本發(fā)明屬于醫(yī)藥合成技術領域，具體涉及一種具有三氮唑環(huán)結(jié)構免疫抑制藥物的合成方法。
背景技術：
鞘脂類是生物膜的重要組成成分，具有保護細胞內(nèi)物資的作用。近年來，隨著生物技術的發(fā)展以及人類疾病譜的復雜化，人類對鞘脂類的認識不斷深入。現(xiàn)在認為，鞘脂類不僅是生物膜的重要組成成分，同時還在細胞生命活動信號傳導中發(fā)揮重要作用。鞘氨醇-1-磷酸(s1p)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的生物活性脂類，廣泛存在于血液、淋巴液，紅細胞、中性粒細胞、血小板細胞在形成s1p的同時，可經(jīng)s1p磷酸化酶作用脫去磷酸基生成鞘氨醇，也可經(jīng)s1p裂解酶不可逆地分解為磷脂酰乙醇胺和棕櫚醛，從而保證了人體生理環(huán)境中s1p的動態(tài)平衡。s1p即可作為第二信使直接作用于細胞內(nèi)靶標，也可經(jīng)轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到細胞外與相應的受體結(jié)合，激活一系列下游信號通路產(chǎn)生重要生理功能，如細胞的增殖、遷移、存活、凋亡和細胞通訊等，參與免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、同種異體移植反應、糖代謝調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)等多種生理功能。近年來，基于s1p信號通路的藥物研發(fā)已成為自身免疫疾病、腫瘤等相關領域的研究熱點。在免疫系統(tǒng)中，抑制sphk激活能顯著或者甚至完全阻斷促炎物質(zhì)引起的細胞反應，如ca2+的代謝、脫顆粒、趨化性和細胞因子的分泌。此外，s1p還可通過與細胞表面的s1p受體結(jié)合，使受體內(nèi)陷，誘導淋巴細胞回巢，抑制淋巴細胞自外周淋巴結(jié)及次級淋巴器官的外流，阻止淋巴細胞到達炎性損害或抑制物的位置，具有免疫調(diào)控作用。s1p信號通路參與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，如多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等。例如，芬戈莫德(fingolimod,fty720)是首個發(fā)現(xiàn)的前藥類s1p1激動劑，在體內(nèi)被shpk2磷酸化，成為活性磷酸酯形式fty720-p，繼而通過結(jié)合于t、b淋巴細胞表面的s1p1受體，導致受體發(fā)生內(nèi)陷以及后續(xù)的泛素化降解，造成淋巴細胞膜表面的s1p1缺失狀態(tài)，從而使淋巴細胞不能流出次級淋巴器官進入外周血液循環(huán)。fty720正是通過這種獨特的誘導淋巴細胞“歸巢”作用，在不殺傷淋巴細胞的情況下，發(fā)揮免疫抑制效應，因此在自身免疫型疾病以及器官移植排斥反應等方面的治療應用備受關注。我們計算機輔助設計研究發(fā)現(xiàn)了具有三氮唑結(jié)構的新型化合物，該化合物具有與fty720類似的s1p1激動劑效果，我們研究了該新型化合物的合成方法，并且進行了對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時間進行研究。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術問題是提供了一種操作簡單易行、原料廉價易得、反應效率較高且結(jié)構新穎的一種具有三氮唑環(huán)結(jié)構免疫抑制藥物的合成方法。
本發(fā)明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種具有三氮唑環(huán)結(jié)構免疫抑制藥物的合成方法，其特征在于其分子結(jié)構為：
本發(fā)明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種具有三氮唑環(huán)結(jié)構免疫抑制藥物的合成方法，其特征在于具體步驟為：
a、氰基乙酸在羰基還原催化劑作用下與氨水發(fā)生反應生成3-氨基丙烯腈；
b、乙烯基乙醚和三氟乙酸在吡啶和五氯化磷作用下生成4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮；
c、3-氨基丙烯腈與4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮發(fā)生取代反應得到2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽；
d、2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽在dcc和亞磷酸作用下自身成環(huán)得到6-(三氟甲基)煙腈；
e、6-(三氟甲基)煙腈被氧化生成羧基后繼續(xù)與氨水反應得到得到6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺；
