本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測，具體涉及一種肺炎支原體核酸檢測用引物探針組、試劑盒及其在免提取直接檢測肺炎支原體方法中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體（mycoplasma?pneumoniae，mp）引起的間質(zhì)病變?yōu)橹鞯臉O性肺部感染，有時并發(fā)支氣管肺炎，稱為原發(fā)性非典型性肺炎。主要經(jīng)飛沫傳播，一年四季均可發(fā)生，一般認(rèn)為北方地區(qū)寒冷時節(jié)mp感染較高，而南方地區(qū)則是夏秋季節(jié)高發(fā)，且以兒童和青少年最多見。感染既可發(fā)生在上、下呼吸道及肺臟，也可以累及肺外系統(tǒng)。早期出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸異常、咳嗽、頭痛、咽痛等非特異性癥狀，診斷難度較大，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致多臟器功能損傷，威脅患兒生命安全。肺炎支原體屬于柔膜體綱、支原體科、支原體屬，是一種目前發(fā)現(xiàn)的有能力在體外不依靠活細(xì)胞生存、能夠進行自我復(fù)制的原核生物。肺炎支原體長1～2μm，寬0.1～0.2μm，因體積小，可透過細(xì)菌濾器。其基因組為環(huán)狀雙股dna，相對分子質(zhì)量為5×108，基因組全長816394bp。目前實驗室主要診斷方法有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、核酸擴增技術(shù)等。

2、肺炎支原體是兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎主要病原體，其感染率在兒科有逐年增高的趨勢。2013年，世界衛(wèi)生組織（world?health?organization，who）公布了全球十大致死性疾病，肺炎位列其中，每年約有350萬人死于肺炎。在地方性周期流行中社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎流行時，肺炎支原體引發(fā)的肺炎占4%～8%。在大流行期間，肺炎支原體引發(fā)的社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎在一般人群中占20%～40%，在人群密集第可達(dá)70%。因此，掌握肺炎支原體流行病學(xué)的特征對于預(yù)防及臨床診斷具有重要意義。

3、目前的肺炎支原體核酸檢測方法，均是針對肺炎支原體（mp）菌株的細(xì)胞粘附蛋白（p1）基因而設(shè)計引物探針組。p1?基因全長9673bp，包括若干單拷貝區(qū)域和若干多拷貝區(qū)域，針對不同拷貝區(qū)域設(shè)計的引物探針組，其擴增效率和檢出效率都會收到影響，從而影響檢測結(jié)果的靈敏度和覆蓋度。例如：

4、中國專利cn114107529a公開的一種肺炎支原體核酸檢測試劑盒，該試劑盒包括肺炎支原體p1基因的特異性引物和探針組合物、人源性內(nèi)參基因的引物和探針組合物，通過雙重實時熒光pcr反應(yīng)，極大程度地保證了檢測結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，并對肺炎支原體i型和ii型均可檢出，檢測覆蓋度廣，同時，基于人源性內(nèi)參基因有效擴增的前提下，還可有效避免假陰性結(jié)果，既保證了檢測的特異性，也保證了檢測的準(zhǔn)確性。但通過將引物在ncbi中進行blast分析可知，該引物探針組是針對p1基因的單拷貝區(qū)域而設(shè)計，對于低濃度的檢測樣本，其靈敏度還有待提高。

5、中國專利cn109735640a公開的一種肺炎支原體快速檢測引物組、試劑盒，包括檢測肺炎支原體基因組p1基因序列的上、下游引物和探針，通過將引物在ncbi中進行blast分析可知，該引物組雖然是針對p1基因的多拷貝區(qū)域而設(shè)計，但選擇的多拷貝基因存在突變，會影響引物組的擴增效率，同時也影響覆蓋度，因此，在該專利中，記載了將fam及bhq1標(biāo)記在序列內(nèi)部，若樣本靶序列存在突變，可以保證熒光探針與靶序列的退火及熒光信號的產(chǎn)生及釋放，增加檢測的靈敏度和特異性，同時，該專利也并未記載是否能夠?qū)Ψ窝字гwi型和ii型均可檢出，檢測覆蓋廣度還有待驗證。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種肺炎支原體核酸檢測用引物探針組，是針對肺炎支原體的p1基因設(shè)計的特異性的引物探針組，能夠高效特異的檢測出肺炎支原體ⅰ型和ⅱ型。同時，本發(fā)明還提供了含有該特異性的引物探針組的試劑盒，以及該引物探針組和試劑盒在免提取直接檢測肺炎支原體方法中的應(yīng)用，采用熒光定量pcr檢查方法，無需進行核酸提取即可直接進行pcr檢測，在降低檢測成本、簡化試驗操作、縮短檢測時間的同時保證高度特異性、準(zhǔn)確度，并提高了靈敏度，可用于人口咽拭子中肺炎支原體核酸檢測。

