不同的樣式來放置。例如，專一性不同的生物碼元可以混合在盤的每個區(qū)域中?；蛘撸鼈兛梢苑植嫉讲煌膮^(qū)域內(nèi)。將專一性生物碼元按照一定樣式放置到預(yù)定位置以及用檢測器(如CD-ROM)解釋生物碼元相同性的能力使設(shè)計變得靈活。該領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，設(shè)計樣式應(yīng)當用含有不同濃度的已知分析物的試樣進行測試和調(diào)節(jié)。
5.8其它的測定裝置結(jié)構(gòu)病毒通常是直徑小于0.5μm的球形顆粒。細菌通常是球狀或桿狀的；它們最大的尺寸通常小于2μm(除了鞭毛和其它類似外部纖維外)。這些病原體比本發(fā)明的可斷裂信號元件中所用的金球稍小一些或是大小相似。因此，它們同時與上述可斷裂信號元件的兩個側(cè)鏈成員同時作用會受空間上的抑制。
因此，另一種結(jié)構(gòu)和可斷裂間隔物一起分散。對分析物有專一性的一個側(cè)鏈成員以空間可尋址方式與測定裝置的基材表面直接連接。對所選分析物的第二個位點有專一性的第二側(cè)鏈成員與信號響應(yīng)物直接連接。在較佳的實例中，該響應(yīng)物是金球。在這一變化的結(jié)構(gòu)中，對分析物的識別產(chǎn)生了直接的夾心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的通式為基材-第一側(cè)鏈成員-分析物-第二側(cè)鏈成員-信號響應(yīng)物。該結(jié)構(gòu)可以被說成一種限制情況，其中可斷裂間隔物式中的“m”為0。
這一特定的結(jié)構(gòu)也可用于檢測核酸雜交(如圖17所示)。
在這一結(jié)構(gòu)中，如果信號響應(yīng)物是反射性的，則信息的編碼與前述結(jié)構(gòu)中的相似，即分析物的存在由反射信號來表示?；蛘撸斝盘栱憫?yīng)物不透明時(例如通過加入顏料)，編碼方式則相反分析物的存在通過沒有來自裝置基材的金屬化層的反射來表示。
在這一結(jié)構(gòu)中，磁性塑料球是特別有利的。因為它們內(nèi)部含有磁性顆粒，所以它們不如膠乳球那樣透明。而且，可用磁力來除去那些難以用其它方法除去的結(jié)合較弱的球，如膠乳球，因為膠乳球的密度與水接近，用離心力沒有效果。
這一結(jié)構(gòu)的其它變化利用了反射測定中的凝集(如圖18所示)。在這種變化中，信號響應(yīng)物最好是微球。這些微球相當小(30-600nm)，從而使得單獨一個微球不會有效地阻斷光。
在參照了下列非限制性的實施例后可以更好地理解本發(fā)明。
6．實施例Ⅰ提高核酸雜交測定的專一性在核酸定向雜交測定中，可斷裂信號元件的側(cè)鏈元件是寡核苷酸，該寡核苷酸被設(shè)計成與樣品中待檢測的所選預(yù)定核酸的不同部位雜交。在該方法的多種用途中，與樣品中甚至只有一個不匹配的寡核苷酸的交叉反應(yīng)性應(yīng)減少到最小。特別是，適于采用本發(fā)明的可斷裂反射信號元件來檢測點突變(如檢測易導(dǎo)致乳房癌和卵巢癌的BRCA1和BRCA2基因中的點突變)的核酸雜交測定必須能區(qū)別只有一個核苷酸不匹配的核酸樣品。
可斷裂信號元件的寡核苷酸側(cè)鏈元件越長(因此側(cè)鏈元件和核酸樣品間有互補性的序列越長)，錯誤地識別不匹配樣品的可能性就越高，因為即使存在不匹配，雜交強度仍然相當高。
因此，減少錯誤識別不匹配核酸序列的一種方法是減少側(cè)鏈元件寡核苷酸的長度。通過將側(cè)臂減到8聚物甚至6聚物可以提高專一性。這些仍能在室溫下根據(jù)不同的洗滌嚴格性雜交，洗滌嚴格性條件是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。不匹配寡核苷酸會通過5個或更少的寡核苷酸來配對，其在室溫下的結(jié)合是非常不穩(wěn)定的。
然而，這種溶液仍有其自身的問題用于識別的總長度相當短，只有12-16個核苷酸，這會相應(yīng)地減少制約可斷裂信號元件的信號響應(yīng)物所需的雜交總長度。采用連接酶(如圖2E-2F所示)可以部分解決這個問題。連接不僅能提供更強的結(jié)合，而且還能進一步作用，以保證專一性，因為如果寡核苷酸末端附近存在不匹配，DNA連接酶不會將寡核苷酸連接起來。由于寡核苷酸非常短，因此不匹配堿基對不被接受。連接酶可作為寡核苷酸匹配的非常嚴格的檢查物。
另一采用三識別原理的互補溶液(圖2D-2E所示)建設(shè)性地減少了可與可斷裂信號元件側(cè)鏈元件雜交的試樣序列。在液體樣品接觸測定裝置前，在樣品溶液中加入一種可溶的增強專一性的寡核苷酸(例如8聚物)，該寡核苷酸與樣品寡核苷酸的中間部分互補。該8聚物能在測試條件下很好地進行雜交?？蓴嗔研盘栐膫?cè)鏈元件則能識別緊靠已形成的雙鏈的6個核苷酸。
連接會保證專一性，還能提供強的鍵。如果寡核苷酸末端附近存在不匹配，則連接酶不會連接寡核苷酸。因為寡核苷酸非常短，因此不匹配堿基對不能被接受。連接酶可作為非常嚴格的寡核苷酸匹配的檢查物。
