專利名稱：信號系統(tǒng)及其使用的元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)光信號系統(tǒng)，尤其是包括熒光素酶和蟲螢光素的生物發(fā)光信號系統(tǒng)的應用，用于該方法的特定的新基因和蛋白質(zhì)，以及涉及用于該系統(tǒng)的元件的生產(chǎn)。
生物發(fā)光信號系統(tǒng)是眾所周知的且在生物技術(shù)中具有廣泛的應用，尤其是在微生物的檢測領(lǐng)域，或在細胞活性的研究中作為生理報道分子。
普通的生物發(fā)光信號系統(tǒng)利用在自然界的生物例如螢火蟲和發(fā)光蠕蟲中發(fā)現(xiàn)的熒光素酶，以及酶底物，蟲螢光素的組合。在可在所有細胞中發(fā)現(xiàn)的三磷酸腺苷(ATP)的存在下，熒光素酶氧化蟲螢光素來生成氧合蟲熒光素與半胱氨酸以及生物發(fā)光信號，后者可通過例如利用光度計來監(jiān)控。
信號反應可被表示如下 其中虛線箭頭表示一種生物發(fā)光信號。
然而氧合蟲熒光素是該反應的抑制劑，其意味著此體系中產(chǎn)生的任何信號均是很短暫的。因此，人們有必要提供一種顯著過量的D-蟲螢光素到任意的反應體系來確保產(chǎn)生充分和可測量的信號。
用于檢測微生物等的試驗的實例，其利用一種如包括在WO 94/17202和WO 96/02665實施例中所描述的體系。
胞內(nèi)ATP的濃度依賴細胞的健康狀態(tài)或發(fā)育階段可以變化10倍或更多倍。這對于測量作為例如藥物，毒素，激素，環(huán)境因素或疾病對于細胞影響的研究手段的胞內(nèi)ATP水平的波動有著非常大的價值。
在現(xiàn)有技術(shù)中，各種各樣的方法被用于分析活體內(nèi)ATP的濃度。例如，在Dementieva等(1996)Biochemistry(莫斯科)Vol 61，No.7中所描述的，大腸桿菌中胞內(nèi)ATP濃度是通過利用一種重組熒光素酶計算ATP的總量，并除以估計的總細胞容積來進行測定的。
這樣的一種間接方法僅僅至多得到一個實際ATP濃度的估計值。
熒光素酶往往被用作基因表達(體內(nèi))的標記，其在細胞中的產(chǎn)生與特定的遺傳調(diào)控元件相關(guān)聯(lián)。蟲螢光素被外源地加入，胞內(nèi)的ATP濃度，在幾乎所有的環(huán)境中，使得該酶被飽和。因而基因表達的開啟通過與所產(chǎn)生的活性熒光素酶的量相對應的以定量方式發(fā)射的光來顯示。
通常熒光素酶的濃度被測定；濃度然后與不同的結(jié)果例如啟動子的效率相關(guān)聯(lián)。眾所周知，人們利用ATP米-曼氏常數(shù)Km降低(Michaelis-Menten constant Km)的熒光素酶(參見例如WO 96/22376)確保周圍環(huán)境[ATP]的變化不影響該試驗。
一種突變熒光素酶被描述在WO 98/46729中，其因為具有比正常熒光素酶更高的米-曼氏常數(shù)Km而對體內(nèi)進行的細胞ATP試驗特別有用。通過利用與現(xiàn)有技術(shù)中已知的熒光素酶相比較具有增加的Km的熒光素酶，來測定穩(wěn)定狀態(tài)的ATP濃度的可能性是很大的。因為，一般而言，酶速率(V，通過發(fā)光強度測定的)以及底物濃度(ATP的，其中蟲螢光素是過量的)之間的關(guān)系如下V＝Vm.[ATP]/Km+[ATP]因此可以看到只有當Km大于(或同一數(shù)量級)周圍環(huán)境[ATP]時，在[ATP]變化和發(fā)光強度變化之間有一個比例程度。其中Km比周圍的[ATP]少得多，任何[ATP]的變化不會真正影響測定的發(fā)光強度。無疑地，發(fā)光檢測越敏感，可檢測的“V”的變化可以越小，并且相對于被估價的[ATP]范圍的Km越小。
對于特定的應用，例如，體內(nèi)檢測，具有在400μm到1.4mM之間的數(shù)量級例如500μm，600μm，1mM等的Km的熒光素酶可能是有利的。然而，從上述的討論可以理解，主要標準是Km不比被評價的所期望的[ATP]范圍小太多。
特定的對于血細胞的生理學試驗重要的所期望的[ATP]范圍在300μm和1mM之間，或更特別地為380μm和620μm之間，(cf.SigmaDiagnostic Kit，Catalog No.366上面所討論的)。對于其它的哺乳動物細胞例如肝細胞而言，[ATP]范圍為2.5mM-6mM(參見Dementieva等(1996)上討論的)。重組熒光素酶諸如WO 96/22376中所描述的重組熒光素酶的應用尤其適用于在這些范圍中的連續(xù)試驗。
在所有這類試驗中，然而，其又被用作細胞健康狀態(tài)的生理報道分子，例如在藥物等的篩選過程中，細胞被適當?shù)剞D(zhuǎn)化使得其表達熒光素酶。然而，如上所述，蟲螢光素必須被外源施加。不幸運地是，蟲螢光素僅僅在pH＜5時是細胞-可透過的，而所述的pH通常被認為不是一種生理學可接受的pH。因而將這些反應物添加到傳統(tǒng)的細胞試驗中不是容易的。為了監(jiān)控在較長周期中細胞ATP的水平，維持整個周期的低pH是必要的，其本身對細胞有不利的影響。這些限制了此類試驗在尤其要求高強度操作的高通量篩選的應用。
此外，盡管螢光素酶可通過重組DNA技術(shù)來制備，D-蟲螢光素通常被合成生成，作為所期望的D-異構(gòu)體和不需要的L-異構(gòu)體的混合物，其在應用之前必須被分離。這是一個不經(jīng)濟的方法。
US專利No.5,814,504描述了一種40kD的分離自螢火蟲的蛋白質(zhì)，當其與氧合蟲熒光素和D-半胱氨酸結(jié)合時產(chǎn)生螢火蟲D-蟲螢光素。此蛋白質(zhì)據(jù)說在改進來自螢光素酶/蟲螢光素反應體系的熒光信號的持久性以及降低用于該反應的螢光素酶和蟲螢光素的量方面是有用的。利用此蛋白質(zhì)產(chǎn)生螢火蟲蟲螢光素的方法也已被描述。螟螢火蟲(Photinus pyralis)的此蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及相應的mRNA可在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得，登錄號分別為BAB60700和AB062786。
其它來自十字螢火蟲(Luciola cruciata)和橫紋螢火蟲(Luciolalateralis)的螢光素酶再生酶也已經(jīng)被公開(分別參見BAB85479和BAB85478)。
申請人已經(jīng)改進了此類蛋白質(zhì)及其編碼核酸的進一步的應用，并已經(jīng)進一步的發(fā)現(xiàn)可獲自發(fā)光蠕蟲具有相關(guān)活性的新的蛋白實例。
本發(fā)明提供了一種用于測定胞內(nèi)ATP和/或基因表達的方法，該方法包括用編碼螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞，導入蟲螢光素到所述細胞中，并監(jiān)控所述細胞的生物發(fā)光信號。
術(shù)語“蟲螢光素再生蛋白”或LRE是指轉(zhuǎn)化氧合蟲熒光素和半胱氨酸為蟲螢光素的蛋白。此類蛋白的實例描述在USP 5,814,504中，但申請人已經(jīng)克隆并測序另外的實例且這些構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面，在下面將被進一步的說明。
本發(fā)明的方法可用于監(jiān)控胞內(nèi)的ATP水平?？蛇x擇地或進一步地可被用于監(jiān)控螢光素酶基因或蟲螢光素再生基因的表達，因為所產(chǎn)生的信號與其中任何一個的表達水平相關(guān)，盡管其與螢光素酶的表達更直接地相關(guān)。
本發(fā)明的方法在允許用穩(wěn)定的光輸出來報道體內(nèi)基因的表達方面具有明顯的優(yōu)點。單一蟲螢光素可在細胞試驗的開始導入到細胞中，期間短暫的暴露于pH5。其后該細胞在試驗期間被恢復到生理pH中。盡管該蟲螢光素被快速地應用在該體系中，產(chǎn)生的氧合蟲熒光素將在細胞內(nèi)表達的蟲螢光素再生蛋白和存在于細胞內(nèi)的半胱氨酸，尤其是D-半胱氨酸的作用下被轉(zhuǎn)變回D-蟲螢光素。
結(jié)果，可獲得相對穩(wěn)定的光輸出，其提供了易于讀取的信號。此對于這種類型的體系是特別有好處的。
螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白可在細胞中被表達為兩個分離的蛋白。在這種情況下，用于轉(zhuǎn)化細胞的構(gòu)建體可是一個二部分組成的構(gòu)建體，一個部分含有編碼螢光素酶的基因，且第二部分含有編碼蟲螢光素再生蛋白的基因。優(yōu)選的，螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白被表達為融合蛋白。通過遺傳連接螢光素酶活性和再生活性，反應的動力學(體內(nèi)或體外)變得更加有利。此融合蛋白構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
如有必要，可增加D-半胱氨酸的細胞內(nèi)含量，例如通過進一步轉(zhuǎn)化該細胞使得其表達L-半胱氨酸消旋酶。
在一個優(yōu)選方案中，細胞被轉(zhuǎn)化使得其表達兩個螢光素酶，一個帶有相對高的Km值且一個帶有相對低的Km值。這些酶適當?shù)鼐哂锌杀鎰e的不同波長的輸出。在此系統(tǒng)中，試驗的有效測定范圍可被延伸?？蛇x擇地或進一步地，允許進行定量試驗，其中高Km螢光素酶的活性被與低Km螢光素酶的活性相比較。這樣，細胞生理可被連續(xù)地監(jiān)控，例如使得細胞毒素或被篩選樣品的其它副作用，能夠被快速的檢測。
帶有相對低的Km值的螢光素酶突變體的實例描述在WO 9622376中，且這些可用于本發(fā)明的上下文。
用于本發(fā)明方法中的轉(zhuǎn)化細胞的新構(gòu)建體構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。因而，本發(fā)明進一步的提供了一種DNA構(gòu)建體其含有(i)一個編碼螢光素酶的核酸序列，和(ii)一個編碼蟲螢光素再生蛋白的核酸序列。這些元件優(yōu)選的在合適的啟動子的調(diào)控下。其中該元件被表達為兩個蛋白質(zhì)，編碼螢光素酶的核酸序列在第一啟動子的調(diào)控下，且編碼蟲螢光素再生蛋白的核酸序列在第二啟動子的調(diào)控下。
然而，優(yōu)選的，這些元件的核酸序列被連接來表達螢光素酶和蟲螢光素再生酶的融合蛋白。在這種情況下，該核酸序列在一個單一啟動子的調(diào)控下。
如上所述，構(gòu)建體可適當?shù)睾幸粋€或多個其它的選自(iii)編碼其它螢光素酶的核酸序列；和(iv)編碼L一半胱氨酸消旋酶的核酸序列的元件。元件(iii)和(iv)合適地分別在第三和第四啟動子的調(diào)控下。
構(gòu)建體合適地為一或多個可用于細胞轉(zhuǎn)化的載體的形式。其中構(gòu)建體的元件存在于超過一個的載體上，這些載體可被用于共轉(zhuǎn)化靶細胞。
此方法中轉(zhuǎn)化的細胞可以是真核的或原核的。為進行細胞試驗，可以理解真核細胞，例如哺乳動物或植物細胞將是所需要的。選擇在靶細胞中有功能的載體和啟動子，如現(xiàn)有技術(shù)中所常用的。
用于本發(fā)明構(gòu)建體的核酸編碼具有特定活性的蛋白。優(yōu)選的至少用于這些核酸中的一些密碼子對于靶細胞種類而言是“最佳的”，如現(xiàn)有技術(shù)常用的。例如，特定的細胞類型更有效地表達帶有特定GC含量百分比的核酸并且由于遺傳密碼的簡并性，可以選擇密碼子使得核酸具有類似的GC含量％。
上述的元件(i)和/或(iii)的核酸序列的實例是本領(lǐng)域公知的。它們合適地編碼具有所期望的特性例如熱穩(wěn)定性，Km值以及比色特性的熒光素酶。通過本發(fā)明構(gòu)建體的核酸合適地編碼的突變型熒光素酶的實例被描述在EP-A-0528448，WO 95/25798，WO 96/22376，WO 98/46729，WO 00/24878，WO 01/31028，WO 9914336和WO 01/20002中。
合適的L-半胱氨酸消旋酶(上述的元件(iv))的實例是現(xiàn)有技術(shù)已知的。例如，氨基酸消旋酶，帶有低的底物特異性，來自惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)(在EcoCyc數(shù)據(jù)庫中命名為EC 5.1.1.10)已知催化L-氨基酸到D-氨基酸的轉(zhuǎn)化。
可用于本發(fā)明構(gòu)建體的元件(ii)中的核酸的一個實例編碼如圖解于下面附圖2中的SEQ ID NO 1的蛋白，或一個蟲螢光素再生片段或其變體。這些蛋白可獲自螟螢火蟲(Photinus pyralis)。其它已知的蟲螢光素再生酶的實例為可獲自Luciola種的例如十字螢火蟲(Luciola cruciata)和橫紋螢火蟲(Luciola lateralis)的蛋白。此序列的特定實例在下文被提供為SEQ ID NO 62和63。因此包含在本發(fā)明構(gòu)建體中的核酸可編碼蛋白質(zhì)SEQ ID NOS 62或63，或其蟲螢光素再生片段，或這些的任意的變體。
