本發(fā)明涉及微生物檢測，具體涉及一種基于數(shù)字lamp-crispr/cas12b定量檢測肺炎克雷伯菌的技術(shù)及其相應(yīng)的檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、肺炎克雷伯菌（klebsiella?pneumoniae）屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性條件致病菌，是醫(yī)院獲得性感染中能夠引起急性呼吸道感染甚至肺炎的最常見細(xì)菌病原體之一。2009年至2019年，中國發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌是急性呼吸道感染患者的三大主要細(xì)菌病原體之一，是細(xì)菌性肺炎的重要病因。根據(jù)carss的數(shù)據(jù)，近10年來，全球肺炎克雷伯菌在臨床分離中的比例從約15%上升至約20%，其相關(guān)感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。

2、在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域中，病原體相關(guān)核酸的絕對定量愈發(fā)凸顯其關(guān)鍵性，量化目標(biāo)核酸對于確定疾病嚴(yán)重程度和評估治療效果非常重要。首先，準(zhǔn)確定量肺炎克雷伯菌的載量有助于確定疾病嚴(yán)重程度。其次，感染過程中肺炎克雷伯菌載量的動態(tài)變化與治療效果密切相關(guān)。因此，精確定量肺炎克雷伯菌有助于臨床診斷以及治療。

3、傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測方法速度慢，操作復(fù)雜，靈敏度低，周轉(zhuǎn)時間長。對于細(xì)菌感染的住院患者，不適當(dāng)?shù)某跏伎刮⑸镏委煄缀跏?0天死亡率風(fēng)險增加一倍。然而，臨床廣泛使用的實時熒光pcr（qpcr）方法需要精確的熱循環(huán)，容易受到抑制物影響，并且當(dāng)目標(biāo)病原體的濃度很低時，qpcr的準(zhǔn)確性較差。目前臨床檢測手段無法滿足要求。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、定量的痰液樣品中肺炎克雷伯菌檢測方法，將有助于對肺炎克雷伯菌的呼吸道感染進(jìn)行早期篩查、診斷和治療，控制肺炎克雷伯菌的傳播。

4、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated?isothermal?amplification，lamp）技術(shù)利用高置換鏈活性的dna聚合酶在恒溫條件下高效特異地擴(kuò)增靶dna，具有快速、低成本的優(yōu)勢。但lamp技術(shù)容易發(fā)生引物交叉反應(yīng)引起的假陽性結(jié)果，特異性較低。

5、crispr（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats）檢測技術(shù)是利用cas蛋白反式切割活性，通過向?qū)na（grna）引導(dǎo)與靶標(biāo)結(jié)合并切割探針發(fā)出熒光，實現(xiàn)快速靈敏檢測。近年來，基于crispr/cas的生物傳感技術(shù)已被用于核酸檢測。crispr/cas12b比crispr系統(tǒng)中的其他家族成員更具熱穩(wěn)定性，可被lamp擴(kuò)增產(chǎn)物激活，從而通過非特異性切割報告分子dna產(chǎn)生熒光信號，因此，可以彌補(bǔ)lamp出現(xiàn)假陽性信號的缺點。但盡管具有出色的靈敏度，特異性和便捷性，它仍然無法對核酸進(jìn)行絕對定量。

6、數(shù)字核酸分析技術(shù)將核酸檢測試劑劃分成大量的單個分區(qū)，這種區(qū)隔化使核酸擴(kuò)增分析具有量化目標(biāo)核酸的絕對數(shù)量的優(yōu)勢，已被證明可以提高病原體檢測的靈敏度和定量準(zhǔn)確性。與數(shù)字核酸分析技術(shù)結(jié)合，可以使crispr/cas系統(tǒng)擁有絕對定量的潛力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點與不足，能夠?qū)崿F(xiàn)對痰液樣本中肺炎克雷伯菌的絕對定量，提升肺炎克雷伯菌感染早期篩查精準(zhǔn)度。利用數(shù)字lamp-crispr/cas12b方法對現(xiàn)有肺炎克雷伯菌檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)而實現(xiàn)肺炎克雷伯菌的靈敏定性和絕對定量，提升肺炎克雷伯菌感染早期篩查精準(zhǔn)度?。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一組用于檢測肺炎克雷伯菌的核酸分子，以及包含上述核酸分子的試劑盒。本發(fā)明還提供基于lamp-crispr/cas12b與數(shù)字芯片技術(shù)定量檢測肺炎克雷伯菌的方法。

