專利名稱：：大黃素在抗移植排斥免疫抑制藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種藥物的用途。具體的說，涉及大黃素在抗移植排斥免疫抑制藥物中的應用。
背景技術：
：大黃素(Emodin)是一種蒽醌類物質(zhì)，分子式為C,5Hn)05，化學名稱為3-甲基-l，6，8-三羥蒽醌，主要來源于蓼科植物掌葉大黃的根莖，是常用中藥大黃的主要成分，可用常見方法從諸如大黃、鼠李、決明的植物中提取，或采用現(xiàn)有技術進行化學合成。臨床常用于抗菌、抗炎、解痙、止咳、瀉下、抗腫瘤等。由于大黃素是一種用途極為廣泛的藥物，人們對其藥理作用進行了廣泛的研究，近期研究發(fā)現(xiàn)，大黃素對免疫系統(tǒng)有雙向的調(diào)節(jié)作用，大黃素可通過抑制LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細胞分泌TNFa，抑制過度的炎癥反應；而對于未經(jīng)LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細胞，大黃素可促進TNFa的分泌。另外還有研究顯示大黃素對巨嗜細胞和淋巴細胞也有作用，但將大黃素抑制免疫反應的作用機制還不清楚，也沒有將大黃素作為抗移植排斥免疫抑制藥物的應用?，F(xiàn)有的免疫抑制劑主要有環(huán)孢素A(CsA)、腎上腺皮質(zhì)激素、雷帕霉素等，大多具有明顯的不良反應，如腎毒性，對細胞的非特異性等，而且價格較高，增加病人的經(jīng)濟負擔。中藥的應用在我國有兩千多年的歷史，來源豐富，價格低廉，副作用小，利用中藥及其有效成分預防和治療器官移植后的排斥反應是抗移植排斥藥物的可行方向。樹突狀細胞(dendriticcell,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，是目前已知的唯一能激活幼稚T細胞的抗原遞呈細胞，能調(diào)節(jié)T淋巴細胞、B淋巴細胞的功能，處于啟動、調(diào)控并維持特異性免疫應答的中心環(huán)節(jié)。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells，Treg)是機體維持自身耐受的重要組成部分。CD4+CD25+Treg細胞是調(diào)節(jié)性T細胞中最為重要的一群，其主要功能是抑制自身反應性T細胞，并且其作用是通過直接的Treg-T效應細胞之間的相互接觸方式來實現(xiàn)的。CD4+CD25+Treg細胞可分泌多種抑制性細胞因子，在免疫相關性疾病、腫瘤免疫和抗感染免疫等方面具有重要意義。Trl，Th3等細胞也歸屬于調(diào)節(jié)性T細胞。調(diào)節(jié)性T細胞涉及抗感染免疫、腫瘤免疫、移植免疫、變態(tài)反應等許多病理性免疫過程，對于維持機體免疫自穩(wěn)、防止自身免疫病具有極其重要的作用，因此也常常應用在判斷和調(diào)節(jié)器官移植的抑制免疫排斥治療中。本發(fā)明人通過研究大黃素在特征免疫應答中對樹突狀細胞的作用，以及大黃素對調(diào)節(jié)性T細胞的增殖作用，提出大黃素作為免疫抑制劑的應用，特別是在器官移植藥物中的應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供大黃素在抗移植排斥免疫抑制藥物中的應用。本發(fā)明使用的大黃素可以巿購，也可以釆用常見方法，從大黃、何首烏、鼠李等含有大黃素的中藥提取，還可以用化學合成法制備。本發(fā)明人對大黃素的藥理作用進行了研究，通過對健康人外周血樹突狀細胞(DC)的分離及培養(yǎng)，并探討在DC體外轉化過程中大黃素的作用，發(fā)現(xiàn)大黃素可參與對DC成熟及免疫刺激能力的調(diào)節(jié)，大黃素的刺激可抑制人DC的分化及成熟，從而抑制免疫應答，達到免疫耐受，另外，本發(fā)明人還通過動物實驗考察大黃素對調(diào)節(jié)性T細胞的作用，發(fā)現(xiàn)大黃素對調(diào)節(jié)性T細胞的增殖有作用，而且與其它免疫抑制藥物聯(lián)用，，對調(diào)節(jié)性T細胞的增殖效果更為明顯?；谏鲜鏊幚碜饔?，本發(fā)明人預計大黃素可以用作免疫抑制劑，特別是作為一種抗排斥藥物應用于器官移植病人的術后治療。為證實此預計，本發(fā)明人探討大黃素預防大鼠肝移植后排斥反應的效果。(1)以Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者，建立大鼠原位肝移植模型將肝移植大鼠模型隨機分組，觀察不同劑量大黃素對大鼠存活時間的影響；另取肝移植大鼠模型，考察施用大黃素時間的不同對大鼠存活時間的影響。(2)以Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者，建立大鼠腎移植模型，隨機分組，考察施用CsA或大黃素對調(diào)節(jié)性T細胞的作用，以及施用大黃素后對大鼠存活時間的影響。本發(fā)明人還聯(lián)合應用大黃素和其它具有免疫抑制功能的藥物治療器官移植排斥反應，結果證明大黃素可與具有相似功能的有效成分聯(lián)合使用，所以本發(fā)明涉及的大黃素在抗移植排斥藥物的應用中，除了單獨應用大黃素以外，還可以將大黃素與一種或多種具有相同或相似功能的有效成分聯(lián)合應用。本發(fā)明提供的大黃素在抗移植排斥藥物的應用，還包括以常見方法，將大黃素與適當?shù)乃幱幂d體制成常見的藥物類型，應用于抗器官移植排斥反應。選擇適當?shù)乃幱幂d體，可制成口服劑型，外用劑型，栓劑和無菌注射溶液等。藥用載體可以是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，赤蘚醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯基吡咯烷酮，水，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸鎂或礦物油等。大黃素的劑量可根據(jù)病人的狀態(tài)或體重，劑型，給藥途徑和施用周期的變化而變化，可適當?shù)赜杀绢I域普通技術人員決定。例如，大黃素可以0.0001到1000mg/kg/d的量施用，優(yōu)選0,001到1000mg/kg/d，最優(yōu)選50mg/kg/d，可以一天一次施用，也可以一天分次施用。本發(fā)明將大黃素用于抗移植排斥藥物，可降低排斥的不良反應，延長移植受者生存時間，并具有價格低，如進行臨床應用可有效減輕患者的經(jīng)濟負擔的優(yōu)點。圖l健康人樹突狀細胞經(jīng)大黃素作用前后DC表面分子表達的流式分析。圖2健康人樹突狀細胞經(jīng)大黃素作用前后DC分泌IL-12p70及IL-10水平比較。圖3大黃素刺激組與未刺激組的DC刺激同種異體T淋巴細胞，其增殖能力分析。圖4大黃素促進腎移植大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細胞增多，并增強其免疫抑制的功能的說明。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中使用的主要試劑和儀器的來源大黃素(標準品)由陜西省西安藥品檢驗所提供；重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重組人白細胞介素4(rh-IL-4)由廈門特寶公司提供；FITC或PE標記的CD14，CD83、CD86、CD80、HLA-DR、CD3標記抗體購于英國Caltag公司；AIM-V培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；人IL-12p70,IL-10ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)購于Uctech公司；Ficoll-Hypaque淋巴細胞分層液購于美國AmershamBiosciences公司，流式細胞儀(美國BD公司)，實驗動物均由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。實施例l樹突狀細胞的體外培養(yǎng)和大黃素對其表面分子表達的作用靜脈抽取健康成人外周血50m1/人，EDTA-K3抗凝，用Ficoll-Hypaque分離PBMC,以完全的RPMI16々0懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為2xl0Vml，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml，37°C，5%C02孵箱培養(yǎng)2h，使其中的單核細胞貼壁，用溫熱的無血清的RPMI1640液輕輕洗培養(yǎng)板以去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞，在培養(yǎng)板中加入含rhGM-CSF1000IU/ml、rh-IL-4800IU/ml的AIM-V培養(yǎng)基，置于37'C5%C02孵箱中，隔天半量更換培養(yǎng)液。在培養(yǎng)的第3及第5天，每孔加入LPS(lug/ml)，將其分為兩組，分別為大黃素作用組和未作用組，在培養(yǎng)的第7天，在大黃素作用組中加入100ug/ml的大黃素，共培養(yǎng)10天。