本發(fā)明涉及一種噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a新型識(shí)別元件雙特異性抗體制備及在酶聯(lián)免疫同步檢測(cè)的應(yīng)用,屬于分子生物學(xué)。
背景技術(shù):
1、農(nóng)藥殘留和真菌毒素污染是農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、加工和銷(xiāo)售過(guò)程中的重要隱患。噻蟲(chóng)啉(thiacloprid,tcl)因其廣譜、高效的性質(zhì),在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中應(yīng)用廣,殘留高。赭曲霉毒素a(ochratoxin?a,ota)作為典型真菌毒素,危害性強(qiáng),污染范圍廣,在谷物和果蔬類(lèi)農(nóng)產(chǎn)品中均有殘留。但是對(duì)于同時(shí)檢測(cè)這兩種有害物的免疫檢測(cè)方法通常采用多種單特異性抗體聯(lián)合,存在檢測(cè)成本高等缺陷。因此,基于雙特異性抗體建立這兩種污染物的同步檢測(cè)方法非常重要。
2、由于環(huán)境體系和食品供應(yīng)鏈體系之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)性,環(huán)境中的噻蟲(chóng)啉會(huì)不可避免地進(jìn)入人類(lèi)食物鏈,因此食品中噻蟲(chóng)啉的殘留檢測(cè)具有重要意義。目前,對(duì)于食品中tcl的檢測(cè)主要包括色譜法、質(zhì)譜法等大型儀器法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)等免疫分析法。赭曲霉毒素a在食物鏈中傳播途徑頗多,因此被赭曲霉毒素a污染的食物種類(lèi)繁多。為了降低人群暴露于ota的風(fēng)險(xiǎn),減少ota在食物鏈的傳播,越來(lái)越多的研究者致力于ota檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā),包括儀器分析法和免疫分析法。但是,目前較為常見(jiàn)的快檢產(chǎn)品多為基于傳統(tǒng)免疫抗體的單一組分檢測(cè),無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥和毒素的同時(shí)檢測(cè),且抗體制備復(fù)雜、周期長(zhǎng)?;诨蚬こ讨亟M技術(shù)制備的雙特異性抗體識(shí)別元件很好地解決了上述問(wèn)題,可以在體外快速表達(dá),實(shí)現(xiàn)跨類(lèi)有害物同步檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a檢測(cè)抗體,其氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
2、在一種實(shí)施方式中,所述噻蟲(chóng)啉檢測(cè)抗體包含單鏈抗體和納米抗體可變區(qū),所述單鏈的氨基酸序列如seq?id?no.4所示;所述納米抗體可變區(qū)序列如seq?id?no.5所示。
3、本發(fā)明還提供編碼所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a檢測(cè)抗體的基因。
4、在一種實(shí)施方式中,所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
5、本發(fā)明還提供含有上述基因的重組載體。
6、在一種實(shí)施方式中,以pcdna3.1為表達(dá)載體。
7、本發(fā)明還提供含有上述基因或上述重組載體的細(xì)胞。
8、在一種實(shí)施方式中,所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
9、在一種實(shí)施方式中,所述細(xì)胞為expi293f細(xì)胞。
10、本發(fā)明還提供了一種制備噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的方法,所述方法是將seq?id?no.3所示的核苷酸序列在expi293f細(xì)胞中表達(dá)。
11、在一種實(shí)施方式中,所述方法是以pcdna3.1為表達(dá)載體表達(dá)所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的編碼基因。
12、在一種實(shí)施方式中,所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
13、本發(fā)明還提供了所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體在檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a方面的應(yīng)用。
14、本發(fā)明還提供一種聯(lián)合檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的試劑盒,所述試劑盒含有所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體,或所述重組載體,或所述細(xì)胞。
15、在一種實(shí)施方式中,所述試劑盒中還含有如下(a)~(c)任一:
16、(a)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a檢測(cè)抗體的酶標(biāo)記物;
17、(b)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a檢測(cè)抗體的酶標(biāo)記抗體;
18、(c)所述噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a檢測(cè)抗體的酶標(biāo)記物。
19、在一種實(shí)施方式中,所述試劑盒中還含有噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a標(biāo)準(zhǔn)品。
20、本發(fā)明還提供所述基因,或所述重組載體,或所述細(xì)胞,或所述試劑盒在檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用,所述應(yīng)用不以疾病的診斷和/或治療為目的。
21、有益效果:
22、本發(fā)明提供了一種噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的雙特異性抗體,所述雙特異性抗體由單鏈抗體和納米抗體可變區(qū)組成,所述單鏈抗體的氨基酸序列如seq?id?no.4所示,所述納米抗體可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。本發(fā)明提供的雙特異性抗體檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的線性范圍分別為0.05-1000ng/ml和0.05-500ng/ml,lod分別為0.337ng/ml和0.788ng/ml,ic50分別為17.10ng/ml和16.69ng/ml。
1.一種聯(lián)合檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的抗體,其特征在于,氨基酸序列如seq?idno.6所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗體的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
4.攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.表達(dá)權(quán)利要求1所述抗體的細(xì)胞。
6.一種制備噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的方法,其特征在于,以pcdna3.1為表達(dá)載體,將seq?id?no.3所示的核苷酸序列在expi293f細(xì)胞中表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,還對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體進(jìn)行純化。
8.權(quán)利要求1所述的抗體在檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用。
9.一種聯(lián)合檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a的試劑盒,其特征在于,含有如下(a)~(c)任一:
10.權(quán)利要求1所述的抗體,或權(quán)利要求2~3任一所述的基因,或權(quán)利要求4所述的重組載體,或權(quán)利要求5所述的細(xì)胞,或權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測(cè)噻蟲(chóng)啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用,所述應(yīng)用不以疾病的診斷和/或治療為目的。