本發(fā)明的領(lǐng)域涉及靶標(biāo)分子的檢測(cè)，例如以多重(multiplex)形式。政府支持本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助的gm133052和gm124401以及由美國(guó)海軍研究辦公室資助的n00014-18-1-2549下的政府支持下完成。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。

背景技術(shù)：

1、空間生物學(xué)使研究人員能夠繪制單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)并確定其如何與組織環(huán)境中的探測(cè)相互作用。在單細(xì)胞水平上揭示的空間和定量信息極大地?cái)U(kuò)展了對(duì)人體細(xì)胞類(lèi)型和疾病病變微環(huán)境中異質(zhì)性的理解。測(cè)序和成像是原位空間生物學(xué)研究的兩個(gè)主要平臺(tái)并且可以在不剖解細(xì)胞的情況下進(jìn)行。與測(cè)序相比，基于成像的方法可以在完整的生物樣品中提供更高的空間分辨率，但通常受患于所分析生物靶標(biāo)的低多重性。在單細(xì)胞和組織中使多種不同種類(lèi)的生物分子可視化的能力已成為幫助理解復(fù)雜生物系統(tǒng)(例如癌癥腫瘤環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性和信號(hào)調(diào)節(jié)途徑)的越來(lái)越重要的工具(lewis,s.m.等，spatialomics?and?multiplexed?imaging?to?explore?cancer?biology.nature?methods,1-16(2021))。

2、然而，由于光譜重疊，熒光顯微鏡術(shù)的多重性通常受到調(diào)色板(通常為3～4種顏色)的限制。為了克服這一瓶頸，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了更大實(shí)體上熒光團(tuán)的幾何編碼和成像劑的迭代結(jié)合。這種迭代方法需要多輪洗滌以去除前一輪的信號(hào)并積累當(dāng)前輪次的信號(hào)，這是通過(guò)自動(dòng)化微流體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)設(shè)置通常是復(fù)雜的，并且洗滌過(guò)程是耗時(shí)的。幾何編碼是在巨型實(shí)體上實(shí)現(xiàn)的，該實(shí)體通常過(guò)于龐大，無(wú)法原位擴(kuò)散到亞細(xì)胞生物學(xué)靶標(biāo)以揭示單個(gè)細(xì)胞中的高分辨率空間信息。除此之外，組合編碼可應(yīng)用于迭代結(jié)合或光譜編碼，以指數(shù)級(jí)改善多重性(chen,k.h.,boettiger,a.n.,moffitt,j.r.,wang,s.&zhuang,x.rnaimaging.spatially?resolved,highly?multiplexed?rna?profiling?in?singlecells.science348,aaa6090(2015)和eng,c.l.等，transcriptome-scale?super-resolvedimaging?in?tissues?by?rna?seqfish.nature?568,235-239(2019))。

3、因此，本領(lǐng)域仍然需要用于靶標(biāo)分子(例如蛋白質(zhì)和rna)的改進(jìn)的多重檢測(cè)的試劑和方法。本公開(kāi)內(nèi)容滿(mǎn)足了這些需求中的一些。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文所述的方法、組合物和試劑盒部分地基于經(jīng)標(biāo)記核酸探針的生成，所述經(jīng)標(biāo)記核酸探針具有熔解點(diǎn)/變性溫度不同的區(qū)域，使得將溫度改變?yōu)榻o定的溫度通道可以釋放對(duì)報(bào)告分子的抑制，從而允許細(xì)胞或組織中給定的核酸的可視化。

2、在一個(gè)方面，本文提供了用于對(duì)樣品中的靶標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)的方法。所述方法包括提供檢測(cè)探針組。檢測(cè)探針組包含至少三條核酸鏈——靶標(biāo)結(jié)合鏈、報(bào)告鏈和猝滅鏈。第一鏈(也稱(chēng)為靶標(biāo)結(jié)合鏈)包含用于與靶標(biāo)結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合劑，所述靶標(biāo)結(jié)合劑連接到用于與報(bào)告鏈雜交的雜交結(jié)構(gòu)域。第二鏈(本文也稱(chēng)為報(bào)告鏈)包含用于與靶標(biāo)結(jié)合鏈的雜交結(jié)構(gòu)域雜交的第一雜交結(jié)構(gòu)域，所述第一雜交結(jié)構(gòu)域連接到用于與猝滅鏈結(jié)合的第二雜交結(jié)構(gòu)域。報(bào)告鏈進(jìn)一步包含能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子。報(bào)告鏈的第一雜交結(jié)構(gòu)域包含與靶標(biāo)結(jié)合鏈的雜交結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的核苷酸序列。第三鏈(也稱(chēng)為猝滅鏈)包含用于與報(bào)告鏈的第二雜交結(jié)構(gòu)域雜交的雜交結(jié)構(gòu)域。猝滅鏈包含猝滅劑分子。猝滅鏈的雜交結(jié)構(gòu)域包含與報(bào)告鏈的第二雜交結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的核苷酸序列。報(bào)告鏈中的報(bào)告分子和猝滅鏈中的猝滅劑分子被布置成使得當(dāng)報(bào)告鏈和猝滅鏈彼此雜交(例如通過(guò)雜交結(jié)構(gòu)域)時(shí)，猝滅劑分子猝滅來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)猝滅鏈和報(bào)告鏈不彼此雜交時(shí)，來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)不被猝滅。