3、所述核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌檢測的lamp引物組以及grna和ssdna報告分子；

4、所述lamp引物組包含核苷酸序列如seq?id?no.1-6所示的引物；

5、所述grna靶向肺炎克雷伯菌khe基因的dna片段，?dna片段為采用所述lamp引物組擴(kuò)增得到，其核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

6、所述ssdna報告分子，其核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

7、所述的核酸分子制備的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，，所述試劑盒包含所述的用于肺炎克雷伯菌檢測的0.5%鹽酸溴己新溶液，warmstart??lamp預(yù)混液，lamp引物組，cas12b，grna，ssdna報告分子，rnase抑制劑，mg?2+，depc水和數(shù)字芯片。

8、所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的數(shù)字芯片為固相分隔芯片，將配置好的lamp-cas12b反應(yīng)體系加入到刮片的加樣孔上；將反應(yīng)體系從刮片載入到芯片的每個單元中的固相；接著在體系上覆蓋一層油相，使每個單元中的反應(yīng)體系被固相芯片和油相分隔，以形成的數(shù)字陣列；將芯片置于60?℃的水浴中孵育1小時，用生物芯片分析儀檢測15000個分區(qū)的終點熒光并根據(jù)分區(qū)的熒光分布確定閾值，并根據(jù)閾值計算陽性分區(qū)百分比和輸入核酸濃度。

9、所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，其特征在于，所述數(shù)字芯片為固相分隔芯片，微流控液滴芯片及其他可實現(xiàn)數(shù)字化分隔的芯片中的一種或多種。

10、所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，其特征在于，?將用于肺炎克雷伯菌檢測的0.5%鹽酸溴己新溶液，1×warmstart??lamp預(yù)混液，1×lamp引物，250nm?cas12b，250nm?grna，3μm?ssdna報告分子，1000u/ml?rnase抑制劑，4mm?mg?2+和depc水與待測樣品混合，形成反應(yīng)體系，之后于恒溫條件下進(jìn)行l(wèi)amp-crispr/cas12b反應(yīng)。

11、所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)的體系中，核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的引物的濃度為1?μm?,核苷酸序列如seq?id?no.5和6所示的引物的濃度為0.1?μm?,核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物的濃度為0.2?μm，核苷酸序列如seq?id?no.7所示的grna的濃度為250?nm，?核苷酸序列如seq?id?no.8所示的ssdna的濃度為3?μm。

12、所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數(shù)字lamp-crispr/cas12b試劑盒，其特征在于，所述恒溫條件為60℃下孵育60?min。

13、第一方面，本發(fā)明提供用于肺炎克雷伯菌檢測的lamp引物組序列，所述序列如seqid?no.1-6所示。

14、上述lamp引物組中各引物的核苷酸序列具體如下(5’-3’)：

15、上游外部引物khe-f3(seq?id?no?.1)：

16、acggctatctctggaagct

17、下游外部引物khe-b3(seq?id?no?.2)：

18、gtgtggaccgaagaactgc

19、上游內(nèi)部引物khe-fip(seq?id?no?.3)：

20、gacgaacttcctgctcggtgtt-tgggttttcccgctggta

21、下游內(nèi)部引物khe-bip(seq?id?no?.4)：

22、ggccaacaagaagtacaaccgc-gtcaacccaacgatcctgg

23、上游環(huán)引物khe-lf(seq?id?no?.5)：

24、gagaaaggtgtggcagatgc

25、下游環(huán)引物khe-lb(seq?id?no?.6)：

26、atttattacccgctcaatcccg

27、以上所述的肺炎克雷伯菌檢測的lamp引物組適用于數(shù)字lamp-crispr/cas12b技術(shù)。

28、第二方面，本發(fā)明提供一組用于肺炎克雷伯菌檢測的核酸分子，所述核酸分子包含以上所述的用于肺炎克雷伯菌檢測的lamp引物組以及grna和ssdna報告分子。所述grna和ssdna報告分子的序列如seq?id?no.7-8所示；