此處所用的術(shù)語“片段”是指基本序列的具有所需酶活性的一或多個部分。這些可以是缺失突變體。一般而言，該部分包含基本序列的至少12個和優(yōu)選至少20個氨基酸。
術(shù)語“變體”包括等位基因的變體和由于多基因拷貝存在于不同位點發(fā)現(xiàn)的變體。此外，術(shù)語“變體”包括氨基酸的序列或編碼氨基酸的核酸序列，其因為序列中的一或多個氨基酸被其它的氨基酸取代而不同于所起源的基本氨基酸序列。當一個氨基酸被用一個不同的帶有非常類似的特性的氨基酸取代時，氨基酸取代可被認為是“保守的”。非保守的取代是其中的氨基酸被用一不同類型的氨基酸取代。一般說來，不改變多肽的生物活性的非保守取代幾乎沒有。合適的變體應與基本的序列至少有60％的同源性，優(yōu)選的至少75％的同源性，以及更優(yōu)選的至少90％的同源性。在此情況下的同源性可被判定例如利用Lipman-Pearson算法，設置Ktuple2，缺口罰分4，缺口長度罰分12，標準PAM計分矩陣(Lipman，D.J.和皮爾森，W.R，Rapid和Sensitive Similarity Searches，Science，1985，vol.227，1435-1441)。
特定的編碼SEQ ID NO 1的核酸實例為在附圖2中顯示為SEQ ID NO2的mRNA序列。合適的編碼蛋白SEQ ID NO 1的基因組序列的實例，為下文附圖4中圖解的SEQ ID NO 11。
在一個可選擇的實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包括元件(ii)其是一個獲自發(fā)光蠕蟲例如夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)的編碼蟲螢光素再生蛋白，或其蟲螢光素再生片段，或其任意的變體的核酸。
特定的，核酸編碼一個含有如附

圖10所示的SEQ ID NO 3的蟲螢光素再生蛋白，或一個含有如附圖12所示的SEQ ID NO 39的蟲螢光素再生蛋白，或一個含有如附圖16所示的SEQ ID NO 59的蟲螢光素再生蛋白或一個蟲螢光素再生片段或任意這些的變體。
含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 59的蟲螢光素再生蛋白是新的，其與蟲螢光素再生片段，以及具有至少60％，更優(yōu)選的至少80％，進一步更優(yōu)選的至少90％以及最優(yōu)選的至少95％同源性或同一性的變體一起構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
本發(fā)明的一個特定的實施方案包括一個含有附圖10中圖解的SEQID NO 3的蟲螢光素再生蛋白。
本發(fā)明的一個可選擇的實施方案包括一個含有附圖12中圖解的SEQ ID NO 39的蟲螢光素再生蛋白。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案包括一個含有附圖16中的SEQ ID NO59的蟲螢光素再生蛋白。
此蛋白且特別是蛋白SEQ ID NO 59，可獲自夜光螢火蟲(Lampyrisnoctiluca)且因此等位基因變體也可從此種中獲得。該序列被克隆且部分序列被測定，如實施例1所述。然而克隆方法不是簡單的，在某種程度上取決于好象存在于蟲螢光素再生蛋白質(zhì)的自然基因中的大內(nèi)含子的存在。
本發(fā)明進一步的，提供了一個核酸其編碼含有SEQ ID NO 3的蟲螢光素再生蛋白，含有SEQ ID NO 39的蟲螢光素再生蛋白，或含有SEQID NO 59的蟲螢光素再生蛋白，或其蟲螢光素再生片段，或任意這些的具有至少60％序列同源性或同一性的變體。特定的，本發(fā)明的核酸編碼含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或SEQ ID NO 59的蟲螢光素再生蛋白。
此種序列的一個實例，其編碼蛋白SEQ ID NO 3，是附圖10所示的基因組序列(包括內(nèi)含子)SEQ ID NO 4。編碼蛋白SEQ ID NO 39的核酸序列的實例是如附圖12所示的SEQ ID NO 40。一個合適的cDNA序列含有SEQ ID NO 4而沒有內(nèi)含子(SEQ ID NO 41)或含有如附圖12所示的SEQ ID NO 38。特定的，核酸是顯示在附圖16中的SEQ ID NO58。
蛋白質(zhì)除可獲自特定的種之外，可通過結(jié)合來自不同種的酶的片段來產(chǎn)生嵌合的蟲螢光素再生酶。在這里，片段合適地含有由在基因組序列中發(fā)現(xiàn)的單獨外顯子所編碼的區(qū)域。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如，通常編碼這些蛋白質(zhì)的基因序列含有5個外顯子，通過4個不同大小的內(nèi)含子連接在一起，如附圖5，6，7，10，12和14中所描述的。嵌合的蟲螢光素再生蛋白合適地含有一個對應于序列表中外顯子I，II，III，IV和V的5個單獨外顯子的組合。
合適地，嵌合酶含有至少一個且優(yōu)選的直到4個來自螢火蟲種例如夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)的外顯子所編碼的片段。例如，申請人已經(jīng)通過將螟螢火蟲(Photinus pyralis)外顯子1的序列，與夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)蟲螢光素再生酶相當于該基因內(nèi)的外顯子2，3，4和5的片段拼接在一起制備出一種蟲螢光素再生酶。
此酶的一個實例在下文被圖解為SEQ ID NO 61。這些序列和蟲螢光素再生片段以及這些任何一個的變體，與編碼這些蛋白質(zhì)例如SEQ IDNO 60的核酸序列一起，構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)可用于合成的D-蟲螢光素以及其它旋光的酶底物的生產(chǎn)。例如它們可用于磷酸酶或半乳糖苷酶的有旋光活性的底物的再生。
因此在更進一步的一個方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生旋光活性酶底物例如D-蟲螢光素的方法，其包括用一種含有SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 39或其蟲螢光素再生片段，或任意的這些具有至少60％同源性或同一性的再生蛋白，以及任意的影響該轉(zhuǎn)化所必須的其它氨基酸例如半胱氨酸來接觸所述底物的氧化形式，例如氧合蟲熒光素。
該反應在合適的溶劑，例如水溶劑中，在再生酶有活性的溫度下合適地作用，所述的溫度將依賴所涉及的特定的酶而變化。例如，反應可在生理相容性緩沖液例如，25mM-50mM磷酸鹽或HEPES pH6.5-7.5的存在下以及20-30℃的反應溫度下進行。
本發(fā)明現(xiàn)在通過參考附圖的實例的方式特定地描述，其中附圖1顯示了試驗設計以及在夜光螢火蟲(L.noctiluca)中發(fā)現(xiàn)的編碼蟲螢光素-再生蛋白(酶)(LRE)的基因的鑒定的結(jié)果；附圖2顯示了螟螢火蟲(Photinus pyralis)LRE mRNA的序列以及對應的蛋白序列，獲自NCBA數(shù)據(jù)庫(分別為SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 1)；附圖3顯示了一系列用來擴增P.pyralis LRE全基因的引物；附圖4顯示了來自P.pyralis的LRE基因的全序列(SEQ ID NO 11)與mRNA序列(SEQ ID NO 2)比對；其中外顯子被顯示為陰影；附圖5圖示了基于保守的氨基酸序列及其相對于氨基酸序列(SEQID NO 1)的位置設計的用于擴增L.noctiluca同系物或P.pyralis LRE小區(qū)域的通用引物，；附圖6顯示了一個來自夜光螢火蟲(L.noctiluca)350個堿基對的PCR產(chǎn)物，與P.pyralis mRNA和DNA序列的比對；附圖7顯示了用于5′和3′基因組步移實驗的引物；附圖8圖示了根據(jù)基因組步移實驗構(gòu)建毗連序列的圖；附圖9顯示了來自L noctiluca的5′UTR基因組步移序列，圖解了基因的3種形式的存在；附圖10顯示了蛋白序列(SEQ ID NO 3)以及含有夜光螢火蟲(L.noctiluca)的LRE的編碼核酸序列(SEQ ID NO 4)；附圖11顯示了來自4個不同個體的SEQ ID NO 4以及一些等位基因或其它的變體；附圖12顯示了一個完全蛋白序列(SEQ ID NO 39)，編碼基因核酸序列(SEQ ID NO 40)以及推定的含有夜光螢火蟲(L.noctiluca)的LRE的mRNA序列(SEQ ID NO 38)；附圖13顯示了來自L.noctiluca的全長蟲螢光素再生酶基因序列的推定的氨基酸序列與來自螟螢火蟲(Photinus pyralis)的LRE蛋白序列(登錄號BAB60700)的比對，其顯示了55.7％的氨基酸同源性；附圖14類似于附圖12但顯示了基因組序列中內(nèi)含子區(qū)域的正確位置(SEQ ID NO 40)；附圖15是一個顯示利用外顯子-連接介導的PCR進行的蟲螢光素再生酶(LRE)cDNA構(gòu)建的圖解；附圖16顯示了夜光螢火蟲(L.noctiluca)LRE1(SEQ ID NO 46)的DNA序列(SEQ ID NO 45)以及推定的氨基酸序列；附圖17顯示了夜光螢火蟲(L.noctiluca)LRE1(SEQ ID NO 48)的DNA序列(SEQ ID NO 47)以及推定的氨基酸序列；附圖18顯示了來自LnocLRE1(1noc LRE)(SEQ ID NO 59)以及ChimLREI(chim LRE)(SEQ ID NO 61)的氨基酸序列與3個公開的LRE‘s十字螢火蟲(Luciola cruciata)-Lcru LRE(BAB85479)(SEQ IL NO62)以及Photinus pyralis-Ppyr LRE(BAB60700)(SEQ ID NO 1)的比對；以及附圖19圖解了pET-28a-c(+)克隆載體(Novagen)其中A.是pET-28(+)的質(zhì)粒圖譜，以及B顯示了pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域的序列，插入位點用*標記。
實施例1來自夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)的LRE基因的克隆和測序夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)，歐洲螢火蟲自2000-2002采于南英格蘭。通過高純度PCR模板制備試劑盒(Roche)提取雌性樣品的總的基因組DNA。通過類似的方式從凍干的螟螢火蟲(Photinuspyralis)樣品(Sigma)抽提基因組DNA。
公開的螟螢火蟲(P.pyralis)LRE mRNA序列(SEQ ID NO 2)，獲自GENBANK，被用于設計一套通用有引物來試圖從L.noctiluca的提取物中擴增一個同源的基因序列。然而，這些嘗試，是不成功的。盡管利用常規(guī)的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產(chǎn)生許多的產(chǎn)物，所有這些看上去是非特異性的擴增子。
為了克服這些困難，申請人設計了一組的5個引物(SEQ ID NOS5-9)來擴增全部的P.pyralis LRE基因，如附圖3中所圖解的。這些引物在SEQ ID NO 2上的位置也被顯示在此圖中。
利用這些引物擴增的結(jié)果，產(chǎn)生了其他的序列信息。通過初始序列與這些序列的結(jié)合，產(chǎn)生了P.pyralis LRE基因的全序列圖譜(SEQID NO 11)且被顯示于附圖4中。在這些附圖中，完全的基因序列被與mRNA序列(SEQ ID NO 2)比對。外顯子被描述且顯示為陰影。
基于保守的氨基酸序列設計通用引物來擴增P.pyralis LRE的夜光螢火蟲(L.noctiluca)同系物的一個小的區(qū)域。這些包括6個正向引物(SEQ ID NOS 12-18)和5個反向引物(SEQ ID NOS 19-23)。該引物的序列以及它們的相對于氨基酸序列的位置(SEQ ID NO 1)被圖解于附圖5中。
利用LRE通用引物FOR5(SEQ ID NO 17)和LRE通用的REV 3(SEQ IDNO 22)，從夜光螢火蟲(L.noctiluca)擴增得到一個350個堿基對的PCR產(chǎn)物。這些被測序(SEQ ID NO 24)且如附圖6所顯示的與P.pyralis LRE mRNA和基因組序列(分別為SEQ ID NOs 25和26)有同源性。這些確證了在夜光螢火蟲(L.noctiluca)中的確有一個LRE同系物。
基于此信息，設計4個引物(SEQ ID NOs 27-30)來進行5和3′基因組沿著L.noctiluca LRE基因的步移。這些引物的序列以及在SEQID NOs 24-26上的位置被圖解于附圖7中。
