本發(fā)明涉及腫瘤檢測(cè)，具體為通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法。

背景技術(shù)：

1、肺癌從最初病變發(fā)展成癌浸潤轉(zhuǎn)移需要5-10年時(shí)間，早期發(fā)現(xiàn)不僅治療效果好，其醫(yī)療開支也低。但一旦突破這個(gè)階段，隨著病程變長，病變速度加快，治療費(fèi)用高，效果很差。因此，早期診斷和治療是應(yīng)對(duì)肺癌的最佳方法。由于肺癌早期沒有特異性的臨床表現(xiàn)，雖然有許多腫瘤早期信號(hào)出現(xiàn)，但是缺乏高敏感性和特異性的早期診斷技術(shù)，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是癌癥晚期，如常見的磨玻璃為主的肺結(jié)節(jié)，它們的良惡性判斷最主要就是基于胸部ct影像的表現(xiàn)，但是很難給予鑒別，最終診斷往往是在中晚期。

2、腫瘤的早期診斷通常取決于兩個(gè)關(guān)鍵因素：檢查指標(biāo)的高靈敏度和無創(chuàng)、簡便的檢測(cè)方法。隨著科技的快速發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤診斷和治療的新領(lǐng)域、新的挑戰(zhàn)和希望。腫瘤標(biāo)志物可在體液或組織中檢測(cè)，可反映腫瘤的存在、分化程度、預(yù)后估計(jì)和治療效果。

3、人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動(dòng)著血液細(xì)胞，體細(xì)胞和血液細(xì)胞破裂降解后，釋放胞漿中的內(nèi)含物，包括蛋白質(zhì)、外泌體、rna及攜帶有各種遺傳信息的dna片段即cfdna(cellfree?dna)。該類dna片段含有例如突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等異常情況，特別是來自腫瘤基因組的ctdna(circulating?tumordna，循環(huán)腫瘤細(xì)胞dna)片段。ctdna由于獲取過程侵犯性低、可多次獲得、還可以觀察動(dòng)態(tài)變化等被作為液體活檢的重要的檢測(cè)樣品。

4、公開號(hào)為cn117512115a的發(fā)明公開了一種通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高檢測(cè)腫瘤靈敏率的方法，該方法為用亞硫酸氫鹽將樣品cfdna中非甲基化cpg位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，之后用外側(cè)引物進(jìn)行第一輪多道pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，用內(nèi)側(cè)引物和探針進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增，之后計(jì)算各個(gè)靶基因的dct(△ct)值，判斷樣品為陽性還是陰性。

5、如上述發(fā)明所示，現(xiàn)有的提高檢測(cè)腫瘤靈敏率的方法將基因甲基化信號(hào)前置放大，以此來提高檢測(cè)準(zhǔn)確率和靈敏度，但是這種方式在甲基化信號(hào)放大不明顯時(shí)，不能提高檢測(cè)準(zhǔn)確率和靈敏度，影響檢測(cè)的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，解決了現(xiàn)有的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，包括以下步驟：

3、步驟一：對(duì)待檢測(cè)組織dna樣本進(jìn)行修飾處理，得到轉(zhuǎn)化后的dna；

4、步驟二：使用內(nèi)側(cè)引物對(duì)，采用多重pcr法對(duì)轉(zhuǎn)化后dna進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，使得擴(kuò)增的產(chǎn)物序列分別為dna轉(zhuǎn)化的正鏈和負(fù)鏈；

5、步驟三：對(duì)獲得的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除非特異性擴(kuò)增的小片段dna和二聚體；

6、步驟四：使用外側(cè)引物對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行二次純化；

7、步驟五：將二次擴(kuò)增后的產(chǎn)物、特異性檢測(cè)引物和特異性探針進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)

8、步驟六：測(cè)量腫瘤組織dna甲基化標(biāo)準(zhǔn)品的ct值。

9、優(yōu)選的，所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應(yīng)用于步驟一中的修飾處理，用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基化的胞嘧啶不變，從而區(qū)分甲基化或非甲基化基因片段。

10、優(yōu)選的，所述內(nèi)側(cè)引物包括針對(duì)s2的甲基化的dna的正、負(fù)鏈分別設(shè)計(jì)而成的兩對(duì)引物，每對(duì)內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補(bǔ)的20～25個(gè)堿基，3’端使用根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)外側(cè)的序列所設(shè)計(jì)的特異性引物序列。

11、優(yōu)選的，通過所述內(nèi)側(cè)引物的擴(kuò)增方法為：將所有內(nèi)側(cè)引物放入一個(gè)引物池中，在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，同時(shí)完成多個(gè)靶點(diǎn)基因的擴(kuò)增。