很明顯，加入試樣中的增強專一性的可溶性寡核苷酸(這里是8聚物)可以被設(shè)計成用來測定樣品末端附近潛在的不匹配，在該處的不匹配最不利于側(cè)鏈元件的結(jié)合。
另外，由于連接酶的加入保證了共價環(huán)，因此可以通過加入離液劑和/或加熱來提高洗滌嚴格性，以除去任何非選擇性的寡核苷酸。
然而，有一種樣品核酸可以冒充適于并能與側(cè)鏈元件結(jié)合的“封閉的”樣品寡核苷酸，這種樣品核酸具有必需的末端6核苷酸序列，但序列間直接連接，中間沒有插入8聚物序列。
如圖2D所示，另外加入一種10聚物樣品(該樣品的序列取自第一側(cè)鏈元件寡核苷酸序列和第二側(cè)鏈元件寡核苷酸序列)就可防止在接觸本發(fā)明的測定裝置時發(fā)生這種結(jié)合。
增強專一性的可溶的寡核苷酸的8+10+8的組合是本發(fā)明中較佳的，但是也可采用其它組合如7+9+7和8+8+8。
提高專一性的另一種方法包括采用所謂的掛鎖(padlock)探針，其中環(huán)形的寡核苷酸被連接起來，從而允許充分洗滌來除去結(jié)合較弱的探針。掛鎖探針對互補和單個不匹配寡核苷酸的辨別率為50∶1(Nilsson等，Science265:2085(1994))，而常規(guī)探針的比例通常在2∶1至10∶1之間。
通過自動合成制得有下列序列的寡核苷酸，根據(jù)與可斷裂間隔物分子的連接部位的不同(5＇端或3＇端)，使它們每一個都有一個末端巰基(脂族氨基)。Ⅰa:5＇-CGGGTGTGG Ⅰb:CGGCCGCGG-3＇Ⅱa:5＇-CGGGTGTGA Ⅱb:CGGCCGCGG-3＇Ⅲa:5＇-CGGGTGTGC Ⅲb:CGGCCGCGG-3＇Ⅳa:5＇-CGGGTGTGT Ⅳb:CGGCCGCGG-3＇合成有兩個脂族氨基(代替上述的保護的羥基)的可斷裂間隔物分子，一個氨基被單甲氧基三苯甲游基(MMT，酸不穩(wěn)定)保護，另一個被芴基氧羰基(FMOC，堿不穩(wěn)定)保護。在除去FMOC基團后，使氨基功能在水性條件下與4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMMC)反應(yīng)。將巰基衍生的Ⅰa加入間隔物分子中，使其與間隔物分子連接。然后用乙酸處理，除去MMT，在用pH8的緩沖液洗滌后加入SMCC，使Ⅱb與間隔物分子連接。將上述制得的間隔物分子與聚碳酸酯基材連接。
制得含有5＇-GCCCAC ACCGCC GGCGCC-3＇的試樣，使其在接近Ⅰa和Ⅰb側(cè)鏈成員的Tm溫度下與可斷裂信號元件接觸。將樣品溶液的溫度加熱到約比Tm高20℃。然后，用0.1M氟化鈉溶液處理信號元件并洗滌。仍連接在基材上的間隔物分子表示5＇-GCCCACACCGCCGGCGCC-3＇受束縛而存在。
用前述方法來分析5＇GCCCACACTGCCGGCGCC-3＇、5＇-GCCCACACGGCCGGCGCC-3＇、5＇-GCCCACAGCCGGCGCC-3＇(分別采用具有側(cè)鏈成員Ⅱa和Ⅱb、Ⅲa和Ⅲb、Ⅳa和Ⅳb的間隔物分子)。
7．實施例Ⅱ:HIV-1的檢測基本上按照美國專利No.5,599,662(納入本文作參考)中所述的方法擴增來自臨床樣品中的HIV-1原病毒DNA。
用標準的Ficoll-Hypaque密度梯度法分離獲得外周血單核細胞。在分離獲得細胞后，抽提出DNA(如Butcher和Spadoro,Clin.Immunol.Newsletter 12:73-76(1992)中所述，其內(nèi)容納入本文作參考)。
在100μl的反應(yīng)體積中進行聚合酶鏈反應(yīng)，其中50μl是樣品。反應(yīng)含有具有下列初始濃度的下列試劑10mM Tris-HCl(pH8.4)50mM KCldATP,dCTP,dGTP和dUTP各200μM25pmol引物1，其序列如下所示25pmol引物2，其序列如下所示3.0mM MgCl210％甘油2.0單位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)2.0單位UNG(Perkin-Elmer)引物1:5＇-TGA GAC ACC AGG AAT TAG ATA TCA GTA CAA TGT-3＇引物2:5＇-CTA AAT CAG ATC CTA CAT ATA AGT CAT CCA TGT-3＇擴增在TC9600 DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer,Norwal,Connecticut)中進行，采用下列溫度進程(1)預(yù)培育，50℃2分鐘；(2)初始循環(huán)，94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒；(3)第2-4次循環(huán)，94℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，與循環(huán)1相比，每次循環(huán)的退火溫度增加2℃(至58℃)；(4)循環(huán)5-39,90℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。