作為利用這些引物5′和3′基因組進行步移的結(jié)果，從5′和3′末端獲得6個克隆且正向和反向測序。產(chǎn)生的圖譜包括原始350bp序列下游的全序列。5′末端的序列與P.pyralis外顯子/內(nèi)含子的任何區(qū)域沒有同源性。所有步移序列的重疊群，圖解在附圖8中，在比對中產(chǎn)生超過兩個等位基因，此表明該基因在L.noctiluca中可能有超過一個的位點。
這些被進一步的圖解在附圖9中，其顯示了來自L.noctiluca的5′UTR基因組步移序列。該基因的3個不同的等位基因形式(SEQ IDNOS 10，64和65)在一個個體中，表明了該基因存在兩個或更多個拷貝。在這些附圖中外顯子II從圖解的序列中的精氨酸和位點855處開始。
3′UTR基因組步移序列(不顯示)表明在一個個體中有兩個基因的不同形式。
從此操作中獲得的夜光螢火蟲(L.noctiluca)LRE蛋白的大部分序列和編碼序列分別在附圖10中被圖解為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO4。
來自4個不同個體的一些等位基因變體在附圖11顯示為SEQ IDNOS 31-37。
人們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)夜光螢火蟲(L.noctiluca)的內(nèi)含子I顯著地小于來自P.pyralis.的內(nèi)含子。在夜光螢火蟲(L.noctiluca)中獲得了除內(nèi)含子I和外顯子I以外的完全序列。來自夜光螢火蟲(Lampyris noctiluca)的蟲螢光素再生蛋白的完全基因序列，推定的mRNA和蛋白序列在附圖12中分別顯示為SEQ ID NOS 40，41和39。
實施例2蟲螢光素再生蛋白質(zhì)的制備基于來自Lampyrís noctiluca的LRE基因序列(附圖14)設計5套引物，NOC LRE EX1-5來分別擴增各個外顯子(附圖15，表1)。
表1寡聚核苷酸和序列的列表。下劃線的堿基表示限制性內(nèi)切酶位點。
利用糾錯PFU聚合酶(Promega)進行PCR來最小化單個脫氧腺苷殘基被加到擴增片段的3′末端的可能性。
通過2％瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，從凝膠上切除并利用瓊脂糖凈化提純柱(AB Gene)提取。在第一個連接循環(huán)，2個外顯子對被連接在一起。連接反應在16℃下進行并過夜。0.2μl的結(jié)合反應液用于第二輪PCR。對每一外顯子連接對而言，一個正向和一個反向引物被用于擴增鄰接的產(chǎn)物(附圖15)。
電泳，凝膠切除以及凈化提純?nèi)缟纤鰜磉M行。在連接的第二輪，兩對的外顯子PCR產(chǎn)物被連接在一起。PCR擴增產(chǎn)生的鄰接產(chǎn)物隨后被用在最后的與其余外顯子的連接中。
最后的含有所有5個序貫連接的外顯子的PCR產(chǎn)物用pGEM-TEasy Vector System(Promega)來克隆并利用染料終止試劑盒(Beckman)測序來證實連續(xù)的開放閱讀框架且因此產(chǎn)生一個完全的轉(zhuǎn)錄本-LnocLRE1(附圖16)。由于P.pyralis和夜光螢火蟲(L.noctiluca)的LRE的外顯子1有明顯的差異，人們利用P.pyralis特異性引物(表1)，從P.pyralis擴增外顯子1，然后將其與夜光螢火蟲(L.noctiluca)的外顯子2-5拼接來產(chǎn)生一種嵌合的LRE-ChimLRE1(附圖17)。
序列鑒定從外顯子連接介導的PCR產(chǎn)生的兩個轉(zhuǎn)錄本，LnocLRE1和ChimLRE1分別為864bp和903bp。兩個序列(分別為SEQ NOS 58和60)，與推定的氨基酸序列(分別為SEQ ID NOS 59和61)一起顯示在附圖16和17中。這些氨基酸序列被顯示與以前報道的其它LRE比對(附圖18)且氨基酸的百分同一性被顯示在表2中。
表2 LnocLRE1和ChimLREI與3個公開的LRE，十字螢火蟲(Luciola cruciata)-Lcru LRE(BAB85479)，Luciola laterlais-Llat LRE(BAB85478)和螟螢火蟲(Photinus pyralis)-Ppyr LRE(BAB60700)之間的百分氨基酸同一性。
ChimLREILcru LRELlat LREPpyr LRELnocLRE190.651.550.654.1ChimLREI53.251.663.1Lcru LRE57.256.2Llat LRE50.8轉(zhuǎn)化到穩(wěn)定的大腸桿菌(E.coli)的表達菌株中通過用含有限制性內(nèi)切酶位點的引物進行PCR擴增將兩個LRE序列轉(zhuǎn)入合適的表達載體中，且在所選載體中能有正確取向和表達。設計的引物帶有一個Nco I和一個Xho I位點(表1)。PCR產(chǎn)物的限制性酶消化會導致粘性末端的產(chǎn)生，5′末端的Nco I位點和3′末端的Xho I位點。
可用于LRE序列表達的特定載體為pET-28a(附圖19)和16b克隆載體(Novagen)。前者將產(chǎn)生帶有一個C-末端His標記的蛋白。后者被用于產(chǎn)生天然蛋白(參見上述的克隆策略)。
克隆于pET質(zhì)粒中的目的基因在一個強T7啟動子的調(diào)控之下且需要在包含T7核糖核酸聚合酶基因的宿主中表達。這些通過BL21(DE3)宿主菌株的DE3溶素原來提供。然而，象pET重組體在表達菌株(DE3)中是不穩(wěn)定的，質(zhì)粒被保存在一個穩(wěn)定的E.coli菌株(XL1-Blue)中。重組質(zhì)粒因此可在誘導之前被轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)pLysS中。表達菌株pLysS被提供用于高度-嚴緊性的表達。
2μl的每一種連接反應液被加到100μl的感受態(tài)細胞(XL1-Blue)中并在42℃進行45秒的熱休克。
冰浴2分鐘后，加入0.9ml的SOC，然后將樣品37℃振蕩溫育1hr。在含有50μg/ml氨芐青霉素(用于pET)和34μg/ml氯霉素(用于pLysS)的LB平皿上選擇重組體。
25ng的重組體可在轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)pLysS之前被測序。
過量-表達每一構(gòu)建體的過夜培養(yǎng)物(3ml)(在含有氨芐青霉素，50μg/ml，和氯霉素，34μg/ml的LB中)，被用于接種1L的培養(yǎng)基。在誘導之前培養(yǎng)物被分開來提供一個對照(未誘導的樣品)和一個試驗(誘導的樣品)。所有的試驗樣品在0.45-0.6的光密度(A600)之間用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導3-5小時。
為驗證蛋白表達，1ml的未誘導的和誘導的兩個培養(yǎng)物樣品被沉淀。
對于每一沉淀，加入100-200μl的1X SDS溶解緩沖液(SB)且樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分析(SDS-PAGE，Laemmli，U.K.(1970))之前煮沸5分鐘。在噬菌體T4頭部的裝配過程中裂解結(jié)構(gòu)蛋白，Nature 227(259)680-85。
在變性和SDS-PAGE之前，任何蛋白制品的液態(tài)部分被加入等體積的2X SB。
溶解緩沖液1X 2X10％SDS100 2001M Tris50 1002-巰基乙醇 50 100PMSF 20 40EDTA 10 20甘油 100 200DH20 670 3401000μl 1000μl加入大約50μl 10mg/ml溴酚藍。
用10％分離膠和4％濃縮膠制備SDS-PAGE凝膠。凝膠在Tris/甘氨酸/SDS緩沖液
中，25-30mA下電泳大約1小時。通過在考馬斯藍中振蕩溫育(1hr)，然后脫色直到蛋白帶通過脫色清晰可見而觀察蛋白(參見下文)。
10％分離膠(制備4-5塊)dH2O 16.2ml1.5M Tris；0.384％SDS(Protogel 10ml緩沖液獲自National Diagnostics)10％SDS 450μl超高純的Protogel(30％w/v丙烯酰胺13.3ml獲自National Diagnostics)10％APS(每次制備新鮮的) 400μl四甲基乙二胺(Temed) 40μl4％濃縮膠(制備4-5塊)dH2O 12.2ml0.5M Tris；0.4％ SDS(Protogel 5ml緩沖液獲自National Diagnostics)10％SDS 200μl超高純的Protogel(30％w/v丙烯酰胺2.7ml獲自National Diagnostics)10％APS(每次配制新鮮的) 200μlTemed 40μl考馬斯亮藍考馬斯亮藍R-250 1g甲醇450ml水 450ml乙酸100ml脫色劑異丙醇 125ml乙酸50ml甘油15ml水 310ml
蛋白質(zhì)純化收集誘導的培養(yǎng)物(500ml)并重新懸浮在20ml的緩沖液中。通過超聲處理(25秒開啟，20秒關(guān)閉，10個循環(huán))制備可溶解的粗提物(澄清的樣品)并在離心14000rpm，20分鐘)后收集上清液。通過TALON親合樹脂(BD biosciences)依照生產(chǎn)商的說明書純化His-標記的蛋白質(zhì)。TELON樹脂利用固定化的鈷2+并且增強了對多聚組氨酸-標記的蛋白質(zhì)的選擇性。
純化的蛋白可通過SDS-PAGE來顯像并且依照Bradford試驗來定量測定(Bradford，M.M.(1976)一種利用蛋白-染料結(jié)合的原理用于蛋白微克定量分析的快速和靈敏的方法，Anal.Biochem.72248 54)。
實施例3用蟲螢光素再生酶進行的體內(nèi)試驗利用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化所有的細胞，使得它們表達LRE和熒光蟲熒光素酶活性。這些細胞被培養(yǎng)在含有0.6mM D-蟲螢光素的低pH(最大pH5.0)的緩沖液中0.5到10分鐘(取決于細胞的類型)。
然后從低pH緩沖液中分離細胞，洗滌，并重新懸浮在中性緩沖液中。可選擇的，低pH緩沖液被合適的堿中和。該細胞發(fā)出的生物熒光可以因此被檢測并通過光度計或其它的光-探測儀進行測定。此提供一種用于測定胞內(nèi)ATP的體內(nèi)試驗方法。
實施例4用蟲螢光素再生酶進行的體外試驗將一種含有ATP的待測定的樣品加到一種含有25mM Tricine-NaOHpH7.8，4.0mM MgSO4，0.1-10μg熒光蟲熒光素酶和0.1-20μg本發(fā)明的純化重組LRE，或0.1-40μg本發(fā)明的純化的重組螢光素酶-LRE融合蛋白，0.5-5mM D-半胱氨酸和250μM D-蟲螢光素的反應混合物中。利用光度計或其它的光檢測儀器檢測和測定該反應的光輸出，從而測定樣品的ATP含量。
所有上述說明書中提及的參考文獻都在此處引作參考。不違背本發(fā)明的精神和范圍的其它修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。雖然本發(fā)明已經(jīng)連同具體的優(yōu)選實施方案進行了描述，但是應該理解本發(fā)明不應該受限于此具體的實施方案。實際上，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的執(zhí)行本發(fā)明的描述的方式的多種修改應該在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>The Secretary of State for DefenceDay，John CSquirrell，David JBailey，Mark JWhite，Peter J<120>信號系統(tǒng)及其所使用的元件<130>CG/P/149/WOD<140>PCT/GB2002/005120<141>2002-11-13<150>GB 0127292.1<151>2001-11-14<150>GB 0205201.7<151>2002-03-06<160>73<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>308<212>PRT<213>螟螢火蟲(Photinus pyralis)<400>1Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val1 5 10 15
Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val20 25 30Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys35 40 45Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Leu Val Ser Phe Ile Ile Pro Leu50 55 60Ala Gly Ser Pro Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Ala65 70 75 80Ile Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ile Glu Ala85 90 95Ile Val Asn Val Glu Pro His Ile Lys Asn Asn Arg Leu Asn Asp Gly100 105 110Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Thr Gly Thr Met Ala Ile Asp115 120 125Ala Gly Leu Pro Val Gly Pro Val Thr Gly Ser Leu Tyr His Leu Gly130 135 140Ala Asp Lys Lys Val Lys Met His Glu Ser Asn Ile Ala Ile Ala Asn145 150 155 160Gly Leu Ala Trp Ser Asn Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser165 170 175Gly Lys Arg Arg Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ser180 185 190Ile Ser Asn Gln Arg Pro Leu Phe Thr Phe Glu Lys His Glu Val Pro195 200 205Gly Tyr Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Trp Val210 215 220Ala Val Phe Gln Gly Gln Arg Ile Ile Lys Ile Ser Thr Gln Gln Pro225 230 235 240Glu Val Leu Leu Asp Thr Val Lys Ile Pro Asp Pro Gln Val Thr Ser
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<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是a或g或c或t<400>15aaraargtna aaatgcatga 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是a或g或c或t<400>16aaraargtna agatgcatga 20<210>17<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是a或g或c或t<400>17athctnacnt gggatgg17<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是a或g或c或t<400>18athctnacnt gggacgg17<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19ccrgartcda trtartacat 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>22ccrgartcda tataatacat 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
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tatcatttag gggctgataa aaaggtaaaa atgcacgaga gcaacatagc tatagcaaat240gggctcgcgt ggagtaatga tttgaagaaa atgtattata ttgattggg289<210>26<211>343<212>DNA<213>螟螢火蟲<220>
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tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccctccagat tcgctggtga gtaaaagtat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag840taactggtct aggtgttcaa ggt863<210>32<211>851<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>32gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata120gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac240atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca300ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcctggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac540cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac600tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag840
gtgttcaagg t 851<210>33<211>863<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>33gataaaatac cgtctttgat tgttcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggtataa gttctacacc cacaagtata120aaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtctggaaa gtaatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata gaactataac240atgaaatcca acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atgcttttcc aacgggacca300gtaactggta gattgtttag tatgaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccaagacta gagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga tttacattcg ttgcatattt atgttgttta ttttcaggta atcgtcaaac540attgtttagt ctggaaaagc atcaaatccc gggatttccc gatggtcaaa caattgatac600tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccttccagat tcgctggtga gtaaaagtat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag840tatctggtct aggtgttcaa ggt863<210>34
<211>851<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>34gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata120gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac240atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca300ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcttggagc aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac540cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac600tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag840gtgttcaagg t 851<210>35<211>863<212>DNA<213>夜光螢火蟲
<400>35gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata120gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac240atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca300ttaaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac540cttgtttagt cttgaaaata atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac600tgatgataat ttatgggttg gtgtgttcga aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactca660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa ccttccagat tcgctggtga gtaaaagtat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa gtttataaag840tatctggtct aggtgttcaa ggt863<210>36<211>851<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>36gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata120
gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac240atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca300ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccatgacta aagtaatagg tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac540cttgtttagt cttgaaaaga atcgaatccc gggatttcca gatggtcaam caatagatac600tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag840gtgttcaagg t 851<210>37<211>851<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>37gataaaatac cgtctttgat tattcccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact 60ttagaccgag aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata120gaaacaatcg ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa ataatagaat taatgatggt180aaagcagatc atcttggtaa tctgtgggca ggtgaatgaa gaaatctata aaactataac240atgaaatcaa acgcaccttt ttcaggcacc atggacgtaa atggatatcc aacgggacca300
