本發(fā)明屬于病原菌檢測(cè)，具體涉及一種基于rpa-cas12a技術(shù)的蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蓮藕腐敗病(lotus?rhizome?rot?disease)是蓮藕上的一種毀滅性土傳真菌病害，可造成10％-80％的產(chǎn)量損失，是我國(guó)蓮藕產(chǎn)業(yè)的重要威脅。蓮藕腐敗病最早于1953年由nisikado和watanabe鑒定為尖孢鐮刀菌蓮藕?；?fusarium?oxysporumschl.f.sp.nelumbicola(nis.&wat.))。隨著時(shí)間的推移，不斷有其他病原菌引起蓮藕“腐敗病”的報(bào)道，如鐮刀菌f.incarnatum；f.tricinctum；f.commune以及旋柄腐霉phytopythium?helicoides等。病原菌的不明確導(dǎo)致蓮藕腐敗病的相關(guān)研究陷入較長(zhǎng)時(shí)間的停滯與混亂。近年來，隨著真菌分類學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，多項(xiàng)研究表明f.commune已成為蓮藕腐敗病的主要病原菌。

2、湖北省是我國(guó)最大的種藕研發(fā)與生產(chǎn)基地，提供了全國(guó)80％以上的種藕。由于種藕為無性繁殖而成，不可避免的存在種子帶菌、病毒積累及自然衰退等現(xiàn)象。因此，在售賣前對(duì)種藕進(jìn)行病原菌或者病毒檢測(cè)是保證種藕質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。而蓮藕腐敗病作為影響蓮藕生產(chǎn)的頭號(hào)病害，是種藕檢測(cè)的主要對(duì)象之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明擬采用分子生物學(xué)技術(shù)手段開發(fā)一種對(duì)快速檢測(cè)種藕中所含蓮藕腐敗病病原菌f.commune的試劑盒，以保證種藕的質(zhì)量。

2、本發(fā)明基于rpa-cas12a技術(shù)對(duì)共同鐮刀菌病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)，通過對(duì)基因組的比較分析,獲得了一個(gè)共同鐮刀菌特有的基因組位點(diǎn)，在該位點(diǎn)上設(shè)計(jì)了一套引物(共4條),結(jié)合rpa-cas12a檢測(cè)反應(yīng)液系統(tǒng)，可以從發(fā)病組織以及培養(yǎng)物當(dāng)中快速準(zhǔn)確的鑒定共同鐮刀菌，檢測(cè)限低至1copis/μl，并能特異性區(qū)分f.commune與f.oxysporum菌株。

3、基于此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)的引物組，包括rpa引物對(duì)和crrna；

4、所述rpa引物對(duì)為由seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的兩條單鏈dna組成的引物對(duì)；所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

5、本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)的試劑盒，含有rpa擴(kuò)增試劑、crispr-cas12a檢測(cè)試劑以及上述引物組。

6、進(jìn)一步地，所述rpa擴(kuò)增試劑包括如下中的全部或部分：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈dna結(jié)合酶、鏈置換型dna聚合酶、dntps和醋酸鎂。

7、進(jìn)一步地，所述crispr-cas12a檢測(cè)試劑包括cas12a蛋白和/或信號(hào)報(bào)告探針。

8、進(jìn)一步地，所述cas12a蛋白選自ascas12a、lb4cas12a、lb5cas12a、fncas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a和bocas12a，優(yōu)選為lbcas12a蛋白，所述信號(hào)報(bào)告探針為：5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

9、本發(fā)明還提供了上述引物組或試劑盒在如下任一中的應(yīng)用：

10、(a1)制備用于檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)的產(chǎn)品；

11、(a2)制備用于診斷蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)感染的產(chǎn)品；

12、(a3)制備用于診斷或輔助診斷蓮藕腐敗病的產(chǎn)品。

13、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)或診斷蓮藕腐敗病感染的方法，包括如下步驟：

14、(b1)從待測(cè)樣本中提取dna；

15、(b2)以(b1)提取的dna為模板，采用權(quán)利要求1中所述引物組或權(quán)利要求2所述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；

16、(b3)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷是否存在蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)或蓮藕腐敗病感染。