在溫度循環(huán)后，將反應(yīng)混合物在90℃加熱2分鐘，然后稀釋成1ml?；蛘?20℃保藏樣品，融凍后，在90℃加熱2分鐘，并稀釋至1ml。
具有硅氧烷部分的可斷裂間隔物基本上按照上述5.2和5.3節(jié)所述那樣合成并以均勻密度連接到衍生的120mm聚碳酸酯盤基材上。然后在可斷裂間隔物上印制下列側(cè)鏈成員第一側(cè)鏈成員5＇-TAG ATA TCA GTA CAA-3＇第二側(cè)鏈成員3＇-TAT TCA GTA GGT ACA-5＇將直徑為1-3μm的金微球懸浮液滴加到盤上，輕輕轉(zhuǎn)動盤，使金顆粒分散。加入金顆粒直至流出物的顆粒密度與初始懸浮液中的相同，從而保證可斷裂間隔物被飽和。
在室溫下將樣品滴加在以連續(xù)速度轉(zhuǎn)動的測定裝置的中央附近。在樣品前緣達到周邊時停止轉(zhuǎn)動，使盤在室溫下靜止培育3-5分鐘。
在盤轉(zhuǎn)動時滴加入1ml樣品緩沖液作為洗滌液。加入1ml 100mM氟化鈉，通過盤轉(zhuǎn)動來分散。使盤靜止培育1-2分鐘，然后在迅速轉(zhuǎn)動測定盤時滴加入5ml樣品緩沖液。
對盤進行干燥，然后直接在CD-ROM程控讀頭中讀取，以測定每個放置有可斷裂間隔物的預(yù)定部位。
本發(fā)明不局限于這里列舉的實施例的范圍，這些實施例只是用來描述本發(fā)明的個別方面。實際上，除了那些已知的和本文公開的內(nèi)容外，根據(jù)前述描述和附圖所作的各種改進、等價方案和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些改進也包括所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文中引用的所用出版物均納入本文作參考。
權(quán)利要求
1．一種可斷裂信號元件，它包含可斷裂間隔物，所述可斷裂間隔物有一個與基材連接的末端，一個響應(yīng)信號的末端，以及所述基材連接末端和所述信號響應(yīng)末端間的一個斷裂位點；信號響應(yīng)物；與所選分析物上第一位點結(jié)合的第一側(cè)鏈成員；和與所述所選分析物上第二位點結(jié)合的第二側(cè)鏈成員；其中所述信號響應(yīng)物連接在所述可斷裂間隔物的所述信號響應(yīng)末端上，所述第一側(cè)鏈成員與所述信號響應(yīng)末端和所述斷裂位點間的所述可斷裂間隔物連接，所述第二側(cè)鏈成員與所述斷裂位點和所述基材連接末端間的所述可斷裂間隔物連接。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的可斷裂信號元件，其中所述信號響應(yīng)物反射或散射入射光。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的可斷裂信號元件，其中所述信號響應(yīng)物是金微球。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的可斷裂信號元件，其中所述金屬微球基本上由選自金、銀、鎳、鉑、鉻、銅的金屬組成。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的可斷裂信號元件，其中所述金屬微球基本上由金組成。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的可斷裂信號元件，其中所述金微球的直徑在1nm至10μm之間。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的可斷裂信號元件，其中所述金微球的直徑在0.5至5μm之間。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的可斷裂信號元件，其中所述金微球的直徑在1至3μm之間。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的可斷裂信號元件，其中所述斷裂位點易受化學(xué)斷裂。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的可斷裂信號元件，其中所述易化學(xué)斷裂的位點包括至少一個硅氧烷基團。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的可斷裂信號元件，其中所述第一側(cè)鏈成員和所述第二側(cè)鏈成員包括寡核苷酸。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的可斷裂信號元件，其中所述第一和第二側(cè)鏈成員寡核苷酸是5聚物至20聚物。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的可斷裂信號元件，其中所述第一和第二側(cè)鏈成員寡核苷酸是8聚物至17聚物。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的可斷裂信號元件，其中所述第一和第二側(cè)鏈成員寡核苷酸是8聚物至12聚物。