ataaccggta gattgtttag tataaattct actaaagacg ttagatacta cagaacaaac360atagcggtgt caaacggaat cgcttggagt aaagatttga agaaaatgta ttatattgat420tccatgacta aagtaataga tcaatacgat tttgatgctt ccaacagatt gatcagtata480cagtaaatga taaacattcg ttacatattt atgttgtata ttttcaggta atcgtcaaac540cttgtttagt cttgaaaaga atcaaatccc gggatttcca gatggtcaaa caattgatac600tgatgataat ttatgggttg ctgtgttcgg aggaaacaga gtgataaaaa ttagtactga660tatacctgaa acattactgt atactgtaaa cattccagat tcgcaggtga gtaaatggat720tgacattttc aaataatgta gatgtttatt agataacctc ggttgctttt ggtggaccaa780acttggatga attgtacgta acaagtggtg gtgggaaagt ttataaggta actggtctag840gtgttcaagg t 851<210>38<211>867<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>38atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac 60cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa120gtagataaaa taccgtcttt gattattccc ataagcggtt gttcaaatcg ttttcttatt180actttagacc gagaaatcgc catccttact tgggatggta taagttctac acccacaagt240ataaaaacaa tcgctgtagt tgacaatgag ccaggtctgg aaagtaatag aattaatgat300ggtaaagcag atcatcttgg taatctgtgg gcaggcacca tggacgtaaa tggatatcca360acgggaccaa taaccggtag attgtttagt ataaattcta ctaaagacgt tagatactac420
agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat480tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg540atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat600ggtcaaacaa ttgatactga tgataattta tgggttgctg tgttcgaagg aaacagagtg660ataaaaatta gtactcatat acctgaaaca ttactgtata ctgtaaacat tccagattcg720ctgataacct cggttgcttt tggtggacca aacttggatg aattgtacgt aacaggtggt780ggtaactttc tgaatgggaa agtttataaa gtatctggtc taggtgttca aggtttacct840gcaaatagga ttaaaataca taattaa867<210>39<211>288<212>PRT<213>夜光螢火蟲<400>39Met Gln Phe Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Asp Lys Thr Gln Ser Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Asp Leu Val Asp Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser20 25 30Leu Lys Arg His Thr His Ile Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile35 40 45Ile Pro Ile Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg50 55 60Glu Ile Ala Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser65 70 75 80
Ile Lys Thr Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn85 90 95Arg Ile Asn Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly100 105 110Thr Met Asp Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu115 120 125Phe Ser Ile Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile130 135 140Ala Val Ser Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr145 150 155 160Tyr Ile Asp Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala165 170 175Ser Asn Arg Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn180 185 190Asn Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp195 200 205Asn Leu Trp Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser210 215 220Thr His Ile Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser225 230 235 240Leu Ile Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr
245 250 255Val Thr Gly Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser260 265 270Gly Leu Gly Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn275 280 285<210>40<211>1125<212>DNA<213>夜光螢火蟲<220>
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taaagcagat catcttggta atctgtgggc aggtgaatga agaaatctat aaaactataa 480catgaaatca aacgcacctt tttcaggcac catggacgta aatggatatc caacgggacc 540aataaccggt agattgttta gtataaattc tactaaagac gttagatact acagaacaaa 600catagcggtg tcaaacggaa tcgcttggag taaagatttg aagaaaatgt attatattga 660ttccatgact aaagtaatag gtcaatacga ttttgatgct tccaacagat tgatcagtat 720acagtaaatg ataaacattc gttacatatt tatgttgtat attttcaggt aatcgtcaaa 780ccttgtttag tcttgaaaag aatcgaatcc cgggatttcc agatggtcaa acaatagata 840ctgatgataa tttatgggtt gctgtgttcg gaggaaacag agtgataaaa attagtactg 900atatacctga aacattactg tatactgtaa acattccaga ttcgcaggtg agtaaatgga 960ttgacatttt caaataatgt agatgtttat tagataacct cggttgcttt tggtggacca1020aacttggatg aattgtacgt aacaagtggt ggtgggaaag tttataaggt aactggtcta1080ggtgttcaag gtttacctgc aaataggatt aaaatacata attaa1125<210>41<211>867<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>41atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac 60cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa 120gtagataaaa taccgtcttt gattattccc ataagcggtt gttcaaatcg ttttcttatt 180actttagacc gagaaatcgc catccttact tgggatggta taagttctac acccacaagt 240ataaaaacaa tcgctgtagt tgacaatgag ccaggtctgg aaagtaatag aattaatgat 300
ggtaaagcag atcatcttgg taatctgtgg gcaggcacca tggacgtaaa tggatatcca360acgggaccaa taaccggtag attgtttagt ataaattcta ctaaagacgt tagatactac420agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat480tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg540atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat600ggtcaaacaa ttgatactga tgataattta tgggttgctg tgttcgaagg aaacagagtg660ataaaaatta gtactcatat acctgaaaca ttactgtata ctgtaaacat tccagattcg720ctgataacct cggttgcttt tggtggacca aacttggatg aattgtacgt aacaggtggt780ggtaactttc tgaatgggaa agtttataaa gtatctggtc taggtgttca aggtttacct840gcaaatagga ttaaaataca taattaa867<210>42<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>56<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56gagctctcga gttaattatr tattttwatc ctatttgcag 40<210>57<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>57gagctcccat ggggccagtt gttgaaaaaa ttgc 34<210>58<211>864<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>58atgcagtttg gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac 60cttgtagata aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa120gtagataaaa taccgtcttt gattattccc ataagcggtt gttcaaatcg ttttcttatt180