29、grna(seq?id?no?.7)：

30、gtctagaggacagaatttttcaacgggtgtgccaatggccactttccaggtggcaaagcccgttgagcttctcaaatctgagaagtggcaccatagccgggattgagcgggtaa

31、ssdna(seq?id?no?.8)：

32、fam-ttattattat-bhq1

33、其中，所述grna靶向肺炎克雷伯菌khe基因的dna片段，所述dna片段為采用所述lamp引物組擴(kuò)增得到；

34、優(yōu)選地，所述grna的核苷酸序列如seq?id?no?.7所示。該grna能夠高效引導(dǎo)crispr/cas蛋白識別目標(biāo)序列，有利于提高crispr反應(yīng)的切割效率，進(jìn)而提高檢測的特異性和靈敏度。

35、第三方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含以下所述的反應(yīng)體系：10μl?1×warmstart??lamp預(yù)混液，1×lamp引物(包含1μm?seq?id?no.3和4?,0.1μm?seq?id?no.5和6?,0.2μm?seq?id?no?.1和2)，500?nm?cas12b，250?nm?grna，3μm?ssdna報告基因，1000?u/ml?rnase抑制劑，4?mm?mg?2+，1μm??0.5%鹽酸溴己新溶液，depc水和數(shù)字芯片；

36、第四方面，本發(fā)明提供以上所述的lamp引物組、用于肺炎克雷伯菌檢測的核酸分子或試劑盒在肺炎克雷伯菌檢測中的應(yīng)用。

37、優(yōu)選地，所述肺炎克雷伯菌檢測為精準(zhǔn)定量的應(yīng)用。

38、第五方面，本發(fā)明提供一種基于數(shù)字lamp-crispr/cas12b技術(shù)檢測肺炎克雷伯菌的非診斷目的的方法，所述方法利用以上所述的試劑盒進(jìn)行檢測，包括：將用于肺炎克雷伯菌檢測的0.5%鹽酸溴己新溶液1×warmstart??lamp預(yù)混液，1×lamp引物，250nm?cas12b，250nm?grna，3μm?ssdna報告基因，1000u/ml?rnase抑制劑，4mm?mg?2+和depc水與待測樣品混合，形成反應(yīng)體系，之后于恒溫條件下進(jìn)行l(wèi)amp-crispr/cas12b反應(yīng)。

39、所述試劑盒的數(shù)字芯片為固相分隔芯片，微流控液滴芯片及其他可實現(xiàn)數(shù)字化分隔的芯片中的一種或多種；優(yōu)選的，所述芯片為固相分隔芯片。

40、所述固相分隔芯片的數(shù)字化分隔和檢測原理如圖1所示，將配置好的lamp-cas12b反應(yīng)體系加入到刮片的加樣孔上；將反應(yīng)體系從刮片載入到芯片的每個單元中的固相；接著在體系上覆蓋一層油相，使每個單元中的反應(yīng)體系被固相芯片和油相分隔，以形成的數(shù)字陣列。將芯片置于60?℃的水浴中孵育1小時，用生物芯片分析儀檢測約15000個分區(qū)的終點熒光并根據(jù)分區(qū)的熒光分布確定閾值，并根據(jù)閾值計算陽性分區(qū)百分比和輸入核酸濃度。

