專利名稱:產(chǎn)生l－谷氨酰胺的微生物和使用該微生物產(chǎn)生l－谷氨酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-谷氨酰胺的新微生物及使用該微生物產(chǎn)生L-谷氨酰胺的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及抗疊氮化鈉的乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)CJJA21(KCCM-10222)和抗D，L-α-氨基正丁酸(α-ABA)的乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)CJJA22(KCCM-10223)，兩者都能夠以高于已知菌株的產(chǎn)率產(chǎn)生L-谷氨酰胺；本發(fā)明還涉及用該微生物產(chǎn)生L-谷氨酰胺的方法。
背景技術(shù)：
L-谷氨酰胺是一種廣泛用作藥物，例如腸胃疾病的治療劑，肝臟和腦功能的增強(qiáng)劑，免疫增強(qiáng)劑，以及胃潰瘍和酒精中毒的治療劑等，化妝品如增濕劑等，以及健康食品如運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物和病人的營(yíng)養(yǎng)物等的氨基酸。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，L-谷氨酰胺獲自磺胺胍抗性菌株(日本專利延遲公開號(hào)Sho53-17675)中，重氮絲氨酸抗性菌株(日本專利延遲公開號(hào)Sho55-148094)，氨芐青霉素敏感菌株(日本專利延遲公開號(hào)Hei04-088994)，酪氨酸-谷氨酸(tyr-glu)抗性菌株(日本專利延遲公開號(hào)Hei02-186994)等。
發(fā)明公開本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究以發(fā)展新型的能夠高產(chǎn)地產(chǎn)生L-谷氨酰胺的菌株。我們預(yù)期抗疊氮鈉(一種呼吸抑制劑)或者抗α-氨基丁酸(異亮氨酸的類似物)的菌株將具有增加的L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力。因此我們從原始菌株乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680(韓國(guó)專利公開文本91-7818)中篩選疊氮鈉或者α-氨基丁酸抗性的菌株。結(jié)果，我們鑒定出疊氮鈉或者α-氨基丁酸抗性菌株要比已知菌株具有更高的L-谷氨酰胺產(chǎn)率，因而完成本發(fā)明。
本發(fā)明提供產(chǎn)生L-谷氨酰胺的微生物和使用該微生物產(chǎn)生L-谷氨酰胺的方法。根據(jù)本發(fā)明的微生物為具有疊氮鈉抗性的乳發(fā)酵短桿菌CJJA21(KCCM-10222)和具有α-氨基丁酸抗性的乳發(fā)酵短桿菌CJJA22(KCCM-10223)，這兩者均產(chǎn)生高產(chǎn)量的L-谷氨酰胺。此外，本發(fā)明產(chǎn)生L-谷氨酰胺的方法的特征在于活化乳發(fā)酵短桿菌CJJA21或者乳發(fā)酵短桿菌CJJA22，然后培養(yǎng)該活化菌株。
本發(fā)明通過以下方法誘導(dǎo)突變體。乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680用傳統(tǒng)誘變劑N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理，然后鋪于含有500mg/l疊氮鈉的基本培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)中，由此獲得具有500mg/l疊氮鈉抗性的菌株。
更加具體的說，乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680，先在活化培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2)中培養(yǎng)16小時(shí)活化，再在已121℃滅菌15分鐘的種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)基3)中培養(yǎng)14個(gè)小時(shí)。然后，將5ml的培養(yǎng)基用100mM的檸檬酸鹽緩沖液洗滌，加入NTG至最終濃度為200mg/l。在20分鐘之后，培養(yǎng)基用100mM的磷酸鹽緩沖液洗滌。用NTG處理的菌株鋪在基本培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)中并測(cè)量死亡率。結(jié)果，死亡率為85％。
為了獲得疊氮鈉抗性的突變體，將NTG處理的菌株鋪在含有終濃度為500mg/l的疊氮鈉的基本培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)中，然后在30℃培養(yǎng)6天獲得疊氮鈉抗性的菌株。獲得的抗性突變體在含有谷氨酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基4)的搖瓶中培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)，選擇產(chǎn)生L-谷氨酰胺的產(chǎn)率比原始菌株乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680高10％甚至更高的疊氮鈉抗性菌株。獲得的菌株命名為CJJA21。乳發(fā)酵短桿菌CJJA21按照布達(dá)佩斯條約于2000年10月20日保藏在韓國(guó)微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)，地址為Hongie-dong，Seodaemun-gu，Seoul，保藏號(hào)為KCCM-10222。
此外，乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680基本上按上述方式活化和培養(yǎng)。隨后基本上按上述方式用NTG處理。為了獲得α-氨基丁酸抗性突變體，NTG處理的菌株鋪在α-氨基丁酸終濃度為15g/l的基本培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)上，在30℃培養(yǎng)6天獲得α-氨基丁酸抗性菌株。獲得的抗性突變體在含有谷氨酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基4)的搖瓶中培養(yǎng)72小時(shí)，選擇產(chǎn)生L-谷氨酰胺的產(chǎn)率比原始菌株乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680高10％甚至更高的疊氮鈉抗性菌株。獲得的菌株命名為CJJA22。乳發(fā)酵短桿菌CJJA22按照布達(dá)佩斯條約于2000年10月20日保藏在韓國(guó)微生物保藏中心，地址為Hongie-dong，Seodaemun-gu，Seoul，保藏號(hào)為KCCM-10223。
本發(fā)明使用的培養(yǎng)基含有以下成分培養(yǎng)基1基本培養(yǎng)基葡萄糖1.0％，硫酸銨((NH4)2SO4)0.4％，硫酸鎂(MgSO4.7H2O)0.04％，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1％，尿素0.1％，硫胺素.HCl 0.0001％，生物素200μg/l，瓊脂，pH7.0。
培養(yǎng)基2活化培養(yǎng)基牛肉膏1％，聚胨1％，氯化鈉(NaCl)0.5％，酵母提取物0.5％，瓊脂2％，瓊脂2％，pH7.2培養(yǎng)基3種子培養(yǎng)基葡萄糖5.0％，Bactopeptone 1％，氯化鈉(NaCl)0.25％，酵母提取物1％，生物素3μg/l，尿素0.4％，pH7.0培養(yǎng)基4谷氨酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基葡萄糖4.0％，氯化銨(NH4Cl)3.0％，豆蛋白酸水解產(chǎn)物0.3％，碳酸鈣(CaCO3)5％，氯化鈣(CaCl2)0.1％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.05％，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.15％，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.15％，尿素0.3％，硫胺素·HCl 2mg/l，生物素5ug/l，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)20mg/L，硫酸錳(MnSO4·H2O)20mg/L，硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)12mg/l，pH6.8。
乳發(fā)酵短桿菌CJJA21的疊氮鈉抗性見下表1-1所示。
表1-1


