本發(fā)明涉及食品安全技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種有機(jī)磷半抗原、有機(jī)磷寬譜多特異性人工抗原、抗體及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

有機(jī)磷農(nóng)藥屬有機(jī)磷酸酯類化合物，具有廣譜、高效、量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優(yōu)點(diǎn)，是目前用量最大，應(yīng)用面最廣的農(nóng)藥。然而由于在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及在農(nóng)業(yè)中濫用，引起了嚴(yán)重的環(huán)境問題。有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人、畜都具有較強(qiáng)的毒副作用，可經(jīng)過皮膚、呼吸以及腸胃吸收等途徑進(jìn)入人、畜體內(nèi)，對(duì)體內(nèi)膽堿酯酶的活性產(chǎn)生抑制作用，因其可與膽堿酯酶迅速結(jié)合，形成磷酰化膽堿酯酶，失去催化水解乙酰膽堿的能力，結(jié)果使大量的乙酰膽堿在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致乙酰膽堿為傳導(dǎo)介質(zhì)的膽堿能神經(jīng)處于過度興奮狀態(tài)而出現(xiàn)中毒癥狀。

現(xiàn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要包括儀器檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法，其中免疫檢測(cè)法由于具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)周期短、適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。

有機(jī)磷在結(jié)構(gòu)上大體可以分為兩類，甲氧基有機(jī)磷（ch3o）2p（x）y和乙氧基有機(jī)磷（c2h5o）2p（x）y，x代表o或s，y代表一系列化學(xué)結(jié)構(gòu)。在實(shí)際使用過程中，并不能在第一時(shí)間了解到需要檢測(cè)的農(nóng)藥是哪一種或者哪一小類農(nóng)業(yè)的殘留。

因?yàn)槭艿骄窒尢禺愋缘乃季S定勢(shì)的限制，本領(lǐng)域現(xiàn)有的免疫分析技術(shù)長(zhǎng)期以來通常是特定針對(duì)甲氧基有機(jī)磷或者特定針對(duì)乙氧基有機(jī)磷的特異性檢測(cè)，或者針對(duì)甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥的其中一種農(nóng)藥的免疫法檢測(cè)，也就是說，免疫分析方法只適用于一種或某一小類農(nóng)藥的檢測(cè)，難以滿足高通量、多殘留的檢測(cè)需要，在抗原的設(shè)計(jì)上應(yīng)使其更具有通用性，避免無用的重復(fù)勞動(dòng)。因此開發(fā)一種具有多特性有機(jī)磷的快速檢測(cè)方法具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有有機(jī)磷農(nóng)藥殘留免疫分析方法的技術(shù)

不足，提供一種有機(jī)磷半抗原ⅰ，所述有機(jī)磷半抗原ⅰ可應(yīng)用于制備有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種有機(jī)磷半抗原ⅱ，所述有機(jī)磷半抗原ⅱ可應(yīng)用于制備有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

本發(fā)明要解決的還一技術(shù)問題是提供所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的制備方法。

本發(fā)明還一要解決的技術(shù)問題是提供所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

提供一種應(yīng)用于制備有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的有機(jī)磷半抗原ⅰ，其具有式（?。┧镜慕Y(jié)構(gòu)：

（?。?。

本發(fā)明同時(shí)提供所述有機(jī)磷半抗原ⅰ的制備方法，包括以下步驟：

s01.于冰水浴中，向三氯硫磷中緩慢滴加無水甲醇，進(jìn)行反應(yīng)，然后將反應(yīng)液倒入冰水中振搖兩次，取下層有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，產(chǎn)物冷藏備用；

s02.于冰水浴下，向粉狀氫氧化鈉和無水甲醇混合液中緩慢滴加步驟s01制備的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)；待反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入冷鹽酸振搖一次，用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，產(chǎn)物冷藏備用；

s03.于冰水浴下，將對(duì)羥基苯甲酸和氫氧化鈉溶于甲醇，攪拌待完全溶解后，緩慢滴加步驟s02制備的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)；待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，稀釋，調(diào)節(jié)ph值為強(qiáng)堿性，然后用二氯甲烷萃取，取水相調(diào)ph至強(qiáng)酸性，然后用乙酸乙酯萃取，水洗，取有機(jī)相進(jìn)行濃縮干燥，然后過柱，即制得有機(jī)磷半抗原ⅰ。