41、相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)勢：

42、（1）cas12b的特異性結(jié)合減少了傳統(tǒng)lamp中引物二聚體和虛假擴(kuò)增產(chǎn)物的假陽性信號，對擴(kuò)增產(chǎn)物的二次識別。數(shù)字lamp-crispr/cas12b在測試中可以將肺炎克雷伯菌與綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌以及肺炎支原體的7種呼吸道感染常見病原體區(qū)分。具有高特異性。

43、（2）固相分隔芯片擁有絕對定量的性能，對肺炎克雷伯菌dna的定量范圍能夠達(dá)到5至50000拷貝/μl（r2≈0.93）。

44、（3）痰液中的酸性糖蛋白為bst聚合酶的抑制因子，本方法使用0.5%鹽酸溴己新溶液酸性糖蛋白進(jìn)行去除，減少了抑制因子對核酸濃度的負(fù)面影響，使數(shù)字lamp-crispr/cas12b方法對于免核酸提取的熱裂解樣本的檢測靈敏度增加。

45、（4）數(shù)字lamp-crispr/cas12b方法相較于臨床常用的分離培養(yǎng)法以及qpcr，對痰液樣本的定量和定性檢測性能更好。本方法與分離培養(yǎng)結(jié)果相比，靈敏度為100%，而qpcr與分離培養(yǎng)法相比，靈敏度為96%。

46、（5）cas12b的活性及非專屬性切割效應(yīng)容易受dna濃度的影響，我們將其與數(shù)字芯片進(jìn)行結(jié)合，每個單元的dna數(shù)量被認(rèn)為是0或1個，檢測方式為在每個單元進(jìn)行獨立反應(yīng)，然后根據(jù)陰性和陽性單元的總體數(shù)量計算原始濃度，因此理論上數(shù)字芯片檢測的穩(wěn)定性在一定范圍內(nèi)不受dna濃度影響。

47、（6）本發(fā)明基于數(shù)字lamp-crispr/cas12b定量檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒及其方法。該方法將lamp-crispr/cas12b的特異性與數(shù)字檢測技術(shù)的絕對定量優(yōu)勢相結(jié)合，能夠在60分鐘內(nèi)，于恒溫條件下對肺炎克雷伯菌進(jìn)行精確、快速的定量檢測，具有高靈敏度和特異性。

48、與qpcr相比，本方法具有以下優(yōu)勢：（1）反應(yīng)條件簡單：qpcr技術(shù)需要精密的溫度控制設(shè)備，且操作過程相對復(fù)雜，對實驗條件要求較高，而本方法研發(fā)的數(shù)字lamp-crispr/cas12b技術(shù)僅需要在60℃的恒溫條件下進(jìn)行，無需復(fù)雜的溫度循環(huán)設(shè)備；（2）檢測速度更快：本方法在60分鐘內(nèi)完成檢測，在檢測大量以及需要緊急測試的樣本中表現(xiàn)出更大優(yōu)勢；（3）精準(zhǔn)度更高：本方法通過lamp的快速擴(kuò)增和crispr/cas12b系統(tǒng)的高特異性檢測，實現(xiàn)靶標(biāo)的二次放大和二次識別，進(jìn)一步實現(xiàn)高靈敏度和高特異性的核酸檢測。并且，我們的結(jié)果也支持，與qpcr相比，數(shù)字lamp-crispr/cas12b在臨床樣本檢測時有較好的靈敏度和特異性。因此，數(shù)字lamp-crispr/cas12b方法的快速、簡便、高特異性和高靈敏度等優(yōu)勢，能為患者帶來更加及時、準(zhǔn)確的治療方案，從而改善預(yù)后、減少并發(fā)癥的發(fā)生，并降低整體醫(yī)療成本。

49、（7）本發(fā)明為臨床痰液樣本中肺炎克雷伯菌的靈敏定性和絕對定量提供了快速、穩(wěn)定和精準(zhǔn)的解決方案，為肺炎克雷伯菌早期感染的早期篩查、病情監(jiān)測和治療評價提供可用的手段。