專利名稱：細(xì)胞凋亡顯像藥物⁶⁸Ga-NOTA-Duramycin及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測細(xì)胞凋亡的顯像藥物，特別涉及以磷脂酰乙醇胺為結(jié)合靶點的顯像藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是一種主動發(fā)生的、受基因嚴(yán)密調(diào)控的細(xì)胞逐漸死亡現(xiàn)象，在許多疾病， 如心血管疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中都具有重要的作用。細(xì)胞凋亡是心梗早期心肌細(xì)胞的主要死亡形式，也是梗死范圍擴(kuò)大的獨立預(yù)后因子；心肌細(xì)胞凋亡的持續(xù)存在和活性細(xì)胞的持續(xù)性缺失，是心衰進(jìn)行性發(fā)展的主要機制； 心肌細(xì)胞凋亡增多也是心肌炎發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病，進(jìn)而發(fā)展為心衰的重要機制之一。腫瘤的發(fā)生主要是由于細(xì)胞內(nèi)癌基因、抑癌基因及其他相關(guān)調(diào)節(jié)基因突變，從而使細(xì)胞基因組失去穩(wěn)定性。正常情況下，當(dāng)修復(fù)機制不能完成損傷修復(fù)時，細(xì)胞凋亡機制將啟動，異常細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞識別而清除。如果調(diào)節(jié)機制出現(xiàn)障礙，凋亡機制不能正常啟動，帶有不穩(wěn)定基因組的細(xì)胞發(fā)生失控性增殖，就很可能產(chǎn)生高度惡化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞。在細(xì)胞癌變過程中，許多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增強。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤的發(fā)生機制就是由于凋亡受阻引起的。在腫瘤治療方面，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前最主要的治療策略和目標(biāo)。臨床上采用的放射治療、大多數(shù)化療藥物和生物治療劑都是主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來清除腫瘤細(xì)胞的，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的基因治療也是目前重要的研究方向。因此，細(xì)胞凋亡的檢測對于心血管疾病和腫瘤的診斷和療效監(jiān)測都具有極為重要的臨床意義。分子影像技術(shù)被認(rèn)為是檢測細(xì)胞凋亡最有效的無創(chuàng)性方法。目前，國內(nèi)外研究較多的分子探針是99mTc-AnnexinV,它能與凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸(PtdS)位點特異結(jié)合。研究表明=99mTc-AnnexinV顯像能夠顯示心肌、血管、腫瘤、炎癥等組織的凋亡細(xì)胞，在急性心肌梗塞、心肌炎、心臟移植排異反應(yīng)、不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、腫瘤化療等方面有一定的應(yīng)用價值。但99mTc-AnnexinV還存在著明顯的不足,一是AnnexinV分子量較大 (36kDa)血液清除較慢，早期成像圖像質(zhì)量欠佳；二是用于單光子核素成像，分辨率受限； 三是生產(chǎn)成本高，價格昂貴。因此，該顯像劑的實際應(yīng)用受到了很大限制，目前的市場表現(xiàn)也不理想。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種更為理想的細(xì)胞凋亡顯像劑 68Ga-NOTA-Duramycin,其主要特點在于針對的結(jié)合祀點為磷脂酰乙醇胺(PtdE),其主要結(jié)構(gòu)Duramycin (耐久霉素)由19個氨基酸組成,與雙功能螯合劑1,4, 7-三氮雜環(huán)壬燒-I, 4_7_ 三乙酸(I, 4, 7-triazacyclononane-l, 4, 7-triacetic acid,NOTA) I禹合，后者提供放射性正電子核素68Ga標(biāo)記位點。與99mTc-AnnexinV 相比，68Ga-NOTA-Duramycin 具有明顯的優(yōu)勢。