15．根據(jù)權(quán)利要求1所述的可斷裂信號元件，其中所述第一側(cè)鏈成員包括第一專一性結(jié)合對的第一成員，所述第二側(cè)鏈成員包括第二專一性結(jié)合對的第一成員，和所述第一專一性結(jié)合對的所述第二成員與所述第二專一性結(jié)合對的所述第二成員各自在單個分析物的表面上。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的可斷裂信號元件，其中所述第一專一性結(jié)合對的所述第一成員包括第一抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述第二專一性結(jié)合對的所述第一成員包括第二抗體、抗體片段或抗體衍生物。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的可斷裂信號元件，其中所述第一側(cè)鏈成員包括第一側(cè)鏈成員寡核苷酸，所述第二側(cè)鏈成員包括第二側(cè)鏈成員寡核苷酸，所述第一專一性結(jié)合對的所述第一成員包括第一結(jié)合對寡核苷酸，所述第二專一性結(jié)合對的所述第一成員包括第二結(jié)合對寡核苷酸，和所述第一側(cè)鏈成員寡核苷酸包括的序列與所述第一結(jié)合對寡核苷酸中包括的序列互補，所述第二側(cè)鏈成員寡核苷酸包括的序列與所述第二結(jié)合對寡核苷酸中包括的序列互補，所述的互補序列是非共價締合的。
18．一種測定裝置，它包括固體載體基材，和多個如權(quán)利要求1所述的可斷裂信號元件，其中所述可斷裂信號元件通過其基材連接末端以空間可尋址的樣式與所述固體載體基材相連接。
19．一種測定裝置，它包括固體載體基材，和多個權(quán)利要求2-17任一所述的可斷裂信號元件，其中如所述可斷裂信號元件通過基材連接末端以空間可尋址的樣式與所述固體載體基材相連接。
20．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其中所述固體載體基材是選自聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯的塑料。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的測定裝置，其中所述固體載體基材是聚碳酸酯。
22．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其中所述固體載體基材被制成盤狀。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定裝置，其中所述盤的外徑約為120mm，厚度約為1.2mm。
24．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其中每個所述可斷裂信號元件的所述信號響應(yīng)物是鐵磁性的。
25．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其中所述第一側(cè)鏈成員包括第一抗體、抗體片段或抗體衍生物，和所述第二側(cè)鏈成員包括第二抗體、抗體片段或抗體衍生物。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的測定裝置，其中所述第一抗體和所述第二抗體對病毒的不同表位位點有專一性，該病毒選自人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人皰疹病毒。
27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的測定裝置，其中所述第一抗體和所述第二抗體對人免疫缺陷病毒的表位有專一性。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的測定裝置，其中所述免疫缺陷病毒是HIV-1。
29．根據(jù)權(quán)利要求27所述的測定裝置，其中所述免疫缺陷病毒是HIV-2。
30．根據(jù)權(quán)利要求26所述的測定裝置，其中所述病毒是丙型肝炎。
31．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其包括多個識別不同分析物的所述信號元件。
32．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，其中信號元件的空間模式表示了一種或多種分析物的濃度。
33．根據(jù)權(quán)利要求18所述的測定裝置，它還包括編碼在載體基材上的計算機軟件。