actttagacc gagaaatcgc catccttact tgggatggta taagttctac acccacaagt240ataaaaacaa tcgctgtagt tgacaatgag ccaggtctgg aaagtaatag aattaatgat300ggtaaagcag atcatcttgg taatctgtgg gcaggcacca tggacgtaaa tggatatcca360acgggaccaa taaccggtag attgtttagt ataaattcta ctaaagacgt tagatactac420agaacaaaca tagcggtgtc aaacggaatc gcttggagta aagatttgaa gaaaatgtat480tatattgatt ccatgactaa agtaatagat caatacgatt ttgatgcttc caacagattg540atcagtaatc gtcaaacatt gtttagtctt gaaaataatc aaatcccggg atttccagat600ggtcaaacaa ttgatactga tgataattta tgggttgctg tgttcgaagg aaacagagtg660ataaaaatta gtactcatat acctgaaaca ttactgtata ctgtaaacat tccagattcg720ctgataacct cggttgcttt tggtggacca aacttggatg aattgtacgt aacaggtggt780ggtaactttc tgaatgggaa agtttataaa gtatctggtc taggtgttca aggtttacct840gcaaatagga ttaaaataca taat 864<210>59<211>288<212>PRT<213>夜光螢火蟲<400>59Met Gln Phe Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Asp Lys Thr Gln Ser Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Asp Leu Val Asp Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser20 25 30Leu Lys Arg His Thr His Ile Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile35 40 45
Ile Pro Ile Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg50 55 60Glu Ile Ala Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser65 70 75 80Ile Lys Thr Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn85 90 95Arg Ile Asn Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly100 105 110Thr Met Asp Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu115 120 125Phe Ser Ile Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile130 135 140Ala Val Ser Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr145 150 155 160Tyr Ile Asp Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala165 170 175Ser Asn Arg Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn180 185 190Asn Gln Ile Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp195 200 205Asn Leu Trp Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser
210 215 220Thr His Ile Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser225 230 235 240Leu Ile Thr Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr245 250 255Val Thr Gly Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser260 265 270Gly Leu Gly Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn275 280 285<210>60<211>903<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌合的LRE-ChimLREI<400>60atggggccag ttgttgaaaa aattgcagaa cttggcaagt atacagttgg agaaggtcct 60cactgggatc atgaaactca gaccttatat ttcgtcgaca ccgtagagaa aacttttcat120aaatatgtac cttctcagaa aaaatacacg ttttgtaaag tagataaaat accgtctttg180attattccca taagcggttg ttcaaatcgt tttcttatta ctttagaccg agaaatcgcc240atccttactt gggatggtat aagttctaca cccacaagta taaaaacaat cgctgtagtt300gacaatgagc caggtctgga aagtaataga attaatgatg gtaaagcaga tcatcttggt360aatctgtggg caggcaccat ggacgtaaat ggatatccaa cgggaccaat aaccggtaga420
ttgtttagta taaattctac taaagacgtt agatactaca gaacaaacat agcggtgtca480aacggaatcg cttggagtaa agatttgaag aaaatgtatt atattgattc catgactaaa540gtaatagatc aatacgattt tgatgcttcc aacagattga tcagtaatcg tcaaacattg600tttagtcttg aaaataatca aatcccggga tttccagatg gtcaaacaat tgatactgat660gataatttat gggttgctgt gttcgaagga aacagagtga taaaaattag tactcatata720cctgaaacat tactgtatac tgtaaacatt ccagattcgc tgataacctc ggttgctttt780ggtggaccaa acttggatga attgtacgta acaggtggtg gtaactttct gaatgggaaa840gtttataaag tatctggtct aggtgttcaa ggtttacctg caaataggat taaaatacat900aat 903<210>61<211>301<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合的LRE-ChimLREI<400>61Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val1 5 10 15Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val20 25 30Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys35 40 45
Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Ile Pro Ser Leu Ile Ile Pro Ile50 55 60Ser Gly Cys Ser Asn Arg Phe Leu Ile Thr Leu Asp Arg Glu Ile Ala65 70 75 80Ile Leu Thr Trp Asp Gly Ile Ser Ser Thr Pro Thr Ser Ile Lys Thr85 90 95Ile Ala Val Val Asp Asn Glu Pro Gly Leu Glu Ser Asn Arg Ile Asn100 105 110Asp Gly Lys Ala Asp His Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Met Asp115 120 125Val Asn Gly Tyr Pro Thr Gly Pro Ile Thr Gly Arg Leu Phe Ser Ile130 135 140Asn Ser Thr Lys Asp Val Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn Ile Ala Val Ser145 150 155 160Asn Gly Ile Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp165 170 175Ser Met Thr Lys Val Ile Asp Gln Tyr Asp Phe Asp Ala Ser Asn Arg180 185 190Leu Ile Ser Asn Arg Gln Thr Leu Phe Ser Leu Glu Asn Asn Gln Ile195 200 205Pro Gly Phe Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Thr Asp Asp Asn Leu Trp210 215 220
Val Ala Val Phe Glu Gly Asn Arg Val Ile Lys Ile Ser Thr His Ile225 230 235 240Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Thr Val Asn Ile Pro Asp Ser Leu Ile Thr245 250 255Ser Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Gly260 265 270Gly Gly Asn Phe Leu Asn Gly Lys Val Tyr Lys Val Ser Gly Leu Gly275 280 285Val Gln Gly Leu Pro Ala Asn Arg Ile Lys Ile His Asn290 295 300<210>62<211>309<212>PRT<213>十字螢火蟲<400>62Met Ala Pro Thr Val Glu Gln Ile Val Glu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu1 5 10 15Ala Glu Ser Pro His Trp Asp Asp Glu Thr Gln Ser Leu Tyr Phe Val20 25 30Asp Ile Val Gly Arg Ser Val Asn Lys Tyr Val Pro Thr Thr Lys Thr35 40 45His Thr Gln Leu Lys Phe Asp Lys Asn Pro Ser Phe Ile Ile Pro Val50 55 60
Lys Gly Cys Ser Asp Arg Phe Ile Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Asn65 70 75 80Leu Leu Thr Trp Asp Gly Ala Ser Ser Ala Pro Ser Lys Ile Glu Lys85 90 95Ile Ala Val Phe Asp Asn Thr Pro Glu Lys Ser Glu Asn Arg Leu Asn100 105 110Asp Gly Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Met Asn115 120 125Met Gly Ser Asp His Thr Thr Gly Thr Pro Val Arg Gly Thr Leu Ser130 135 140Ser Leu Ser Asn Lys Gln Val Lys Glu His Val Ser Glu Val Cys Ile145 150 155 160Ser Asn Gly Leu Ala Trp Ser Lys Asp Leu Lys Lys Phe Tyr Tyr Ile165 170 175Asp Ser Ala Val Arg Gln Val Asp Gln Phe Asp Phe Asp Ala Lys Asn180 185 190Leu Ser Leu Ser Asn Arg Gln Pro Leu Phe Thr Phe Asp Lys His Gly195 200 205Ile Met Gly Ser Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Ala Glu Gly Asn Leu210 215 220Trp Val Ala Thr Cys Gln Gly Asp Lys Val Leu Lys Ile Asp Thr Ser
225 230 235 240Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ile Val Glu Ile Pro Glu His Gln Val245 250 255Thr Ser Val Cys Ile Gly Gly Ala Glu Leu Asn Val Leu Tyr Val Thr260 265 270Thr Ala Ser Ile Lys Leu Pro Gly Ala Asp Glu Thr Lys Pro Met Lys275 280 285Gly Ala Ile Tyr Lys Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Leu Pro Gly290 295 300Asp Arg Val Lys Leu305<210>63<211>307<212>PRT<213>橫紋螢火蟲<400>63Met Ser Pro Val Ile Glu Gln Ile Thr Glu Val Asp Asn Phe Gln Ile1 5 10 15Gly Glu Gly Pro His Trp Asp Thr Glu Thr Gln Ser Leu Tyr Phe Val20 25 30Asp Ile Leu Glu Lys Ser Ile His Lys Tyr Val Pro Ser Thr Lys Gln35 40 45
His Thr Lys Met Ile Leu Asn Lys Arg Pro Ser Phe Ile Ile Pro Ile50 55 60Lys Glu Thr Ser Asp Arg Phe Val Ile Ser Leu Glu Arg Asp Ile Cys65 70 75 80Val Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Thr Pro Ser His Leu Glu Thr85 90 95Ile Val Thr Val Asp Thr Gly Ile Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp Gly100 105 110Lys Ala Asp Ala Phe Gly Asn Leu Trp Ala Gly Thr Leu Tyr Ser Lys115 120 125Phe Asp Ile Glu Lys Gln Gly Pro Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Ser Leu130 135 140Ser Asn Lys Gln Leu Arg Lys His Ile Ser Asn Ile Phe Leu Ser Asn145 150 155 160Gly Leu Ala Trp Asn Lys Asp Ser Lys Lys Phe Tyr Phe Ile Asp Ser165 170 175Asn Lys Arg Thr Ile Asp Gln Phe Asp Tyr Asp Ser Glu Asn Leu Ile180 185 190Ile Ser Asn Cys Gln Pro Leu Phe Thr Leu Asp Lys His Gly Ile Gln195 200 205Gly Leu Pro Asp Ala Gln Thr Ile Asp Glu Asn Asp Asn Leu Trp Val210 215 220
Ala Ile Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Thr Lys Gln Pro225 230 235 240Glu Ser Leu Leu Gly Val Ile Asn Met Pro Glu Ser Leu Ile Thr Ser245 250 255Val Cys Phe Gly Gly Ser Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Val Thr Thr Ser260 265 270Gly Ile Lys Glu Tyr Glu Thr Asp Ser Thr Lys Leu Val Lys Gly Gly275 280 285Leu Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Leu Pro Ala His Arg290 295 300Phe Ser Leu305<210>64<211>958<212>DNA<213>夜光螢火蟲<220>
<221>misc_feature<222>(389)..(389)<223>n是不確定的<400>64atcgcattta tcgacgttcc taacatttta ctacttttgg ggagtgttat attgtaaagt 60tttgaataat tttcgtaagc tagtcacagg tctcgataga agtgtaagct ttaaccataa120atgttaatga tattattcca ttcaattgag cttctataaa atcttcattt tttggtttat180
aatgctgacg tgatcactgc tagattacgt tattcgtaga atttgcaata taattattta240agccgaaata tttcatcaat gagtacctca gtgtaattgt cactacgcat cacttttttt300tgtctgtcta gtacagctta cttccctcgt tatttgtgta atttcgtata gttatggata360atatctagta ttatctaaat ttacctatng tgtattacgt catgtagtta aaggttgctg420tattatcata catagaagtt aatacacaag taaaaacctt gatttttata gaaacctacg480acagcattgc aacggcacta gttatagaaa cagttgaaga agtggccaat atgcagtttg540gagaaggacc tcattgggat gataagacac aaagtttata tttggtggac cttgtagata600aatctattca caaatatgta ccatctctta aaagacatac ccatataaaa gtaggcaagt660attattacaa cttgttatat ccgagtcaac caaataatgt aaaaaattta cgtcagtccc720actataagat ttaagaaatt cataagtata aatttctatg ctcattttca gataaaatac780cgtctttgat tattgccata agcggttgtt caaatcgttt tcttattact ttagaccgag840aaatcgccat ccttacttgg gatggcatta gttctacacc cacaagtata gaaacaatcg900ctgtagttga caatgagcca ggtcttgaaa gtaatagaat taatgatggt aaagcaga 958<210>65<211>956<212>DNA<213>夜光螢火蟲<400>65aaattactta gtcgtctttt gtaagtttat gaaaaagttg catttttatt aatttgaatt 60ttgaataatt ttcgtaagct agtcacaggt ctcgatagaa gtgtaaactt taaccataaa120tgttaataat attattctat tcaactgagc ttctataaaa tcttcatttt tggtttataa180tactgatgta atctctgcta gattacgctt tggtagaatg gcaatataat taataattat240
ttaattctaa atacttgatc aatgagtacc tccgtgtaat tgtcactacg catcactttt300tttgtctgtc tagtacagct tacttccctc gttatttgtg taatttcgtg tagttatgga360taatatctag tcttatctaa atttatgtac tacgtcatgt agttaaagat tgctgtatca420tcatacatta aagttaaatg caaaagtaaa aacattgatt tttatagaaa actacggcag480cattgcaacg gcactagtta tagaaacagt tgaagaattg ggcactttta agactggaga540aggacctcat tgggatgata aaacacaaag tttatatttg gtggaccttg tagataaatc600tattcacaaa tatgtaccat ctcttaaaag acatacccat ataaaagtag gcaagtatta660ttacaacttg ttatatccaa gtcaaccaaa taatgtaaaa aatttacgtc agtcccacat720tcataaatat aaatatatca taaatataaa tttctatgct cattttcaga taaaataccg780tctttgatta ttcccataag cggttgttca aatcgttttc ttattacttt agaccgagaa840atcgccatcc ttacttggga tggtataagt tctacaccca caagtataaa aacaatcgct900gtagttgaca atgagccagg tcttgaaagt aatagaatta atgatggtaa agcaga956<210>66<211>300<212>PRT<213>螟螢火蟲<400>66Met Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Thr Val1 5 10 15Gly Glu Gly Pro His Trp Asp His Glu Thr Gln Thr Leu Tyr Phe Val20 25 30Asp Thr Val Glu Lys Thr Phe His Lys Tyr Val Pro Ser Gln Lys Lys35 40 45
Tyr Thr Phe Cys Lys Val Asp Lys Leu Val Ser Phe Ile Ile Pro Leu50 55 60Ala Gly Ser Pro Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Glu Arg Glu Ile Ala65 70 75 80Ile Leu Thr Trp Asp Gly Val Ser Ala Ala Pro Thr Ser Ile Glu Ala85 90 95Ile Val Asn Val Glu Pro His Ile Lys Asn Asn Arg Leu Asn Asp Gly100 105 110Lys Ala Asp Pro Leu Gly Asn Leu Trp Thr Gly Thr Met Ala Ile Asp115 120 125Ala Gly Leu Pro Val Gly Pro Val Thr Gly Ser Leu Tyr His Leu Gly130 135 140Ala Asp Lys Lys Val Lys Met His Glu Ser Asn Ile Ala Ile Ala Asn145 150 155 160Gly Leu Ala Trp Ser Asn Asp Leu Lys Lys Met Tyr Tyr Ile Asp Ser165 170 175Gly Lys Arg Arg Val Asp Glu Tyr Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ser180 185 190Ile Ser Asn Gln Arg Pro Leu Phe Thr Phe Glu Lys His Glu Val Pro195 200 205Gly Tyr Pro Asp Gly Gln Thr Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Trp Val
210 215 220Ala Val Phe Gln Gly Gln Arg Ile Ile Lys Ile Ser Thr Gln Gln Pro225 230 235 240Glu Val Leu Leu Asp Thr Val Lys Ile Pro Asp Pro Gln Val Thr Ser245 250 255Val Ala Phe Gly Gly Pro Asn Leu Asp Glu Leu His Val Thr Ser Ala260 265 270Gly Leu Gln Leu Asp Asp Ser Ser Leu Asp Lys Ser Leu Val Asn Gly275 280 285His Val Tyr Arg Val Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly290 295 300<210>67<211>292<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<220>