+生長(zhǎng)，-不生長(zhǎng)，在30℃培養(yǎng)6天乳發(fā)酵短桿菌CJJA22的α-氨基丁酸抗性見下表1-2所示。
表1-2


+生長(zhǎng)，-不生長(zhǎng)，在30℃培養(yǎng)6天實(shí)施本發(fā)明的最好方式從以下實(shí)施例可以得到更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解，這里描述的具體材料和結(jié)果僅僅是舉例說明、而不是企圖限制、也不應(yīng)限制在權(quán)利要求
書中詳細(xì)說明的本發(fā)明。
實(shí)施例1菌株乳發(fā)酵短桿菌CJJA21發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖4.0％，氯化銨(NH4Cl)3.0％，豆蛋白酸水解產(chǎn)物0.3％，碳酸鈣(CaCO3)5％，氯化鈣(CaCl2)0.1％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.05％，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.15％，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.15％，尿素0.3％，硫胺素·HCl 2mg/l，生物素5ug/l，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)20mg/L，硫酸錳(MnSO4·H2O)20mg/L，硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)12mg/l，pH6.8(和培養(yǎng)基4相同)發(fā)酵步驟和結(jié)果向250ml的搖瓶中加入20ml發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在121℃滅菌15分鐘。接種一個(gè)接種環(huán)的通過在活化培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2)中30℃培養(yǎng)16小時(shí)活化的菌株，然后在30℃搖菌48小時(shí)。發(fā)酵肉湯的成分如下。
表2


實(shí)施例2菌株乳發(fā)酵短桿菌CJJA21發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10％，氯化銨(NH4Cl)4.5％，豆蛋白酸水解產(chǎn)物0.5％，碳酸鈣(CaCO3)5％，氯化鈣(CaCl2)0.1％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.05％，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.15％，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.15％，尿素0.3％，硫胺素·HCl 2mg/l，生物素5ug/l，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)20mg/L，硫酸錳(MnSO4·H2O)20mg/L，硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)12mg/l，pH6.8發(fā)酵步驟和結(jié)果向250ml的搖瓶加入20ml發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在121℃滅菌15分鐘。接種一個(gè)接種環(huán)的通過在活化培養(yǎng)基(培養(yǎng)基2)中30℃培養(yǎng)16小時(shí)活化的菌株，然后在30℃搖菌72小時(shí)。發(fā)酵肉湯的成分如下。
表3


如表3所示，本發(fā)明乳發(fā)酵短桿菌CJJA21產(chǎn)生L-谷氨酰胺的產(chǎn)率要比原始菌株乳發(fā)酵短桿菌KFCC-10680的高出10％或者更高。
實(shí)施例3
乳發(fā)酵短桿菌CJJA22根據(jù)基本上與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵肉湯的成分如下表4


實(shí)施例4乳發(fā)酵短桿菌CJJA22根據(jù)基本上與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵肉湯的成分如下表5


工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，L-谷氨酰胺可以以高于現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)率獲得。獲得的L-谷氨酰胺可用作藥物，例如腸胃疾病的治療劑，肝臟和腦功能的增強(qiáng)劑，免疫增強(qiáng)劑，胃潰瘍和酒精中毒的治療劑等；化妝品如增濕劑等；和健康食品如運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物和病人的營(yíng)養(yǎng)物等。
權(quán)利要求
1.乳發(fā)酵短桿菌CJJA21，其特征在于具有疊氮鈉抗性并產(chǎn)生L-谷氨酰胺(保藏號(hào)KCCM-10222)。
2.乳發(fā)酵短桿菌CJJA22，其特征在于具有α-氨基丁酸抗性并產(chǎn)生L-谷氨酰胺(保藏號(hào)KCCM-10223)。
3.產(chǎn)生L-谷氨酰胺的方法，其特征在于活化權(quán)利要求
1的乳發(fā)酵短桿菌CJJA21或者權(quán)利要求
2的乳發(fā)酵短桿菌CJJA22，然后培養(yǎng)該活化菌株。
專利摘要
本發(fā)明公開了新型微生物具有疊氮鈉抗性的乳發(fā)酵短桿菌CJJA21(保藏號(hào)KCCM－10222)以及具有α－氨基丁酸抗性的乳發(fā)酵短桿菌CJJA22(保藏號(hào)KCCM－10223)，這兩種菌株產(chǎn)生L－谷氨酰胺的產(chǎn)率都要比已知菌株高。還公開了使用該微生物生產(chǎn)L－谷氨酰胺的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GKCN1395615SQ01803831
公開日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年11月15日
發(fā)明者樸晟植, 徐承鉉, 李根喆, 李東雨, 金天柱, 鄭相哲 申請(qǐng)人:第一制糖株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan