本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種電化學發(fā)光探針三聯(lián)吡啶釕-cbt(ru(bpy)3²⁺-cbt)及其制備方法與應用。

背景技術(shù)：

蛋白酶是一組能夠在特定的活性位點將蛋白質(zhì)或寡肽酶解成更小碎片的蛋白水解酶。蛋白酶的存在非常豐富，幾乎存在于所有的生物體中，這些酶幾乎參與生物體所有的生物過程，其活性與許多疾病密切相關(guān)，因此蛋白酶常被用作藥物治療的靶點和疾病診斷的標志物。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶在許多生理過程中起著關(guān)鍵性作用，包括蛋白質(zhì)消化、血管生成、血液凝固、創(chuàng)傷修復、細胞自噬、衰老、壞死、細胞凋亡和dna遺傳信息的傳遞等生物過程。蛋白酶種類繁多，包含胰蛋白酶、caspase家族蛋白酶、凝血酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)、組織蛋白酶等，在體內(nèi)發(fā)揮著各不相同的作用。許多蛋白酶已經(jīng)成為疾病預測及診斷的生物檢測靶點，因此，建立一種高靈敏且通用的蛋白酶活性檢測方法，基礎科學研究和疾病臨床診斷領(lǐng)域具有重要意義。

目前，較常見的檢測蛋白酶活性的方法有熒光法、比色法、電化學法、化學發(fā)光法和電化學發(fā)光法等，熒光法應用較早且用途廣泛，已經(jīng)發(fā)展得相當成熟，近年來不斷有基于熒光法的納米材料探針用于蛋白酶活性的體外檢測和活細胞內(nèi)實時原位檢測的方法報道，但該類納米探針制備有極強的技術(shù)性和很高的成本，嚴重限制了其臨床應用。而比色法的不足之處在于不能達到足夠高的靈敏度和穩(wěn)定性，而且容易受雜質(zhì)干擾而影響檢測的精準度。電化學法具有靈敏度好、準確度高和選擇性好的優(yōu)點，但是多數(shù)高靈敏的檢測平臺多是在前期進行了繁瑣的電極修飾，是的該類方法的技術(shù)要求較高，且由于通用性不足，間接增加了該類平臺的檢測成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種基于電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt檢測蛋白酶活性的方法。

該方法是一種基于功能化的電化學發(fā)光探針自發(fā)且特異性的與被蛋白酶切割后的多肽底物組裝反應，對蛋白酶進行高靈敏度和高特異性檢測的平臺。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt的制備方法，包括如下步驟：

(1)在cabt(6-氨基-2-氰基苯并噻唑)上引入活潑氨基，得到活潑氨基-cbt，用于修飾到三聯(lián)吡啶釕上；

(2)通過氨基、羧基脫水縮合作用將活潑氨基-cbt修飾到ru(bpy)3²⁺上，得到電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt。

步驟(1)中所述的cabt(6-氨基-2-氰基苯并噻唑)購自上海歐堃化學有限公司。

步驟(1)中所述的活潑氨基-cbt優(yōu)選為glycine-cbt；

所述的glycine-cbt合成步驟如下：

1)稱取boc-glycine(n-叔丁氧羰基-甘氨酸)和nmm(n-甲基嗎啡啉)到thf(四氫呋喃)中；

2)在0℃氮氣保護條件下加入氯甲酸異丁酯，反應；

3)向步驟2)的反應溶液中加入cabt，0℃攪拌反應后，再室溫下攪拌反應；

4)向步驟3)的反應溶液中加入飽和nahco3，再用乙酸乙酯萃取，并用無水硫酸鈉干燥有機相；

5)通過減壓旋蒸去除有機相后，利用硅膠柱層析純化產(chǎn)物，二氯甲烷/甲醇洗脫終產(chǎn)物boc-glycine-cbt；

6)將步驟5)所得產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，加入tfa(三氟乙酸)，室溫下反應；