17、進(jìn)一步地，檢測(cè)結(jié)果為在308nm波長(zhǎng)紫外光下觀察熒光情況，發(fā)熒光代表陽性，即存在感染。

18、進(jìn)一步地，檢測(cè)過程中rpa反應(yīng)體系包括：28.5-30.5μl?buffer、10-11.6μl?h2o、2-3μl引物f/r、2-3μldna、2-3μl?mgoac，反應(yīng)條件為：37～42℃，10-30min。

19、進(jìn)一步地，檢測(cè)過程中cas12a體系包括：15-20μl?depc?h2o、5-10μl?ssdnareporter、1-5μl?buffer、1-3μl?crrna、1-2μl?cas12a、1-2μl?target?dna，反應(yīng)條件為：37～42℃，10-60min。

20、有益效果：

21、本發(fā)明通過對(duì)基因組的比較分析，獲得了一個(gè)共同鐮刀菌特有的基因組位點(diǎn)，并針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一套特異性引物，結(jié)合rpa-cas12a檢測(cè)反應(yīng)液系統(tǒng)，可以從發(fā)病組織以及培養(yǎng)物當(dāng)中快速準(zhǔn)確的鑒定共同鐮刀菌，對(duì)蓮藕鐮刀菌病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)，最低可檢測(cè)1copy/μl(0.3fg/μl)濃度的目標(biāo)片段，靈敏度較現(xiàn)有的lamp技術(shù)(10pg/μl)，提高了近3000倍，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)的引物組，其特征在于，包括rpa引物對(duì)和crrna；

2.用于檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)的試劑盒，其特征在于，含有rpa擴(kuò)增試劑、crispr-cas12a檢測(cè)試劑以及權(quán)利要求1所述的引物組。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述rpa擴(kuò)增試劑包括如下中的全部或部分：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈dna結(jié)合酶、鏈置換型dna聚合酶、dntps和醋酸鎂。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述crispr-cas12a檢測(cè)試劑包括cas12a蛋白和/或信號(hào)報(bào)告探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述cas12a蛋白選自ascas12a、lb4cas12a、lb5cas12a、fncas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a和bocas12a，優(yōu)選為lbcas12a蛋白，所述信號(hào)報(bào)告探針為：5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

6.權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求2-5任一所述試劑盒在如下任一中的應(yīng)用：

7.一種檢測(cè)蓮藕腐敗病菌(fusarium?commune)或診斷蓮藕腐敗病感染的方法，包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，檢測(cè)結(jié)果為在308nm波長(zhǎng)紫外光下觀察熒光情況，發(fā)熒光代表陽性，即存在感染。

9.根據(jù)權(quán)利要求7-8任一所述的方法，其特征在于，檢測(cè)過程中rpa反應(yīng)體系包括：28.5-30.5μl?buffer、10-11.6μl?h2o、2-3μl引物f/r、2-3μldna、2-3μlmgoac，反應(yīng)條件為：37～42℃，10-30min。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-8任一所述的方法，其特征在于，檢測(cè)過程中cas12a體系包括：15-20μl?depc?h2o、5-10μl?ssdnareporter、1-5μl?buffer、1-3μl?crrna、1-2μl?cas12a、1-2μl?target?dna，反應(yīng)條件為：37～42℃，10-60min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于RPA?Cas12a技術(shù)的蓮藕腐敗病菌(Fusarium?commune)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。通過對(duì)基因組的比較分析,獲得了一個(gè)共同鐮刀菌特有的基因組位點(diǎn)，在該位點(diǎn)上設(shè)計(jì)了一套引物，結(jié)合RPA?Cas12a檢測(cè)反應(yīng)液系統(tǒng),可以從發(fā)病組織以及培養(yǎng)物當(dāng)中快速準(zhǔn)確的鑒定共同鐮刀菌，檢測(cè)限低至1copis/μl，實(shí)現(xiàn)對(duì)蓮藕鐮刀菌病原菌的快速檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：蔡翔,郝紀(jì)恒,楊紹麗,匡晶,周利琳,王攀,司升云,朱紅蓮,錢紫燕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19