12、優(yōu)選的，所述外側(cè)引物包括外側(cè)引物f和外側(cè)引物r，所述外側(cè)引物f與illuminamultiplexing?pcr?primer?1.0引物相同，所述外側(cè)引物r采用截?cái)嗔?’端的illumina?rnapcr?primer引物。

13、優(yōu)選的，所述特異性pcr檢測(cè)引物的序列如下：

14、s-m-f(序列表中序列1)：gatagttaggtaattttcgtttcg；

15、s-m-r(序列表中序列2)：ccttctaacccgacttaaacgacg；

16、a-m-f(序列表中序列3)：gggtggtgatggaggaggtt；

17、a-m-r(序列表中序列4)：taaccaccacccaacacacaat。

18、優(yōu)選的，所述特異性探針的序列如下：

19、s-m-p(序列表中序列5)：fam-gtacgaccccgatcg-mgb；

20、a-m-p(序列表中序列6)：vic-tggattgtgaatttgtg-mgb。

21、優(yōu)選的，所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)方法，包括以下步驟：

22、s1：在95℃下保持3分鐘；

23、s2：降溫至58℃，保持20秒；

24、s3：升溫至72℃，保持30秒；

25、s4：將步驟s2和步驟s3進(jìn)行50次循環(huán)；

26、s5：在72℃下保持1分鐘。

27、有益效果

28、本發(fā)明提供了通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比具備以下有益效果：

30、1、該通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，通過多重pcr技術(shù)和巢式pcr技術(shù)相結(jié)合，除了可以定性的檢測(cè)樣本是否出現(xiàn)甲基化，同時(shí)可以對(duì)甲基化的程度進(jìn)行定量檢測(cè)，不僅能夠?qū)⒒蚣谆盘?hào)放大，而且其所需要的檢測(cè)樣本起始量超低，測(cè)序成本較低，可檢出極其微量的甲基化dna，從而使得早期篩查成為可能。

31、2、該通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，通過合理選擇特異性的引物，可以進(jìn)一步增加檢測(cè)的靈敏度和特異性，使其能夠檢測(cè)到很低的基因甲基化狀態(tài)，同時(shí)可排除非cpg區(qū)域甲基化對(duì)檢測(cè)的影響，剔除低轉(zhuǎn)化片段的干擾，提高檢出率。

技術(shù)特征：

1.通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應(yīng)用于步驟一中的修飾處理，用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基化的胞嘧啶不變，從而區(qū)分甲基化或非甲基化基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述內(nèi)側(cè)引物包括針對(duì)s2的甲基化的dna的正、負(fù)鏈分別設(shè)計(jì)而成的兩對(duì)引物，每對(duì)內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補(bǔ)的20～25個(gè)堿基，3’端使用根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)外側(cè)的序列所設(shè)計(jì)的特異性引物序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：通過所述內(nèi)側(cè)引物的擴(kuò)增方法為：將所有內(nèi)側(cè)引物放入一個(gè)引物池中，在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，同時(shí)完成多個(gè)靶點(diǎn)基因的擴(kuò)增。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述外側(cè)引物包括外側(cè)引物f和外側(cè)引物r，所述外側(cè)引物f與illuminamultiplexing?pcr?primer?1.0引物相同，所述外側(cè)引物r采用截?cái)嗔?’端的illumina?rnapcr?primer引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述特異性pcr檢測(cè)引物的序列如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述特異性探針的序列如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，其特征在于：所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)方法，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，本發(fā)明涉及腫瘤檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該通過基因甲基化信號(hào)預(yù)放大提高腫瘤檢測(cè)靈敏度的方法，包括六個(gè)步驟，通過多重PCR技術(shù)和巢式PCR技術(shù)相結(jié)合，除了可以定性的檢測(cè)樣本是否出現(xiàn)甲基化，同時(shí)可以對(duì)甲基化的程度進(jìn)行定量檢測(cè)，不僅能夠?qū)⒒蚣谆盘?hào)放大，而且其所需要的檢測(cè)樣本起始量超低，測(cè)序成本較低，可檢出極其微量的甲基化DNA，從而使得早期篩查成為可能，通過合理選擇特異性的引物，可以進(jìn)一步增加檢測(cè)的靈敏度和特異性，使其能夠檢測(cè)到很低的基因甲基化狀態(tài)，同時(shí)可排除非CpG區(qū)域甲基化對(duì)檢測(cè)的影響，剔除低轉(zhuǎn)化片段的干擾，提高檢出率。

技術(shù)研發(fā)人員：王楊,馮磊,孟明耀,匡野,郭洋帆,李琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：昆明市延安醫(yī)院（昆明市干部療養(yǎng)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19