2、本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種肺炎支原體核酸檢測用引物探針組，所述引物探針組設(shè)計在肺炎支原體p1基因的多拷貝區(qū)域，包括如seq?id?no：1所示的上游引物mp-f、如seq?id?no：2所示的下游引物mp-r以及如seq?id?no：3所示的探針mp-p。

4、本發(fā)明的引物探針組用于直接檢測肺炎支原體p1基因，其序列信息具體為：

5、mp-f：tctttacgcgttacgtattc；

6、mp-r：agtgtggaattctctggca；

7、mp-p：ttcactggtataaccggtttgttaag。

8、還包括內(nèi)標(biāo)引物探針組qs，內(nèi)標(biāo)引物探針組qs包括如seq?id?no：4所示的上游引物iac-f、如seq?id?no：5所示的下游引物iac-r以及如seq?id?no：6所示的探針iac-p。

9、本發(fā)明的內(nèi)標(biāo)引物探針組qs用于監(jiān)測整個pcr擴增反應(yīng)，其序列信息具體為：

10、iac-f：acttcccttgcctacattgtt；

11、iac-r：tgatgcggttatgagtacga；

12、iac-p：ccatcgaccagaggctgttcacc。

13、本發(fā)明中，內(nèi)標(biāo)引物探針是檢測qs基因，該基因與人基因組及呼吸道病原體基因均無相關(guān)性，通過對這個基因的檢測來驗證整個擴增系統(tǒng)是否正常。如果該檢測結(jié)果呈陰性說明擴增過程存在問題，即肺炎支原體檢測結(jié)果為陰性也可能是假陰性結(jié)果。

14、作為可選的方式，在上述引物探針組中，探針的5’端標(biāo)記有熒光基團，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團，針對不同靶基因的探針分別標(biāo)記有不同的熒光基團。方便檢測中采用不同的熒光通道進行檢測。進一步的，該熒光基團可選自fam、vic；淬滅基團選自bhq1，且基團的激發(fā)和發(fā)射波段相對分開可以在一個體系內(nèi)進行分別檢測。

15、作為可選的方式，本發(fā)明的探針mg-p用fam標(biāo)記，探針iac-p用vic標(biāo)記。

16、一種肺炎支原體核酸檢測用試劑盒，包括上述的用于直接檢測肺炎支原體p1基因的引物探針組以及用于監(jiān)測整個pcr擴增反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)引物探針組qs。

17、該試劑盒還包括用于pcr擴增檢測的pcr?mix，其包含基因改造的抗體法熱啟動taq酶（d-taq?dna?聚合酶）、udg酶、dntp（脫氧核糖核苷三磷酸）、鎂離子、氯化鈉和tris（三羥甲基氨基甲烷）。

18、進一步的，試劑盒中還包括陰性對照和陽性對照。

19、作為可選的方式，陰性對照為含有內(nèi)標(biāo)qs基因片段的假病毒，該假病毒不包括肺炎支原體和其他呼吸道感染病原、人類基因組序列或相似序列，可用于獨立對每個擴增反應(yīng)進行質(zhì)控，質(zhì)控試劑盒本身及實驗操作是否正常，用以排除因試劑盒失效或個別樣本采樣及操作失誤導(dǎo)致的假陰性。

20、作為可選的方式，陽性對照為含有肺炎支原體檢測基因片段的假病毒。

21、如上述的引物探針組或試劑盒在免提取直接檢測肺炎支原體方法中的應(yīng)用，以人口咽拭子作為檢測樣本，該檢測樣本無需進行核酸提取純化，即可采用熒光定量pcr檢測方法對檢測樣本中的肺炎支原體核酸濃度進行檢測。

22、本發(fā)明所指熒光定量pcr（flurogenic?quantitative?polymerasechainreaction，fq-pcr）檢測方法又稱為實時定量pcr（real-time?quantitative?pcr,rt-qpcr）或定量pcr（qpcr），是由美國applied?biosystems公司推出的一種定量試驗技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，標(biāo)記跟蹤pcr產(chǎn)物進行實時監(jiān)測反應(yīng)，獲得擴增曲線，利用與之相適應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品核酸模板的初始濃度。

23、可以按如下步驟依據(jù)熒光定量pcr擴增曲線獲得ct（cycle-threshold）值：

24、a.?擴增曲線特征的描述：擴增曲線一般呈s型，可分為基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。