3、靶標(biāo)結(jié)合劑可以選自于由以下組成的組：核酸、蛋白質(zhì)、肽、擬肽(peptidomimetics)、氨基酸、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂多糖、凝集素、核苷、核苷酸、維生素、類(lèi)固醇、激素、輔因子、受體和受體配體。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)結(jié)合劑是核酸、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、抗體模擬物、受體或受體的配體。例如，靶標(biāo)結(jié)合分子是核酸。在另一個(gè)非限制性示例中，靶標(biāo)結(jié)合分子是抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。

4、靶標(biāo)分子可以是核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、小分子或抗原。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)分子是核酸。例如，靶標(biāo)分子是rna、dna或rna和dna的混合物。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)分子是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)分子是初級(jí)代謝物或次級(jí)代謝物。

5、不同雜交結(jié)構(gòu)域的熔解溫度不同，以允許從報(bào)告鏈釋放大部分猝滅鏈，而不實(shí)質(zhì)上從靶標(biāo)結(jié)合鏈釋放報(bào)告鏈和/或從靶標(biāo)分子釋放靶標(biāo)結(jié)合鏈。通常，與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度(tm)低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度，并且與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度低于與靶標(biāo)分子結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合鏈的熔解溫度。通常，與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度低于與靶標(biāo)分子結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合劑。

6、在允許通過(guò)靶標(biāo)結(jié)合劑與靶標(biāo)結(jié)合而使探針組結(jié)合至靶標(biāo)的條件下使探針組與靶標(biāo)接觸。通過(guò)評(píng)估作為溫度的函數(shù)產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)來(lái)分析探針組對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。例如，在高于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度且低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度的溫度下檢測(cè)或測(cè)量可檢測(cè)信號(hào)。在高于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度但低于與靶標(biāo)結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合劑的熔解溫度的溫度下，猝滅鏈和報(bào)告鏈不再彼此雜交，并且來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)不被猝滅。相反，當(dāng)在低于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度的溫度下測(cè)量可檢測(cè)信號(hào)時(shí)，猝滅鏈和報(bào)告鏈保持彼此雜交并且來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)被猝滅。因此，在兩個(gè)溫度下的可檢測(cè)信號(hào)是不同的。

7、在本文所述的多個(gè)方面的一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)結(jié)合鏈進(jìn)一步包含第二雜交結(jié)構(gòu)域。靶標(biāo)結(jié)合鏈的第二雜交結(jié)構(gòu)域可用于與參考鏈雜交。參考鏈包含雜交結(jié)構(gòu)域，所述雜交結(jié)構(gòu)域包含與靶標(biāo)結(jié)合鏈的第二雜交結(jié)構(gòu)域的核酸鏈實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的核苷酸序列。參考鏈還包含能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子。與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的參考鏈的熔解溫度高于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度。

8、在本文所述任一方面的一些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針組包含至少四條核酸鏈——靶標(biāo)結(jié)合鏈、報(bào)告鏈、猝滅鏈和參考鏈。當(dāng)使用包含四條鏈(靶標(biāo)結(jié)合鏈、報(bào)告鏈、猝滅鏈和參考鏈)的檢測(cè)探針組進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，該方法包括在第一溫度和第二溫度下檢測(cè)或測(cè)量來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)。第一溫度是高于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度但低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度的溫度。第二溫度是高于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度但低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的參考鏈的熔解溫度的溫度。來(lái)自附接到參考鏈的報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)可以作為對(duì)照或參考。

9、在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括在低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度的溫度下檢測(cè)或測(cè)量來(lái)自報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)。

10、可以制備不同的報(bào)告鏈和猝滅鏈，使得它們具有不同的熔解溫度。由于不同的猝滅鏈和報(bào)告鏈對(duì)在不同溫度下變性或熔解，因此來(lái)自不同報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)將在不同溫度下不猝滅。因此，可以在不同溫度下同時(shí)評(píng)估不同探針組對(duì)不同靶標(biāo)的結(jié)合。因此，在另一方面，本文提供了用于靶標(biāo)分子的多重檢測(cè)的方法。該方法包括提供多個(gè)檢測(cè)探針組，其中，每個(gè)檢測(cè)探針組包含如本文所述的三條鏈——靶標(biāo)結(jié)合鏈、報(bào)告鏈和猝滅鏈。

11、在多個(gè)探針組中，一個(gè)檢測(cè)探針組中與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度與至少一個(gè)另外的探針組中與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度不同。此外，具有熔解溫度較低的第三鏈的探針組中的第二鏈的熔解溫度與具有熔解溫度較高的第三鏈的探針組中的第二鏈的熔解溫度相比大致相同或低于后者。需要注意的是，一個(gè)檢測(cè)探針組中的猝滅鏈可能能或不能與所述多個(gè)檢測(cè)探針組中的另一個(gè)檢測(cè)探針組中的報(bào)告鏈雜交。