34．一種測定方法，該方法包括下列步驟使權(quán)利要求18所述的測定裝置與液體樣品接觸，使所述測定裝置與用來斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測受分析物束縛的、斷裂的、連接在固體載體基材上的信號元件上信號響應(yīng)物的存在。
35．一種測定方法，該方法包括下列步驟使權(quán)利要求19所述的測定裝置與液體樣品接觸，使所述測定裝置與用來斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測受分析物束縛的、斷裂的、連接在固體載體基材上的信號元件上信號響應(yīng)物的存在。
36．根據(jù)權(quán)利要求34所述的測定方法，其中所述信號元件包括一個或多個硅氧烷部分，所述斷裂劑包括氟化鈉。
37．根據(jù)權(quán)利要求36所述的測定方法，其中所述斷裂劑包括1mM至1M氟化鈉。
38．根據(jù)權(quán)利要求36所述的測定方法，其中所述斷裂劑包括50mM至500mM氟化鈉。
39．根據(jù)權(quán)利要求36所述的測定方法，其中所述斷裂劑包括100mM的氟化鈉。
40．根據(jù)權(quán)利要求34所述的測定方法，它還包括一步或多步洗滌步驟。
41．根據(jù)權(quán)利要求34所述的測定方法，它還包括使所述測定裝置轉(zhuǎn)動的步驟。
42．一種核酸雜交測定方法，該方法包括下列步驟使權(quán)利要求18所述的測定裝置與含有核酸的液體樣品接觸，其中至少一個所述連接的信號元件的第一側(cè)鏈成員和第二側(cè)鏈成員各自包括寡核苷酸，使所述測定裝置與用來斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測受分析物束縛的、斷裂的、連接在固體載體基材上的信號元件上信號響應(yīng)物的存在。
43．一種核酸測序方法，該方法包括下列步驟使權(quán)利要求18所述的測定裝置與含有核酸的液體樣品接觸，其中每一個所述連接的信號元件的第一側(cè)鏈成員和第二側(cè)鏈成員包括寡核苷酸，使所述測定裝置與用來斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測受分析物束縛的、斷裂的、連接在固體載體基材上的信號元件上信號響應(yīng)物的存在，其中側(cè)鏈成員寡核苷酸序列的空間可尋址樣式允許根據(jù)信號響應(yīng)來計算重建鄰接的序列。
44．一種免疫測定方法，該方法包括下列步驟使權(quán)利要求18所述的裝置與含有抗原分析物的液體樣品接觸，其中至少一個所述連接的信號元件的第一側(cè)鏈成員和第二側(cè)鏈成員各自包括抗體、抗體片段或抗體衍生物，使所述測定裝置與用來斷裂所述多個連接的可斷裂信號元件的斷裂劑接觸，除去所述斷裂的信號元件的信號響應(yīng)末端，和檢測受分析物束縛的、斷裂的、連接在固體載體基材上的信號元件上信號響應(yīng)物的存在。
45．根據(jù)權(quán)利要求44所述的測定方法，其中所述第一和所述第二抗體各自識別病毒的表位位點，該病毒選自人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人皰疹病毒。
46．根據(jù)權(quán)利要求45所述的免疫測定方法，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒。
47．根據(jù)權(quán)利要求46所述的免疫測定方法，其中所述病毒是HIV-1。
49．根據(jù)權(quán)利要求46所述的免疫測定方法，其中所述病毒是HIV-2。
50．根據(jù)權(quán)利要求45所述的免疫測定方法，其中所述病毒是乙型肝炎病毒。
51．根據(jù)權(quán)利要求45所述的免疫測定方法，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。
52.根據(jù)權(quán)利要求45所述的免疫測定方法，其中所述病毒是人皰疹病毒。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于定量和定性測定裝置的可斷裂信號元件。所述分析物與可斷裂信號元件中對分析物有專一性的第一和第二側(cè)鏈成員的同時結(jié)合將信號響應(yīng)物束縛在信號元件的底物連接末端上,盡管第一和第二側(cè)鏈成員間的斷裂位點隨后會發(fā)生斷裂。本發(fā)明還描述了包含可斷裂信號元件的測定裝置,以及采用測定裝置的分析方法。本發(fā)明的分析裝置可用常規(guī)的CD－ROM和DVD讀頭來檢測。
文檔編號C07K16/08GK1230216SQ9719772
公開日1999年9月29日 申請日期1997年7月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月8日
發(fā)明者J·弗塔嫩 申請人:伯斯坦恩實驗室股份有限公司