7)純化獲得glycine-cbt；

步驟1)中所述的boc-glycine和nmm的質(zhì)量比為7：6；

步驟1)中所述的nmm的濃度為7.5mg/ml；

步驟2)中所述的氯甲酸異丁酯與nmm的質(zhì)量比為2：3；

步驟2)中所述的反應的條件為0℃反應30min；

步驟3)中所述的cabt與boc-glycine的質(zhì)量比為1：2；

步驟3)中所述的0℃攪拌反應的時間為2h；

步驟3)中所述的室溫下攪拌反應的時間為12h；

步驟5)中所述的二氯甲烷/甲醇中二氯甲烷與甲醇的體積比為10:1～5:1；

步驟6)中所述的tfa的終濃度為20％；

步驟6)中所述的室溫下反應的時間為12h；

步驟(2)中所述的ru(bpy)3²⁺來自ru(bpy)2dcbpy(pf6)2，ru(bpy)2dcbpy(pf6)2合成步驟如下：

1)稱取0.1g二氯雙(2,2′-聯(lián)吡啶)釕、0.1gnahco3和0.075g4,4′-二羧酸-2,2′-聯(lián)吡啶，80℃攪拌回流反應10h。

2)冰浴2h后，用1m硫酸調(diào)節(jié)ph值至4.4，濾紙過濾除去未反應的4,4′-二羧酸-2,2′-聯(lián)吡啶，用2～3ml甲醇進一步?jīng)_洗濾紙。

3)向上述濾液中加入6.25mlnapf6溶液，室溫下攪拌反應2h，用1m硫酸調(diào)節(jié)ph值至4，冰浴4h。

4)4℃5000rpm離心5min，收集析出晶體，凍干干燥產(chǎn)物，得到ru(bpy)2dcbpy(pf6)2。

5)稱取230mgdcc和120mgnhs攪拌溶解于2ml無水dmf中，然后置于冰上。

6)向上述混合物中加入190mg三聯(lián)吡啶釕，于冰水浴中攪拌反應30min，在室溫反應5h。

7)于5000g，4℃離心5min，棄去沉淀，得到ru(bpy)2dcbpy-nhs溶液。

步驟(2)所述的將活潑氨基-cbt修飾到ru(bpy)2dcbpy(pf6)2上的反應步驟及體系如下：

a)取23.3mg活潑氨基-cbt緩慢加入到1.5mlru(bpy)2dcbpy-nhs溶液中，室溫攪拌反應12h。

b)向上述反應體系中加入100ml去離子水，用10×100ml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，并用無水na2so4干燥。

c)通過減壓旋蒸去除有機相后，利用硅膠柱層析純化產(chǎn)物，二氯甲烷/甲醇(二氯甲烷：甲醇＝5：1～1：1)洗脫終產(chǎn)物ru(bpy)3²⁺-cbt。

一種電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt，通過上述制備方法制備得到。

所述的電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt在檢測蛋白酶活性中的應用。

一種基于電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt檢測蛋白酶活性的方法，包括如下步驟：

(ⅰ)多肽底物與待檢蛋白酶樣品共孵育，然后加入蛋白酶抑制劑終止酶切反應，得到蛋白酶切產(chǎn)物ck-biotin；

所述的多肽底物序列模式為xxxxck-biotin，xxxx為蛋白酶特異性識別序列，多肽底物在被蛋白酶切割后會產(chǎn)生一個二肽cys-lys-biotin；

(ⅱ)電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt與蛋白酶切產(chǎn)物ck-biotin組裝反應，生成組裝復合物ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin；

(ⅲ)利用鏈霉親和素包被的磁珠富集、分離復合物ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin；

(ⅳ)對步驟(ⅲ)分離得到的ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin進行電化學發(fā)光分析，從而間接反映蛋白酶的催化量。

步驟(ⅰ)中所述的蛋白酶需要具備這一特點：其所識別的多肽底物的序列是特異的，且允許在酶切位點碳末端一側(cè)設計一個半胱氨酸。

步驟(ⅰ)中所述的多肽底物工作濃度優(yōu)選為1μm。

步驟(ⅱ)中所述的電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt與酶切產(chǎn)物ck-biotin組裝反應的條件優(yōu)選為：室溫下溫和震蕩反應15～60min；優(yōu)選為30min。