25、b.?基線（baseline）設(shè)定：根據(jù)實驗情況，選擇熒光本底值較穩(wěn)定的一段區(qū)域作為基線的設(shè)定范圍。建議基線選取5～22個循環(huán)。

26、c.?閾值（threshold）設(shè)定：δrn（校正后報告熒光強度）的一個值，由軟件自動確定或手動設(shè)置，用于在實驗分析中確定ct值。閾值設(shè)置應(yīng)高于基線，且控制在擴增曲線的指數(shù)增長階段范圍內(nèi)，一般以超過陰性對照品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。

27、d.?ct值（cycle-threshold）：閾值線與擴增曲線的交叉點確定ct值。

28、作為可選的方式，上述的免提取直接檢測肺炎支原體方法具體包括以下步驟：

29、（1）樣本處理；

30、（2）試劑配制；

31、（3）加樣；

32、（4）pcr?擴增；

33、（5）結(jié)果分析。

34、作為可選的方式，步驟（1）具體為：將拭子樣本中加入1ml生理鹽水（無酶無菌水），靜置5min使拭子頭充分浸潤，渦旋震蕩2min使拭子上的病原體和細(xì)胞充分脫落至液體中，瞬時離心后作為待測樣本。若樣本處理后不立即檢測，可存于-70℃?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

35、作為可選的方式，步驟（2）具體為：將試劑盒中的引物探針組混合液室溫解凍后振蕩混勻，并短暫離心后備用；取核酸擴增反應(yīng)液室溫解凍后震蕩混勻，并短暫離心后備用；根據(jù)所檢測的樣本數(shù)量按照下表1配制反應(yīng)液，每次檢測均設(shè)置陰性對照和陽性對照，待檢樣本數(shù)為n時，需配制反應(yīng)體系數(shù)n=待檢樣本數(shù)（n）+陽性對照（1）+陰性對照（1）+1。

36、表1?反應(yīng)體系配制表

37、；

38、將配制好的擴增反應(yīng)體系混勻后，按20?μl/反應(yīng)分裝到pcr反應(yīng)管中，備用。

39、作為可選的方式，步驟（3）具體為：向分裝好的體系中分別加入5?μl陰性對照、待檢樣本和陽性對照，總反應(yīng)體積為25?μl。蓋緊pcr反應(yīng)管管蓋，瞬時低速離心后備用。

40、作為可選的方式，步驟（4）具體為：將pcr管按順序放入實時熒光定量pcr儀樣品槽中，并依次設(shè)置待檢樣本、陰性對照、陽性對照等樣品類型，同時設(shè)置樣本名稱。選擇對應(yīng)的熒光通道檢測目標(biāo)基因。

41、作為可選的方式，步驟（5）具體為：反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，對檢測靶標(biāo)以及內(nèi)標(biāo)的擴增曲線分別進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值、end?值以及threshold值?(以abi?7500為例，用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，start值可以在3～15、end值可設(shè)在5～20，確保所有擴增曲線的基線區(qū)部分平直；各種熒光通道的閾值線高度均設(shè)置為△rn=6000?)，點擊analyze進行分析，然后到plate窗口下記錄定性結(jié)果。

42、作為可選的方式，上述方法中還可以進一步包括步驟（6）質(zhì)量控制：根據(jù)各熒光通道檢測結(jié)果對應(yīng)的ct值和擴增曲線形態(tài)，判斷實驗有效性。

43、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果：

44、（1）本發(fā)明提出的用于檢測肺炎支原體p1基因的引物探針組，選在基因保守區(qū)域，不存在基因突變問題，能夠提高引物擴增效率，檢測覆蓋廣，既能檢測肺炎支原體ⅰ型又能檢測ⅱ型，同時該引物探針組盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成，且能夠避免與其他病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。

45、（2）本發(fā)明的引物探針組同時選在肺炎支原體p1基因的多拷貝區(qū)域，能夠提高檢測靈敏度，實現(xiàn)低濃度樣本的準(zhǔn)確檢測。

46、（3）現(xiàn)有pcr檢測方法均需要對臨床樣本進行了核酸提取，本方法對此進行了改進，不需要提取直接進行pcr擴增檢測降，低檢測成本、縮短試驗時間、簡化操作步驟，保證特異性和準(zhǔn)確度的同時提高靈敏度。

47、（4）本發(fā)明可采用人口咽拭子作為檢測樣本，不經(jīng)過核酸提取即可直接進行pcr擴增檢測，可實現(xiàn)人口咽拭子中肺炎支原體核酸濃度的直接檢測。