首先，Duramycin分子量僅為2KD，遠(yuǎn)小于AnnexinV，因此血液清除較快，放射性本底較低，可提高早期圖像質(zhì)量；第二，Duramycin的結(jié)合位點PtdE在細(xì)胞膜磷脂中占約20%,是其含量是AnnexinV 結(jié)合位點磷脂酰絲氨酸(PtdS)的3 4倍；第三,68Ga-NOTA-Duramycin用于正電子核素顯像(PET)，其分辨率明顯高于單光子核素顯像(SPECT)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下由鏈酶菌屬肉桂地菌DSM40005表達(dá)和后翻譯修飾合成Duramycin ;化學(xué)偶聯(lián)制備出NOTA-Duramycin ;采用直接標(biāo)記法,取 PH4. 2,0. IM的乙酸-乙酸鈉緩沖液150 u L加入到含50 y g NOTA-Duramycin的標(biāo)記瓶中， 20°C輕輕振蕩混勻5min，然后加入放射性活度為370 740MBq (10 20mCi)、體積為100 300 ii L的68Ga淋洗液，輕輕振蕩混勻后靜置15min，得到68Ga-NOTA-Duramycin。進(jìn)一步地,是68Ga-NOTA-Duramycin作為顯像劑用于檢測心肌缺血損傷后心肌細(xì)胞凋亡方面的應(yīng)用。進(jìn)一步地，是68Ga-NOTA-Duramycin作為顯像劑用于化療后檢測腫瘤細(xì)胞凋亡方面的應(yīng)用。


圖I68Ga-NOTA-Duramycin 高壓液相分析(HPLC)結(jié)果；圖2實驗豬缺血再灌注損傷模型PET/CT顯像可見心肌局灶性異常放射性濃聚影;圖3實驗豬心肌組織病理凋亡分析結(jié)果HE染色可見大量的核碎片、核固縮(左圖)；TUNEL染色顯示大量黃染的凋亡細(xì)胞(右圖)；圖4非小細(xì)胞肺癌裸鼠模型Micro PET顯像結(jié)果化療后24h，腫瘤部位有明顯的放射性攝取(右圖)，而未化療(對照)組腫瘤部位未見明顯的放射性攝取增高(左圖)。
具體實施例方式一 . 68Ga-NODA-Duramycin 的制備方法I. Duramycin的表達(dá)和純化鏈酶菌屬肉桂地菌DSM40005表達(dá)和后翻譯階段修飾而成帶有特殊氨基酸殘基的硫醚抗生素，修飾肉桂霉素的結(jié)構(gòu)基因(cinA)生成Duramycin。2. NOTA-Duramycin 的合成Duramycin溶解在二甲基酰胺溶液中，三乙胺溶液調(diào)整PH值至9. 0， p-SCN-Bn-NOTA加入反應(yīng)體系中，室溫下反應(yīng)2h，三氟醋酸加入后去除保護(hù)基團(tuán)。反應(yīng)結(jié)束后，NOTA-Duramycin過柱分離和純化后,經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn),凍干后備用。3.68Ga 的淋洗用5ml注射器抽取0. 05M HCl 5mL對鍺-鎵發(fā)生器進(jìn)行淋洗，淋洗流速lmL/min， 同時收集流出液，每瓶lmL，共5瓶。對每只淋洗瓶進(jìn)行活度檢測，取活度最大的一瓶用于標(biāo)記。
4.68Ga-NOTA-Duramycin 的標(biāo)記取PH4. 2,0. 2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液150 u L加入到含50 y g NOTA-Duramycin 標(biāo)記瓶中，20°C輕輕振蕩混勻5min，然后加入放射性活度為370 740MBq(10 20mCi)，體積為100 300 i! L的68Ga淋洗液，輕輕振蕩混勻后靜置15min。5.質(zhì)量控制HPLC的分析條件色譜分析柱為C18柱(4. 6 X 250mm)，流動相A為磷酸鹽緩沖液 (0. I %三氟醋酸)，流動相B為CH3CN (0. 1%三氟醋酸)。流速為lml/min，0 5min :流動相 B，10% ；30min :流動相B，90%。檢測紫外波長為220nm，柱溫20°C。放射性檢測應(yīng)用HPLC 專用放射探測器。HPLC分析結(jié)果顯示68Ga-N0TA-Duramycin的放射性出峰時間為16min (圖
I)，標(biāo)記率為92. 5 ±2. I % (n = 10)，無需進(jìn)一步純化。6.體外穩(wěn)定性測定68Ga-NOTA-Duramycin 標(biāo)記后 30min、60min 和 120min 分別用 HPLC 測定其放射化學(xué)純度。取標(biāo)記物100 yL，加入人血清400 yL，混勻后用同樣方法測定其放化純。結(jié)果顯示 68Ga-NOTA-Duramycin 標(biāo)記后 30min、60min 和 120min 的放化純分別為 93%、93% 和 92%， 加入血清后放化純分別為92. 5%、92%和92%。二 . 68Ga-NOTA-Duramycin在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布健康Balb/c小鼠12只，體重(20 ± 2) g，6 8周齡，分4組(每組3只)，尾靜脈注射68Ga-NOTA-Duramycin 100 u Ci，分別在5，15，30，60min將各組小鼠處死，取心、肝、脾、
肺、腎、胃、腸等主要臟器并稱重，用Y計數(shù)器測量其放射性。經(jīng)時間衰減校正后，計算每克組織百分注射劑量率ID/g)。68Ga-NOTA-Duramycin 在正常小鼠體內(nèi)的分布見表 I，68Ga-NOTA-Duramycin 從血液、心、肝中清除較快；腎臟放射性分布較多，注射后60min時攝取為8. 12±2. 74% ID/g，表明該顯像劑主要經(jīng)腎臟排泄。早期心臟、肝臟、肺有少量放射性攝取，但隨時間延長，放射性攝取迅速減少，注射60min后，心臟和肝臟的攝取僅為1. 05 ± 0. 31 % ID/g和0. 97 ± 0. 28 % ID/g。該顯像劑在胃、腸、脾、胰中有少量分布，腦組織攝取很少，表明該顯像劑不能透過血腦屏障。
表I正常小鼠注射68Ga-NOTA-Duramycin后不同時間點各臟器放射性攝取％ ID/g
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞凋亡顯像藥物68Ga-NOTA-Duramycin,其主要結(jié)構(gòu)是由19個氨基酸組成的Duramycin與雙功能螯合劑I，4, 7-三氮雜環(huán)壬燒-1,4-7-三乙酸(1,4, 7-triazacyclononane-l, 4, 7-triacetic acid,NOTA) f禹合，以直接標(biāo)記法進(jìn)行核素 68Ga 標(biāo)記，所述放射性藥物為無色透明液體針劑。
2.權(quán)利要求I中所述的68Ga-NOTA-Duramycin放射性藥物的制備方法,其特征在于所述方法包括以下步驟a.Duramycin溶解在二甲基酰胺溶液中，三乙胺溶液調(diào)整PH值至9. 0，p-SCN-Bn-NOTA 加入反應(yīng)體系中，室溫下反應(yīng)2h，三氟醋酸加入后去除保護(hù)基團(tuán)，反應(yīng)結(jié)束后， NOTA-Duramycin過柱分離和純化后,經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn),凍干后備用；b.用5ml注射器抽取0.05MHCl 5mL對鍺-鎵發(fā)生器進(jìn)行淋洗，淋洗流速ImL/ min,同時收集流出液，取PH4. 2，0. 2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液150 y L加入到含50 y g NOTA-Duramycin標(biāo)記瓶中，20°C輕輕振蕩混勻5min，然后加入放射性活度為370 740MBq(10 20mCi)，體積為100 300 y L的68Ga淋洗液，輕輕振蕩混勻后靜置15min ；c.HPLC的分析條件色譜分析柱為C18柱(4. 6 X 250mm)，流動相A為磷酸鹽緩沖液 (0. I %三氟醋酸)，流動相B為CH3CN (0. 1%三氟醋酸)，流速為lml/min，0 5min，流動相 B，10%，30min,流動相B，90%，檢測紫外波長為220nm，柱溫20°C。
3.68Ga-NOTA-Duramycin作為顯像劑用于檢測心肌缺血損傷后心肌細(xì)胞凋亡方面的用途。
4.68Ga-NOTA-Duramycin作為顯像劑用于化療后檢測腫瘤細(xì)胞凋亡方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凋亡顯像藥物68Ga-NOTA -Duramycin，其主要特點在于針對的結(jié)合靶點為凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰乙醇胺，其主要結(jié)構(gòu)Duramycin由19個氨基酸組成，與雙功能螯合劑1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-1，4-7-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA)耦合，以直接標(biāo)記法進(jìn)行核素68Ga標(biāo)記。所述放射性藥物為無色透明液體針劑。用于檢測心肌缺血損傷后心肌細(xì)胞凋亡和化療后腫瘤細(xì)胞凋亡。
文檔編號A61K103/00GK102614536SQ201210091388
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者華子春, 方緯, 汪蕾, 王峰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院, 南京市第一醫(yī)院