步驟(ⅱ)中所述的電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt工作濃度優(yōu)選為5μm。

步驟(ⅲ)中所述的鏈霉親和素包被的磁珠對形成的組裝復合物ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin的富集及分離條件優(yōu)選為：將磁珠加入到酶切溶液體系中后，室溫下溫和震蕩反應15～30min(優(yōu)選為15min)，用磁分離架將磁珠與溶液分離，每個樣品再分別用pbs溫和重懸洗滌4次，最終用pbs重懸磁珠。

步驟(ⅳ)中所述的電化學發(fā)光分析平臺為羅氏elecsys2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀及相關(guān)配套試劑。

本發(fā)明的基本原理如圖1所示：

在這項研究中，我們首次將2-cyanobenzothiazole(cbt)和cysteine間的縮合反應應用于電化學發(fā)光發(fā)檢測蛋白酶活性。cbt-cysteine縮合反應最初被發(fā)現(xiàn)發(fā)生在d-螢光素的生物合成過程中，這一反應可以在生理條件下快速進行，二級反應速率常數(shù)達到9.19m^-1s^-1。cbt與cysteine反應后生成新的穩(wěn)定的化合物，cbt與不含有1,2-氨基硫醇的物質(zhì)不會發(fā)生反應，如谷胱甘肽。研究表明，當cbt與一種鏈內(nèi)部含有半胱氨酸殘基的肽鏈不發(fā)生反應，這些都說明cbt只能與肽鏈n末端的半胱氨酸反應。我們在此將該種原理應用于蛋白酶的檢測中，如圖1.a，將cbt修飾到三聯(lián)吡啶釕上，設計出能夠特異性標記n末端半胱氨酸的電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt。其次，在蛋白酶底物多肽的設計上，在蛋白酶切位點的c末端一側(cè)，引入了一個半胱氨酸，在多肽底物的c末端標記有生物素，這樣一個底物在被蛋白酶切割后會生成cys-lys-biotin，ru(bpy)3²⁺-cbt可以特異性的與cys-lys-biotin組裝反應，生成化合物ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin，該化合物的量蛋白酶的催化量一致。用鏈霉親和素磁珠富集和分離上述化合物ru(bpy)3²⁺-cbt-ck-biotin進行電化學發(fā)光分析，電化學發(fā)光強度反映的則是蛋白酶的催化量，從能夠精確且特異的檢測蛋白酶活性(圖1.b)。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明的方法更加簡單快速，且通用性好，對于不同的靶標蛋白酶的檢測，通過更換相應的多肽底物序列，就可以實現(xiàn)對不同蛋白酶的檢測，應用范圍廣，對蛋白酶的檢測特異性好，靈敏度高。

(2)探針設計簡單，操作步驟簡短，易于在科研和臨床診斷等領(lǐng)域推廣和應用；

(3)檢測策略簡單，無特殊的材料修飾和處理要求。

附圖說明

圖1是基于電化學發(fā)光檢測技術(shù)的蛋白酶活性檢測方法原理圖。

圖2是對電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt的質(zhì)譜檢測結(jié)果。

圖3是對本電化學發(fā)光平臺檢測原理的驗證。

圖4是實施例1獲得的本電化學發(fā)光平臺對胰蛋白酶的檢測靈敏度分析。

圖5是實施例1獲得的本電化學發(fā)光平臺對caspase-3的檢測靈敏度分析。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件或按照制造廠商所建議的實驗條件。

實施例中所用的ru(bpy)2dcbpy(pf6)2在文獻中“synthesis,labelingandbioanalyticalapplicationsofatris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(ii)-basedelectrochemiluminescenceprobe.2014(9),1146-1159”公開。

實施例1

一種電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt的制備方法，具體包括如下步驟：

(1)合成glycine-cbt

合成glycine-cbt，以在cabt上引入活潑氨基，用于修飾到三聯(lián)吡啶釕上。

具體步驟如下：

1.稱取175mgboc-glycine和150mgnmm到20mlthf中。

2.在0℃氮氣保護條件下加入100mg氯甲酸異丁酯，0℃反應30min。

3.向上述反應溶液中加入87.5mgcabt(購自上海歐堃化學有限公司)，0℃攪拌反應2h后，再室溫下攪拌反應12h。

4.向上述反應溶液中加入100ml飽和nahco3，再用3×150ml乙酸乙酯萃取，并用無水硫酸鈉干燥有機相。

5.通過減壓旋蒸去除有機相后，利用硅膠柱層析純化產(chǎn)物，二氯甲烷：甲醇(10:1～5:1)洗脫終產(chǎn)物boc-glycine-cbt。

6.將上述所得產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，加入tfa至終濃度為20％，室溫下反應12h。