f、2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚先與甲基磺酰氯發(fā)生取代反應活化羥基，再與(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇發(fā)生取代反應生成(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒；
f、2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚先與甲基磺酰氯發(fā)生取代反應活化羥基，再與(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇發(fā)生取代反應生成(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒；
g、(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒先于氯化亞砜反應生成酰氯化合物，再與6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺在堿性條件下發(fā)生取代反應，最后縮合成環(huán)得到化合物(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑；
h、(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑水解得到(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇。
進一步限定，步驟a的具體過程為：在反應瓶里加入氰基乙酸和甲醇，再加入羰基還原催化劑nabh(oac)3，氮氣保護反應體系，緩慢滴加氨水，滴加過程中控制溫度不超過60℃，滴加結(jié)束后加熱回流反應，tlc監(jiān)控原料反應完全，過濾反應液，加入二氯甲烷萃取，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，直至水相ph＝8，水洗2次，有機相干燥，旋蒸除溶劑得3-氨基丙烯腈。
進一步限定，步驟b的具體過程為：在反應瓶中依次加入乙烯基乙醚、吡啶和二氯甲烷。在三口瓶里加入五氯化磷，冰鹽浴恒壓漏斗中過夜滴加三氟乙酸，滴加完畢后于室溫下攪拌反應。反應體系用水洗，10％鹽酸洗，飽和碳酸氫鈉溶液洗，干燥，抽濾，得粗品，重結(jié)晶得4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮。
進一步限定，步驟c的具體過程為：在反應瓶中依次加入3-氨基丙烯腈、4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮和甲苯。加熱回流反應一段時間后趁熱加入正己烷，再加入一定量的稀鹽酸，析出固體。冰浴下攪拌1h，抽濾、烘干得2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽。
進一步限定，步驟d的具體過程為：在反應瓶中加入2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽和dcc，dmso作為反應溶劑，氮氣保護反應體系，再加入亞磷酸，于室溫下攪拌反應一定時間。在反應體系中加水，用甲苯萃取，合并有機相，水洗兩次，飽和食鹽水洗一次，干燥有機相，旋蒸得到紅褐色液體6-(三氟甲基)煙腈。
進一步限定，步驟e的具體過程為：在反應瓶里加入水，硫酸和冰醋酸，緩慢加入6-(三氟甲基)吡啶甲酸?；亓鬟^夜反應。降溫，加入冰塊，并用冰鹽水冷卻，在0℃條件下向反應液中緩慢滴加氨水溶液，使溫度不超過0℃，滴加過程中逐漸由大量固體析出，抽濾烘干得到6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺。
進一步限定，步驟f的具體過程為：在反應瓶中，把4-二甲氨基吡啶，2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚和三乙胺加入甲苯中，在20℃條件下緩慢滴加溶有甲基磺酰氯的甲苯溶液；滴加完后反應2h，先用水洗滌一次，再用水和1n的鹽酸溶液的混合溶液洗滌一次，最后用水和飽和碳酸氫鈉的混合溶液洗滌一次；有機相濃縮后得到黃色油狀液體，全部加入dmf中，再加入(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇，最后加入碳酸鉀，在120℃條件下反應3h，冷卻至室溫后加入甲基叔丁基醚，再用水洗滌三次，有機相濃縮后得到黃色液體；再加入正庚烷1000ml，在25℃條件下攪拌，有大量固體析出，抽濾烘干后得到白色固體(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒。
進一步限定，步驟g的具體過程為：在反應瓶中，加入(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒和甲苯；在20℃條件下滴加氯化亞砜，約20min滴加完全，再攪拌反應30min后在50℃條件下真空抽濾反應液，排出未反應完的氯化亞砜；加入6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺和三乙胺的甲苯混合液，在不超過30℃條件下約20min滴加完全；繼續(xù)反應15min后加熱至回流，通過分水器分出反應過程中生成的水，反應3h后真空濃縮反應液，得到黃色液體品(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑。
進一步限定，步驟h的具體過程為：在30l反應器中加入(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑和乙醇，加熱到45℃，再加入1nhcl；反應3h緩慢滴加濃度為32％的氫氧化鈉溶液，使反應液ph達到中性，滴加完后濃縮反應液，再加入乙酸乙酯萃取，并用水洗滌兩次，有機相濃縮后得到產(chǎn)品(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇。
進一步限定，步驟h中所得到產(chǎn)物的具體應用為：通過小鼠皮膚移植后皮片成活檢測發(fā)現(xiàn)(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇具有良好的免疫抑制活性。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1
在2000ml反應瓶里加入氰基乙酸170g(2mol)和甲醇200ml，再加入羰基還原催化劑nabh(oac)310g，氮氣保護反應體系，緩慢滴加氨水800ml，滴加過程中控制溫度不超過60℃，滴加結(jié)束后加熱回流反應，tlc監(jiān)控原料反應完全，過濾反應液，加入二氯甲烷500ml萃取反應液兩次，合并有機相，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，直至水相ph＝8，再用水洗2次，有機相干燥，旋蒸除溶劑得3-氨基丙烯腈125g，收率為92％。
實施例2
在10l的三口瓶中依次加入乙烯基乙醚375.9g(5.23mol)、吡啶826.8g、二氯甲烷5000ml。在三口瓶里加入五氯化磷1084.2g，冰鹽浴恒壓漏斗中過夜滴加三氟乙酸444.6g(3.89mol)，滴加完畢后于室溫下攪拌反應48h。反應體系用水洗，10％鹽酸洗，飽和碳酸氫鈉溶液洗，干燥，抽濾，得粗品，重結(jié)晶得純品4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮602.0g，收率為92.1％。
實施例3
在10l的三口瓶中依次加入3-氨基丙烯腈136g(2mol)、4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮370g(2.2mol)和甲苯1800ml。加熱回流反應48h,趁熱加入正己烷3900ml，再加入稀鹽酸溶液1000ml，冷卻后析出固體。冰浴下攪拌1h，抽濾、烘干得2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽410g，收率為91％。
實施例4
在10l的三口瓶中依次加入2–(氨基亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈鹽酸鹽450g(2.0mol)、dcc400g(2mol)和dmso1000ml攪拌反應。在氮氣保護下，緩慢滴加溶有亞磷酸20g的dmso100ml，于室溫下攪拌反應2h，tlc監(jiān)控原料反應完全。在反應體系中加水10l，用甲苯萃取，合并有機相，水洗兩次，飽和食鹽水洗一次，干燥有機相，旋蒸得到紅褐色液體6-(三氟甲基)煙腈300g，收率為88％。
實施例5
在10l的三口瓶里加入水1420g,硫酸2440g,冰醋酸150ml，緩慢加入6-(三氟甲基)煙腈870g(5mol)?；亓鬟^夜反應。降溫，加入冰塊，并用冰鹽水冷卻，在0℃條件下向反應液中緩慢滴加氨水溶液，使溫度不超過0℃，滴加過程中逐漸由大量固體析出，抽濾烘干得到6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺。
實施例6
在反應瓶中，把4-二甲氨基吡啶dmap(12g，0.1mol)，2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚(161g，1.0mol)，和三乙胺(133ml，1.0mol)加入甲苯300ml中，在20℃條件下緩慢滴加溶有甲基磺酰氯(114g，1.0mol)的甲苯溶液250ml；滴加完后反應2h，先用水200ml洗滌一次，再用水130ml和1n的鹽酸溶液70ml的混合溶液洗滌一次，最后用水130ml和飽和碳酸氫鈉70ml的混合溶液洗滌一次；有機相濃縮后得到黃色油狀液體，全部加入dmf500ml中，再加入(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇(158g，1.2mol)，最后加入碳酸鉀(276g，2.0mol)，在120℃條件下反應3h，冷卻至室溫后加入甲基叔丁基醚1000ml，再用水1000ml洗滌三次，有機相濃縮后得到黃色液體；再加入正庚烷1000ml，在25℃條件下攪拌，有大量固體析出，抽濾烘干后得到白色固體(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒286g，收率為92.8％；1hnmr(d6-dmso):9.46(s,1h),7.36(m,2h),5.69(s,2h),4.42(m,1h),4.11(m,1h),3.80(m,1h),2.63(m,2h),2.25(s,3h),1.35(d,j＝18hz,6h),1.17(t,j＝7.5hz,3h),ms(esi)m/z:309.4(m+h+).