<221>CDS<222>(108)..(284)<223>
<400>67agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacc atg ggc agc 116
Met Gly Ser1agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg cgc ggc agc 164Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser5 10 15cat atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tcc gaa 212His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu20 25 30 35ttc gag ctc cgt cga caa gct tgc ggc cgc act cga gca cca cca cca 260Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro40 45 50cca cca ctg aga tcc ggc tgc taa caaagccc 292Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys55<210>68<211>58<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<400>68Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg20 25 30Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys50 55<210>69<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<220>
<221>CDS<222>(1)..(72)<223>
<400>69ggt cgg gat ccg aat tcg agc tcc gtc gac aag ctt gcg gcc gca ctc 48Gly Arg Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu1 5 10 15gag cac cac cac cac cac cac tga gatccggctg ctaacaaagc cc 94Glu His His His His His His20<210>70<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<400>70
Gly Arg Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu1 5 10 15Glu His His His His His His20<210>71<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<220>
<221>CDS<222>(1)..(93)<223>
<400>71ggt cgg atc cga att cga gct ccg tcg aca agc ttg cgg ccg cac tcg 48Gly Arg Ile Arg Ile Arg Ala Pro Ser Thr Ser Leu Arg Pro His Ser1 5 10 15agc acc acc acc acc acc act gag atc cgg ctg cta aca aag ccc 93Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ile Arg Leu Leu Thr Lys Pro20 25 30<210>72<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域
<400>72Gly Arg Ile Arg Ile Arg Ala Pro Ser Thr Ser Leu Arg Pro His Ser1 5 10 15Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ile Arg Leu Leu Thr Lys Pro20 25 30<210>73<211>89<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET-28a-c(+)克隆/表達區(qū)域<400>73gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 60cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttg 89
權(quán)利要求
1.一種測定胞內(nèi)ATP和/或基因表達的方法，該方法包括用帶有編碼螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白質(zhì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞，把蟲螢光素導入到所述細胞中，以及監(jiān)控所述細胞的生物發(fā)光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其被用于監(jiān)控胞內(nèi)ATP的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其被用于監(jiān)控螢光素酶表達。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中用蟲螢光素接觸所述細胞且在測定開始之前pH減小到小于5，其后，所述細胞被恢復到生理pH條件。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述細胞被進一步地轉(zhuǎn)化使得其表達L-半胱氨酸消旋酶。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一前項的方法，其中所述的細胞能夠表達另外一種具有與所述第一螢光素酶不同的Km值和不同的波長輸出的螢光素酶。
7.一種DNA構(gòu)建體，其含有(i)一個編碼螢光素酶的核酸序列，和(ii)一個編碼蟲螢光素再生蛋白的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體，其中(i)和(ii)的核酸序列被連接來表達含有螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白的融合蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的DNA構(gòu)建體，其進一步含有一個或多個其它的選自(iii)編碼其它螢光素酶的核酸序列；和(iv)編碼L-半胱氨酸消旋酶的核酸序列的元件。
10.根據(jù)權(quán)利要求7到9任一項的DNA構(gòu)建體，其含有單個的載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求7到9任一項的DNA構(gòu)建體，其含有一個以上的可被用于細胞的共轉(zhuǎn)化的載體。
12.一種用權(quán)利要求7到11任一項的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細胞，其是哺乳動物或植物的細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項的方法，權(quán)利要求7到11任一項的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求12到13任一項的細胞，其中的蟲螢光素再生蛋白是蛋白SEQ NOS 1、62或63或其蟲螢光素再生片段或所有這些中任一個的變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項的方法，權(quán)利要求7到11任一項的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求12到13任一項的細胞，其中的蟲螢光素再生蛋白是一種含有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 59或SEQ ID NO 61的蟲螢光素再生蛋白或其蟲螢光素再生片段或變體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法、DNA構(gòu)建體或細胞，其中的蟲螢光素再生蛋白是含有SEQ ID NO 59的蟲螢光素再生蛋白或其蟲螢光素再生片段或變體。
17.一種可獲自螢火蟲種的蟲螢光素再生蛋白，或其蟲螢光素再生片段，或與其具有至少60％同源性的蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求18的蟲螢光素再生蛋白，其中的螢火蟲種是夜光螢火蟲。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的蟲螢光素再生蛋白，其含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39，或SEQ ID NO 59或蟲螢光素再生片段，或所有這些的變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19任一項的蛋白，其含有SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 39或蟲螢光素再生片段，或所有這些的變體。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到19任一項的蛋白，其含有SEQ ID NO 59或蟲螢光素再生片段，或所有這些的變體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的蛋白，其含有SEQ ID NO 59。
23.一種嵌合的螢光素酶再生蛋白，其含有由在不同種的螢光素酶再生蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的外顯子所編碼的片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的嵌合螢光素酶再生蛋白，其中至少一個所述的外顯子來自螢火蟲種的基因。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的嵌合螢光素酶再生蛋白，其中至少一個所述的外顯子來自螢火蟲種的基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求23到25任一項的嵌合螢光素酶再生蛋白，其含有與夜光螢火蟲螢光素酶再生基因的外顯子2，3，4和5編碼的片段相連接的由螟螢火蟲螢光素酶再生基因的外顯子1編碼的片段。
27.一種含有螢光素酶和蟲螢光素再生蛋白的融合蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求18的融合蛋白，其中的蟲螢光素再生蛋白是權(quán)利要求17到26任一項的蛋白。
29.一種編碼權(quán)利要求17到28任一項的蛋白的核酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 4或SEQ ID NOS31到37的任一項。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 40或其變體。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的核酸，其含有SEQ ID NO 58或其變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的核酸，其是一個cDNA序列。
34.一種產(chǎn)生旋光活性酶底物諸如D-蟲螢光素的方法，其包括用任一權(quán)利要求的再生蛋白和任何其它的氨基酸諸如轉(zhuǎn)化作用所必需的半胱氨酸接觸所述底物的氧化形式，諸如氧合蟲熒光素。
全文摘要
一種測定胞內(nèi)ATP和/或基因表達的方法，該方法包括用帶有編碼熒光素酶和蟲熒光素再生蛋白質(zhì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞，導入蟲熒光素到所述細胞中，并監(jiān)控所述細胞的生物發(fā)光信號。本發(fā)明還描述了新的蟲熒光素再生蛋白質(zhì)以及這些蛋白質(zhì)在旋光活性酶底物制備中的應用。
文檔編號C07K19/00GK1613011SQ02822503
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月14日
發(fā)明者J·C·戴, D·J·斯奎雷爾, M·J·拜利, P·J·懷特 申請人:英國國防部