7.通過制備型高效液相色譜純化獲得glycine-cbt。

(2)對ru(bpy)3²⁺進行g(shù)lycine-cbt修飾

通過氨基、羧基脫水縮合作用將glycine-cbt修飾到ru(bpy)3²⁺上，得到ru(bpy)3²⁺-cbt。

具體步驟如下：

所述的ru(bpy)3²⁺來自ru(bpy)2dcbpy(pf6)2，ru(bpy)2dcbpy(pf6)2合成步驟如下：

1.稱取0.1g二氯雙(2,2′-聯(lián)吡啶)釕、0.1gnahco3和0.075g4,4′-二羧酸-2,2′聯(lián)吡啶，80℃攪拌回流反應10h。

2.冰浴2h后，用1m硫酸調(diào)節(jié)ph值至4.4，濾紙過濾除去未反應的4,4′-二羧酸-2,2′聯(lián)吡啶，用2～3ml甲醇進一補沖洗濾紙。

3.向上述濾液中加入6.25mlnapf6溶液，室溫下攪拌反應2h，用1m硫酸調(diào)節(jié)ph值至4，冰浴4h。

4.4℃5000rpm離心5min，收集析出晶體，凍干干燥產(chǎn)物，得到ru(bpy)2dcbpy(pf6)2。

5.稱取230mgdcc和120mgnhs攪拌溶解于2ml無水dmf中，然后置于冰上。

6.向上述混合物中加入190mg三聯(lián)吡啶釕，于冰水浴中攪拌反應30min，在室溫反應5h。

7.于5000g，4℃離心5min，棄去沉淀，得到ru(bpy)2dcbpy-nhs溶液。

所述的將glycine-cbt修飾到ru(bpy)3²⁺上的反應步驟及體系如下：

1.取23.3mgglycine-cbt緩慢加入到1.5mlru(bpy)2dcbpy-nhs溶液中，室溫攪拌反應12h。

2.向上述反應體系中加入100ml去離子水，用10×100ml乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，并用無水na2so4干燥。

3.通過減壓旋蒸去除有機相后，利用硅膠柱層析純化產(chǎn)物，二氯甲烷/甲醇(二氯甲烷：甲醇＝5：1～1：1)洗脫終產(chǎn)物ru(bpy)3²⁺-cbt。

對得到的產(chǎn)物進行質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，表明成功制備出了電化學發(fā)光探針ru(bpy)3²⁺-cbt。

實施例2

電化學發(fā)光平臺的檢測原理驗證

利用一個人工合成的ck-biotin(cys-lys-biotin)模擬蛋白酶切產(chǎn)物，驗證探針ru(bpy)3²⁺-cbt的功能及平臺的檢測可行性。

原理驗證實驗步驟如下：

1.在100μl的pbs溶液體系中，加入終濃度為1μm的ck-biotin和5μm的ru(bpy)3²⁺-cbt探針，室溫條件下震蕩反應30min。

2.取200μl鏈霉親和素包被的磁珠加入到上述體系中，室溫條件下溫和震蕩反應15min，用磁分離架收集磁珠，棄去上清。用200μlpbs洗滌4次后，再用100μlpbs重懸磁珠，最后將上述產(chǎn)物加入到羅氏elecsys2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀進行光電分析，記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。

對本電化學發(fā)光平臺檢測原理的驗證結(jié)果，如圖3所示，結(jié)果表明電化學發(fā)光強度隨著ck-biotin濃度的增大而增強，且呈線性關(guān)系(r²＝0.9925)，說明電化學發(fā)光強度的值能夠反映溶液中ck-biotin的量，因此ru(bpy)3²⁺-cbt探針可以用于檢測蛋白酶對底物的切割。

