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一種定量檢測肺炎克雷伯菌的數字LAMP-CRISPR/Cas12b試劑盒

文檔序號:40400313發(fā)布日期:2024-12-20 12:23閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一組用于肺炎克雷伯菌檢測的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌檢測的lamp引物組以及grna和ssdna報告分子;

2.根據權利要求1所述的核酸分子制備的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包含所述的用于肺炎克雷伯菌檢測的0.5%鹽酸溴己新溶液,warmstart??lamp預混液,lamp引物組,cas12b,grna,ssdna報告分子,rnase抑制劑,mg?2+,depc水和數字芯片。

3.根據權利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的數字芯片為固相分隔芯片,將配置好的lamp-cas12b反應體系加入到刮片的加樣孔上;將反應體系從刮片載入到芯片的每個單元中的固相;接著在體系上覆蓋一層油相,使每個單元中的反應體系被固相芯片和油相分隔,以形成的數字陣列;將芯片置于60?℃的水浴中孵育1小時,用生物芯片分析儀檢測15000個分區(qū)的終點熒光并根據分區(qū)的熒光分布確定閾值,并根據閾值計算陽性分區(qū)百分比和輸入核酸濃度。

4.根據權利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,所述數字芯片為固相分隔芯片,微流控液滴芯片及其他可實現數字化分隔的芯片中的一種或多種。

5.根據權利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,?將用于肺炎克雷伯菌檢測的0.5%鹽酸溴己新溶液,1×warmstart??lamp預混液,1×lamp引物,250nm?cas12b,250nm?grna,3μm?ssdna報告分子,1000u/ml?rnase抑制劑,4mm?mg?2+和depc水與待測樣品混合,形成反應體系,之后于恒溫條件下進行l(wèi)amp-crispr/cas12b反應。

6.根據權利要求5所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,所述反應的體系中,核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的引物的濃度為1?μm?,核苷酸序列如seq?id?no.5和6所示的引物的濃度為0.1?μm?,核苷酸序列如seqid?no.1和seq?id?no.2所示的引物的濃度為0.2?μm,核苷酸序列如seq?id?no.7所示的grna的濃度為250?nm,?核苷酸序列如seq?id?no.8所示的ssdna的濃度為3?μm。

7.根據權利要求6所述的肺炎克雷伯菌定量檢測數字lamp-crispr/cas12b試劑盒,其特征在于,所述恒溫條件為60℃下孵育60?min。


技術總結
本發(fā)明公開了一種肺炎克雷伯菌定量檢測數字LAMP?CRISPR/Cas12b方法和試劑盒。該方法將LAMP?CRISPR/Cas12b的特異性與數字芯片技術的絕對定量優(yōu)勢相結合,能夠在60分鐘內,于恒溫條件下對肺炎克雷伯菌進行精確、快速的定量檢測,具有高靈敏度和特異性。能夠實現對肺炎克雷伯菌DNA的精準定量。痰液中的酸性糖蛋白為Bst聚合酶的抑制因子,本方法使用0.5%鹽酸溴己新溶液減少了抑制因子對核酸濃度的負面影響,使數字LAMP?CRISPR/Cas12b方法對于免核酸提取的熱裂解樣本的檢測靈敏度增加。

技術研發(fā)人員:季明輝,孫舒婷,周子涵,戴啟剛,高暢,莊添馳,孫濤,梅浩坤,李寧,劉云,賈書儀
受保護的技術使用者:南京醫(yī)科大學
技術研發(fā)日:
技術公布日:2024/12/19
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