實施例7
在反應瓶中，加入(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒(616g，2.0mol)和甲苯2000ml；在20℃條件下滴加氯化亞砜(240g，2.0mol)，約20min滴加完全，再攪拌反應30min后在50℃條件下真空抽濾反應液，排出未反應完的氯化亞砜；加入6-(三氟甲基)吡啶甲酰胺(440g，2.0mol)和三乙胺(400g，4.0mol)的甲苯混合液2000ml，在不超過30℃條件下約20min滴加完全；繼續(xù)反應15min后加熱至回流，通過分水器分出反應過程中生成的水，反應3h后真空濃縮反應液，得到黃色液體品(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑910g，收率92％；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.3(s,1h),8.58(s,1h),7.84(s,1h),7.20-7.17(m,3h),4.25(d,j＝8.0hz,2h),3.91(t,j＝8.0hz,2h),3.59-3.56(m,2h),2.80(s,1h),215(s,3h),1.27(s,6h),1.25(s,3h).ms(esi)m/z:463.4(m+h+).
實施例8
在反應器中加入(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-三氮唑(980g，2.0mol)和乙醇2000ml，加熱到45℃，再加入1nhcl1500ml；反應3h緩慢滴加濃度為32％的氫氧化鈉溶液，使反應液的ph達到中性，滴加完后濃縮反應液，再加入乙酸乙酯3000ml，用水2000ml洗滌兩次，有機相濃縮后得到產(chǎn)品(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-三氮唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇819g，收率為97％；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.1(s,1h),8.58(s,1h),7.88-7.87(m1h),7.20-7.17(m,3h),4.21(d,j＝7.2hz,2h),3.98(t,j＝7.2hz,2h),3.81(s,1h),3.59-3.56(m,2h),2.80(s,2h),215(s,3h),1.25(s,3h),.ms(esi)m/z:423.4(m+h+).
實施例9
目標化合物對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時間的影響。
取c57bl/6小鼠及balb/c小鼠各15只，腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后，取背中部靠右側(cè)處作為手術區(qū)；剃去體毛，以75％乙醇消毒，以眼科剪剪除全層皮膚形成1cm*1cm的創(chuàng)面，剪除皮片的筋膜層，以生理鹽水沖洗后作為同種異體皮膚移植備用，將其創(chuàng)面作為移植床。從生理鹽水中取出小鼠背部皮片作為移植物平鋪于植床，用創(chuàng)可貼和醫(yī)用膠布通過胸腹部環(huán)繞包扎，適當加壓，使皮片和植床緊密接觸。c57bl/6小鼠與balb/c小鼠進行雙向移植。將30只小鼠隨機分為3組，皮膚移植溶劑對照組(給予雙蒸水)，目標化合物2及4mg/kg劑量組，灌胃給藥，每日1次，每組c57bl/6小鼠與balb/c各5只(共10只)。每天觀察小鼠皮膚生長情況，直至實驗結(jié)束。術后4天內(nèi)如有皮片移位或脫落則認為手術失敗，不記入實驗數(shù)據(jù)中。術后第6天拆除包扎，逐日觀察移植物顏色、硬度、結(jié)痂和脫落情況，以皮片變黑變硬、結(jié)痂脫落定為排斥終點，記錄移植物生存時間。若植皮與宿主的背部愈合，色澤一致，無炎癥和充血，有毛的皮膚毛發(fā)生長良好，則認為未發(fā)生排斥反應。50％以上皮片結(jié)痂、變硬、壞死、脫落作為排斥標準。在移植后第20天，處理動物結(jié)束實驗，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。實驗結(jié)果以mean±sd表示，并將給藥組與溶劑對照組進行t檢驗。
灌胃給予小鼠目標化合物能夠明顯延長皮片存活時間。對照組皮片存活時間平均為7.2天，而目標化合物2mg/kg劑量組為14.5天，4mg/kg劑量組為17.1天，均較對照組有顯著差異(表1)。
表1目標化合物對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時間的影響
以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。