實施例3

1.胰蛋白酶與特異性多肽底物的反應時間優(yōu)化

胰蛋白酶多肽底物trck-biotin(thr-arg-cys-lys-biotin)購自上海強耀生物科技有限公司，胰蛋白酶、pmsf(苯甲基磺酰氟)購自sigma，鏈霉親和素包被的磁珠購自羅氏診斷。在100μl的pbs溶液體系中，加入終濃度為1μm的底物trck-biotin和1.5uml^-1的胰蛋白酶，分別在37℃溫和震蕩孵育1、2、3、4、5、7、9min后，加入1μl10μm的pmsf終止酶切反應。向上述體系中加入10μl濃度為50μmru(bpy)3²⁺-cbt探針，室溫條件下震蕩反應30min后，取200μl鏈霉親和素包被的磁珠加入到上述體系中，室溫條件下溫和震蕩反應15min，用磁分離架收集磁珠，棄去上清。用200μlpbs洗滌4次后，再用100μlpbs重懸磁珠，最后將上述產(chǎn)物加入到羅氏elecsys2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀進行光電分析，記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。優(yōu)化后的酶切反應時間為5分鐘。

2.電化學發(fā)光系統(tǒng)對胰蛋白酶檢測靈敏度的分析

在100μl的pbs溶液體系中，加入終濃度為1μm的底物trck-biotin和終濃度分別為0，5×10^-4，1×10^-3，5×10^-3，1×10^-2，5×10^-2，1×10^-1，5×10^-1，1，1.5，3uml^-1的胰蛋白酶，37℃溫和震蕩孵育5min后，加入1μl10μm的pmsf終止酶切反應。向上述體系中加入10μl濃度為50μmru(bpy)3²⁺-cbt探針，室溫條件下震蕩反應30min后，取200μl鏈霉親和素磁珠加入到上述體系中，室溫條件下溫和震蕩反應15min，用磁分離架收集磁珠，棄去上清。用200μlpbs洗滌4次后，再用100μlpbs重懸磁珠，最后將上述產(chǎn)物加入到羅氏elecsys2010電化學發(fā)光全自動免疫分析儀進行光電分析，并記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。檢測結(jié)果如圖4所示，對胰蛋白酶的檢測在1×10^-3～1.5uml^-1的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且根據(jù)公式ilod＝icontrol+3istdev(con)計算得檢測限為8.4×10^-4uml^-1。

實施例4

1.caspase-3蛋白酶與特異性多肽底物的反應時間優(yōu)化

caspase-3多肽底物devdck-biotin(asp-glu-val-asp-cys-lys-biotin)購自上海強耀生物科技有限公司，caspase-3蛋白酶購自biovisionincorporated，caspase-3蛋白酶抑制劑ac-devd-cho購自碧云天生物科技。在100μl的pbs溶液體系中，加入終濃度為1μm的底物devdck-biotin和0.0025uml^-1的caspase-3蛋白酶，分別在37℃溫和震蕩孵育1、2、3、4、5、6、7和8h后，加入1μl1μm的ac-devd-cho終止酶切反應。根據(jù)實施例3的方法進行ru(bpy)3²⁺-cbt探針的組裝反應與后續(xù)的分離及檢測。根據(jù)輸出的ecl數(shù)據(jù)分析得到的最優(yōu)反應時間是6h。

2.對本電化學發(fā)光系統(tǒng)對caspase-3蛋白酶檢測靈敏度的分析

在100μl的pbs溶液體系中，加入終濃度為1μm的底物devdck-biotin和終濃度分別為0，2.5×10^-6，5×10^-6，7.5×10^-6，1×10^-5，5×10^-5，7.5×10^-5，1×10^-4，5×10^-4，1×10^-3，1.5×10^-3，2×10^-3，2.5×10^-3，3×10^-3，3.5×10^-3uml^-1的caspase-3蛋白酶，37℃溫和震蕩孵育6h后，加入1μl1μm的ac-devd-cho終止酶切反應。根據(jù)實施例3的方法進行ru(bpy)3²⁺-cbt探針的組裝反應與后續(xù)的分離及檢測。檢測結(jié)果如圖5所示，對caspase-3蛋白酶的檢測在5×10^-6～1.5×10^-3uml^-1的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且根據(jù)公式ilod＝icontrol+3istdev(con)計算得檢測限為5×10^-6uml^-1。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南師范大學

<120>一種電化學發(fā)光探針三聯(lián)吡啶釕-cbt及其制備方法與應用

<130>1

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