優(yōu)選地，步驟s01所述三氯硫磷和無水甲醇的質(zhì)量比按照1:50確定。

優(yōu)選地，步驟s02所述氫氧化鈉和無水甲醇的質(zhì)量比按照1:50確定。

優(yōu)選地，步驟s02所述氫氧化鈉和無水甲醇的混合液與s01制備的產(chǎn)物的質(zhì)量比按照1:250確定。

優(yōu)選地，步驟s02所述冷鹽酸的濃度為1mol/l。

優(yōu)選地，步驟s03中，對(duì)羥基苯甲酸、氫氧化鈉、甲醇和步驟s02制備的產(chǎn)物的質(zhì)量比按照1:4:50:1.2確定。

優(yōu)選地，步驟s03是用質(zhì)量濃度10%氫氧化鈉調(diào)ph值為9。

優(yōu)選地，步驟s03是用1mol/l鹽酸溶液調(diào)ph值為3左右。

提供一種應(yīng)用于制備有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的有機(jī)磷半抗原ⅱ，其具有式（ⅱ）所示的結(jié)構(gòu)：

（ⅱ）。

本發(fā)明同時(shí)提供所述有機(jī)磷半抗原ⅱ的制備方法，包括以下步驟：

s11.于冰水浴中，向三氯硫磷中緩慢滴加無水乙醇，進(jìn)行反應(yīng)，然后將反應(yīng)液倒入冰水中振搖兩次，取下層有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，產(chǎn)物冷藏備用。

s12.于冰水浴下，向氫氧化鈉和無水乙醇混合液中緩慢滴加步驟s04制備的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入冷稀鹽酸振搖一次，然后用水洗一次，最后用無水硫酸鈉干燥，產(chǎn)物冷藏備用。

s13.于冰水浴下，向?qū)αu基苯甲酸和氫氧化鈉混合液中，加入無水乙醇，慢慢溶清，然后緩慢滴加步驟s04制備的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)；待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，稀釋，調(diào)節(jié)ph值為強(qiáng)堿性，然后用二氯甲烷萃取，取水相調(diào)ph至強(qiáng)酸性，然后用乙酸乙酯萃取，水洗，取有機(jī)相進(jìn)行濃縮干燥，然后過柱，即制得有機(jī)磷半抗原ⅱ。

優(yōu)選地，步驟s11所述三氯硫磷和無水乙醇的質(zhì)量比按照1:50確定。

優(yōu)選地，步驟s12所述氫氧化鈉和無水乙醇的質(zhì)量比按照1:50確定。

步驟s12所述氫氧化鈉和無水乙醇的混合液與s11制備的產(chǎn)物的質(zhì)量比按照1:250確定。

優(yōu)選地，步驟s13中，對(duì)羥基苯甲酸、氫氧化鈉、乙醇和步驟s11制備的產(chǎn)物的質(zhì)量比按照1:4:50:1.2確定。

優(yōu)選地，步驟s13是用質(zhì)量濃度10%氫氧化鈉調(diào)ph值為9。

優(yōu)選地，步驟s13是用1mol/l鹽酸溶液調(diào)ph值為3左右。

提供一種有機(jī)磷寬譜多特異性抗原，其具有式（ⅲ）所示的結(jié)構(gòu)：

（ⅲ）。

優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清蛋白。

本發(fā)明提供所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的制備方法，是采用活潑酯法將有機(jī)磷半抗原ⅰ和載體蛋白先進(jìn)行偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)后的產(chǎn)物繼續(xù)通過活潑酯化法與有機(jī)磷半抗原ⅱ進(jìn)行偶聯(lián)，制備獲得有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

具體地，所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的制備方法，包括以下步驟：

s1.將有機(jī)磷半抗原ⅰ溶于dmf中，形成混合溶液，然后加入edc和nhs于室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加入到載體蛋白的磷酸鹽緩沖溶液中，于室溫下繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于室溫下透析，即制得有機(jī)磷完全抗原ⅰ；

s2.將有機(jī)磷半抗原ⅱ溶于dmf中，形成混合溶液，然后加入edc和nhs，于室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)；

s3.將步驟s1制得的有機(jī)磷抗原ⅰ溶于dmf溶液中，然后加入步驟s2制備的反應(yīng)液，于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行透析，即制得所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

優(yōu)選地，步驟s1所述有機(jī)磷半抗原ⅰ與載體蛋白的質(zhì)量比為12:1。

優(yōu)選地，步驟s1所述有機(jī)磷半抗原ⅰ與edc和nhs的反應(yīng)時(shí)間為8～24h。

優(yōu)選地，步驟s1所述有機(jī)磷半抗原ⅰ與載體蛋白的反應(yīng)時(shí)間為6～24h。

優(yōu)選地，步驟s2所述反應(yīng)時(shí)間為8～12h。

優(yōu)選地，步驟s3所述有機(jī)磷半抗原ⅱ與有機(jī)磷半抗原ⅰ的質(zhì)量比為13.5:1。

優(yōu)選地，步驟s3所述反應(yīng)時(shí)間為6～8h。

上述制備方法中，dmf、edc和nhs的質(zhì)量比按照10:2:1確定。

上述制備方法中，載體蛋白的磷酸鹽緩沖溶液的組成為50mgbsa用6mlpbs溶解后再加入3.75mldmf，用量為50mg。

本發(fā)明同時(shí)提供采用所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原制備得到的有機(jī)磷寬譜多特異性抗體。