12、使所述多個(gè)檢測(cè)探針組與靶標(biāo)分子接觸，以允許通過(guò)靶標(biāo)結(jié)合劑與靶標(biāo)的結(jié)合而使檢測(cè)探針組結(jié)合至其各自的靶標(biāo)。通過(guò)評(píng)估作為溫度的函數(shù)產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)來(lái)分析檢測(cè)探針組對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。例如，在高于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度且低于與靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的報(bào)告鏈的熔解溫度的溫度下測(cè)量來(lái)自與其靶標(biāo)結(jié)合的第一探針組的可檢測(cè)信號(hào)。該溫度使得結(jié)合至靶標(biāo)的第二檢測(cè)探針組中的猝滅鏈保持與該第二檢測(cè)探針組中的報(bào)告鏈雜交。在高于與第二探針組的報(bào)告鏈雜交的第二探針組的猝滅鏈的熔解溫度且低于與第二探針組的靶標(biāo)結(jié)合鏈雜交的第二探針組的報(bào)告鏈的熔解溫度的溫度下測(cè)量來(lái)自與其靶標(biāo)結(jié)合的第二探針組的可檢測(cè)信號(hào)。由于來(lái)自不同探針組的可檢測(cè)信號(hào)在不同溫度下生成，因此可以區(qū)分不同檢測(cè)探針組對(duì)其各自靶的結(jié)合，并以多重方式檢測(cè)靶標(biāo)。這允許在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多種靶標(biāo)分子，即多重檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)至少兩種靶標(biāo)分子，例如，檢測(cè)至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種或更多種不同的靶標(biāo)分子。

13、值得注意的是，所述多個(gè)檢測(cè)探針組的不同成員中的報(bào)告分子可以相同或不同。因此，在本文所述各個(gè)方面的一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)探針組中一個(gè)檢測(cè)探針組中的報(bào)告分子與所述多個(gè)檢測(cè)探針組中至少一個(gè)另外的檢測(cè)探針組中的報(bào)告分子不同。不受理論的束縛，使用不同的報(bào)告分子可以提供額外的多重檢測(cè)能力。例如，可以使用如下的探針組：與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度相似，但不同探針組具有不同報(bào)告分子。來(lái)自一個(gè)報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)與來(lái)自至少一個(gè)報(bào)告分子的可檢測(cè)信號(hào)可區(qū)分。可區(qū)分的可檢測(cè)信號(hào)可以在一個(gè)溫度下測(cè)量以檢測(cè)不同探針組對(duì)其各自靶標(biāo)的結(jié)合，例如，高于與報(bào)告鏈雜交的猝滅鏈的熔解溫度的溫度。這允許在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多種靶標(biāo)分子，即多重檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)至少兩種靶標(biāo)分子，例如，檢測(cè)至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種或更多種不同的靶標(biāo)分子。在一些實(shí)施方式中，用包含可區(qū)分的報(bào)告分子的檢測(cè)探針組檢測(cè)每種靶標(biāo)分子。這些可以與在不同溫度下變性或熔解的其它猝滅鏈和報(bào)告鏈對(duì)一起使用以進(jìn)一步多重化。

14、在另一個(gè)方面，本文提供了檢測(cè)探針組。檢測(cè)探針組包含如本文所述的至少三條核酸鏈——靶標(biāo)結(jié)合鏈、報(bào)告鏈和猝滅鏈。

15、在又一個(gè)方面，本文提供了試劑盒。試劑盒包含如本文所述的檢測(cè)探針組。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包含如本文所述的多個(gè)檢測(cè)探針組。

16、值得注意的是，可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)可以通過(guò)熒光顯微術(shù)和熒光標(biāo)記的報(bào)告子進(jìn)行?；蛘咄ㄟ^(guò)比色檢測(cè)和例如納米顆粒標(biāo)記報(bào)告子進(jìn)行。檢測(cè)還可以用于對(duì)原核、真核、其它或混合來(lái)源的經(jīng)固定的細(xì)胞、類(lèi)器官或組織樣品中的生物物種進(jìn)行多重成像。讀出也可以在表面(例如玻璃載玻片或其它基底)上進(jìn)行，例如用于對(duì)表面上的經(jīng)條形碼化的珠進(jìn)行測(cè)序或用于對(duì)表面上的固定寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序以用于核酸數(shù)據(jù)存儲(chǔ)應(yīng)用。

17、有多種方法可以將樣品加熱到正確的溫度。一種方法是通過(guò)peltier臺(tái)上系統(tǒng)，例如vaheat。另一種方法是讓緩沖液連續(xù)流過(guò)腔室，其中，外部加熱器控制緩沖液溫度?？刂茰囟鹊牧硪环N方法是與金屬納米材料耦合的使用激光或光將光轉(zhuǎn)化為熱能。參見(jiàn)例如www.cell.com/trends/biochemical-sciences/fulltext/s0968-0004(19)30236-1？dgcid。