本發(fā)明提供所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原和所述抗體在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明打破本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來局限的特異性觀念，提供了一種有機(jī)磷寬譜多特異性的免疫分析思路，針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥，實(shí)現(xiàn)通用寬譜多特異性檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明同時(shí)提供了兩種半抗原，并提供了所述半抗原的制備方法，基于所述兩種半抗原，非常簡(jiǎn)單易行地制備得到所述有機(jī)磷寬譜多特異性抗原，為本發(fā)明檢測(cè)有機(jī)磷打下技術(shù)基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供了一種新的有機(jī)磷寬譜多特異性抗原，基于所述抗原，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明制備方法條件溫和，易于推廣。

附圖說明

圖1有機(jī)磷半抗原ⅰ的制備路線圖。

圖2有機(jī)磷半抗原ⅰ的質(zhì)譜圖。

圖3有機(jī)磷半抗原ⅱ的制備路線圖。

圖4有機(jī)磷半抗原ⅱ的質(zhì)譜圖。

圖5乙基對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明方法。下述實(shí)施例僅用于示例性說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的生物材料、試劑原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。

實(shí)施例1半抗原ⅰ的制備

有機(jī)磷半抗原ⅰ的制備路線見圖1所示。

s01.60ml三氯硫磷于冰水浴下攪拌10min，然后緩慢滴加100ml無水甲醇，進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中振搖兩次，取下層有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，得o-甲基硫代磷酰氯；

s02.取2.7g氫氧化鈉，13.6ml甲醇，于冰水浴下攪拌15min，然后緩慢滴加10gs01所得o-甲基硫代磷酰氯，待反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入冷稀鹽酸振搖一次，水洗一次，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。

s03.取2g對(duì)羥基苯甲酸，1.16g氫氧化鈉，于冰水浴下攪拌5min，然后加入30ml甲醇，慢慢溶清。然后緩慢滴加2.8g二甲氧基硫代磷酰氯，反應(yīng)1h。待反應(yīng)結(jié)束后，濃縮反應(yīng)液，然后加水進(jìn)行稀釋，用10%氫氧化鈉調(diào)ph至9左右，然后用二氯甲烷萃取，取水相用鹽酸溶液調(diào)ph至3左右，然后用乙酸乙酯萃取，水洗，取有機(jī)相進(jìn)行濃縮干燥，然后過柱，即制得有機(jī)磷半抗原ⅰ。有機(jī)磷半抗原ⅰ的質(zhì)譜圖如圖2所示。證明其具有式（?。┧镜慕Y(jié)構(gòu)為：

（ⅰ）。

實(shí)施例2半抗原ⅱ的制備

有機(jī)磷半抗原ⅱ的制備路線見圖3所示。

s01.60ml三氯硫磷于冰水浴下攪拌10min，然后緩慢滴加100ml無水乙醇，進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中振搖兩次，取下層有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。二甲氧基硫代磷酰氯

s02.取2.7g氫氧化鈉，13.6ml乙醇，于冰水浴下攪拌15min，然后緩慢滴加10g二乙氧基硫代磷酰氯，待反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入冷稀鹽酸振搖一次，水洗一次，再用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。

s03.取2g對(duì)羥基苯甲酸，1.16g氫氧化鈉，于冰水浴下攪拌5min，然后加入30ml甲醇（乙醇），慢慢溶清。然后緩慢滴加2.8g二甲氧基（乙氧基）硫代磷酰氯，反應(yīng)1h。待反應(yīng)結(jié)束后，濃縮反應(yīng)液，然后加水進(jìn)行稀釋，用10%氫氧化鈉調(diào)ph至9左右，然后用二氯甲烷萃取，取水相用鹽酸溶液調(diào)ph至3左右，然后用乙酸乙酯萃取，水洗，取有機(jī)相進(jìn)行濃縮干燥，然后過柱，即制得有機(jī)磷半抗原ⅱ。有機(jī)磷半抗原ⅱ的質(zhì)譜圖見圖4所示。證明其具有式（ⅱ）所示的結(jié)構(gòu)為：

（ⅱ）。

實(shí)施例3有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的制備

s1.稱取實(shí)施例1制得的有機(jī)磷半抗原ⅰ26mg溶于1mldmf中，攪拌加入36mgedc和25mgnhs，于室溫下攪拌反應(yīng)8h。待反應(yīng)結(jié)束后，取0.25ml反應(yīng)液加入到50mgph7.4的bsa磷酸鹽緩沖溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)6h。將反應(yīng)液裝入透析袋中，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3d，每天換透析液2～3次，制得有機(jī)磷完全抗原ⅰ。

s2.稱取實(shí)施例2制得的有機(jī)磷半抗原ⅱ26mg溶于1mldmf中，攪拌加入36mgedc和25mgnhs，室溫下攪拌反應(yīng)8h。

s3.將有機(jī)磷完全抗原ⅰ溶于5mldmf溶液中；取0.25ml步驟s2所得反應(yīng)液加入到有機(jī)磷完全抗原ⅰ的dmf溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)6h后，將反應(yīng)液裝入透析袋，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3d，每天換液2～3次，即制得有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

實(shí)施例4有機(jī)磷寬譜多特異性抗原的制備

s1.稱取實(shí)施例1制得的有機(jī)磷半抗原ⅰ26mg溶于1mldmf中，攪拌加入36mgedc和25mgnhs，于室溫下攪拌反應(yīng)12h。待反應(yīng)結(jié)束后，取0.25ml反應(yīng)液加入到50mgph7.4的bsa磷酸鹽緩沖溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)8h。將反應(yīng)液裝入透析袋中，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3d，每天換透析液2～3次，制得有機(jī)磷完全抗原ⅰ。

s2.稱取實(shí)施例2制得的有機(jī)磷半抗原ⅱ26mg溶于1mldmf中，攪拌加入36mgedc和25mgnhs，室溫下攪拌反應(yīng)12h。

s3.將有機(jī)磷完全抗原ⅰ溶于5mldmf溶液中；取0.25ml步驟s2所得反應(yīng)液加入到有機(jī)磷完全抗原ⅰ的dmf溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)6h后，將反應(yīng)液裝入透析袋，用ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3d，每天換液2～3次，即制得有機(jī)磷寬譜多特異性抗原。

將實(shí)施例3和實(shí)施例4制得的有機(jī)磷寬譜多特異性抗原采用紫外全波長(zhǎng)掃描來證明本發(fā)明所述的有機(jī)磷寬譜多特異性抗原具有式（ⅲ）所示的結(jié)構(gòu)：

（ⅲ）。

實(shí)施例5抗體的制備及鑒定

本實(shí)施例所述抗體制備方法參照本領(lǐng)域常規(guī)。

將有機(jī)磷寬譜多特異性免疫原與等劑量的免疫佐劑混合（第1次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強(qiáng)免疫軍用弗氏不完全佐劑），用攪拌器完全乳化后，背部多點(diǎn)免疫健康大白兔，以后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，利用間接elisa測(cè)定血清效價(jià)和抑制率，待效價(jià)穩(wěn)定后，再加強(qiáng)免疫一次。最后一次免疫后10天心臟采血，離心保留血清。采用辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)血清進(jìn)行純化得到高特異性的抗體。

實(shí)施例6酶聯(lián)免疫方法的建立

通過方陣滴定法確定抗原和抗體的工作濃度，包被原的工作濃度為0.5μg/ml，有機(jī)磷抗體的稀釋倍數(shù)為1/40000。

用不同濃度的有機(jī)磷溶液做實(shí)驗(yàn)溶液，梯度稀釋下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，采用9組平行實(shí)驗(yàn)（n=3）。

間接競(jìng)爭(zhēng)性elisa方法：用上述工作濃度的包被酶標(biāo)板，將實(shí)驗(yàn)溶液與抗體溶液同時(shí)加入到酶標(biāo)板小孔中，同時(shí)設(shè)置空白孔和陰性對(duì)照孔，37℃溫育40min，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打：加入稀釋好的酶標(biāo)二抗溶液，37℃溫育20min，用洗滌液洗滌5次，拍干：加入底物顯色溶液，37℃溫育10min，加入終止液終止顯色，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光值od，以吸光值od為縱坐標(biāo)，以ops實(shí)驗(yàn)溶液濃度的log10值為橫坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見附圖5所示有機(jī)磷elisa競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(乙基對(duì)硫磷為例)。

結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有完整的反s形狀，并且有上平臺(tái)和下平臺(tái)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行測(cè)定次數(shù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差卻在15%以內(nèi)。

由同樣的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其它有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢測(cè)限(lod值)、半數(shù)抑制量(ic50值）、線性范圍見表1所示。從表1的檢測(cè)結(jié)果可以說明本發(fā)明方法準(zhǔn)確度和靈敏度很好，可用于農(nóng)產(chǎn)品和食品樣品中有機(jī)磷的檢測(cè)，實(shí)際使用中非常方便快捷。

表1本發(fā)明抗原、抗體檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢測(cè)限、半數(shù)抑制量和線性范圍值