收集懸浮的細胞，該懸浮細胞即為樹突狀細胞，流式檢測HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CDllc、CD3、CD14的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，施用大黃素后，健康人樹突狀細胞表達的CD80、CD86、CD83的陽性率均明顯下調(diào)，與刺激前后相比差異均有顯著性(PO.OOl),具體比較結果見表l和圖l。表1.健康人樹突狀細胞經(jīng)emodin作用前后DC表面分子表達的比較組別例數(shù)HLA-DR+CD80+CD83+CD86+CD14+CDllc—大黃素作用組883.6±6.913.4±6.6*9.3±2.2*84.2±6.3*8.4±2.8*95.5±3.1未加大黃素組688.8±7.839.3±8.6*30.7±5.6*95.4±3.23.7±2.3*93.4±2.9*表示差異有統(tǒng)計學意義(PO.001)大黃素刺激組的DC表型與未刺激組相比，CD80、CD86、CD83的表達顯著降低，CD14的表達顯著升高。CD83是DC成熟的重要標志，在DC行使功能中具有重要作用，病毒感染能下調(diào)CD83的表達，從而抑制機體產(chǎn)生的抗病毒免疫反應；CD14則是單核細胞的特異性分子標記，其表達量髙提示DC轉化欠佳；CD80/CD86為DC表面的免疫共刺激分子，其表達的降低可影響DC的抗原遞呈的功能。結果表明，在大黃素的作用下，健康人外周血單核細胞向DC轉化過程中DC表型和成熟均低于未刺激組。實施例2大黃素對樹突狀細胞分泌IL-12和IL-10的影響按實施例l的方法培養(yǎng)大黃素刺激組和未刺激組樹突狀細胞，收集上清液，用美國R&D公司IL-12p70的ELISA檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70(白細胞介素-12p70)的含量將培養(yǎng)上清液加入96孔板，100pl/孔，室溫，避光作用60min,洗板后，加入辣根過氧化物酶顯色底物，避光，室溫作用5-15分鐘。力口2mol/lH2S04終止液，混勻，即刻以酶標儀測定450nm的吸光度值(OD),以空白孔調(diào)零。以同樣步驟用美國r&d公司il-10的elisa檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中IL-10的含量。釆用MicrosoftExcel2000軟件進行標準曲線的制定，計算出樣本il-12和il-10的濃度。大黃素刺激組及未刺激組體外單個核細胞轉化DC分泌IL-12p70濃度分別為1700.44±1000.21pg/ml、4500.60±1200.6pg/ml，相差有顯著性(p<0.05);大黃素刺激組及未刺激組體外單個核細胞轉化dc分泌IL陽10濃度分別為350.6士150.2pg/ml、230.7士90.1pg/ml,相差有顯著性(po.05)(見圖2)。IL-12是ThO細胞向Thl細胞分化的關鍵細胞因子，也是衡量DC功能的重要指標。結果證明大黃素作用后dc自發(fā)分泌il-12的能力低于未經(jīng)刺激的成人外周血dc，dc自發(fā)分泌il-12的能力的低下則不能有效的拮抗微環(huán)境中IL-4、IL-10的作用，致使Thl方向分化的障礙，在機體抗病毒免疫中不能產(chǎn)生有效的細胞免疫應答，導致免疫耐受的發(fā)生，達到抑制免疫的結果。實施例3t細胞的分離及大黃素對t細胞轉化的影響靜脈抽取健康成人外周血50ml/人，EDTA-K3抗凝。利用密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞，經(jīng)RPMI1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，收集懸浮細胞，將0.5ml的淋巴細胞懸液(細胞濃度為5xlO々ml)加入尼龍毛柱內(nèi)，滴加0.2ml含20%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640封管，置37。C孵育lh,以預溫至37。C，20。/。FCS的rpmi-1640溶液5ml洗柱，再用20ml的上述溶液充分洗去殘留的T細胞。洗下的細胞經(jīng)2000r/m離心10m，計數(shù)并調(diào)整到2xloVml，得到T細胞。其中尼龍毛柱的制法是稱取大約50mg尼龍毛，用0.2mol/L鹽酸浸泡過夜。用大量蒸餾水漂洗，晾干后細致撕句，高壓滅菌，浸泡在Hanks液的平皿中。將尼龍毛填塞于l.Oml注射器中，加滿Hanks液，臨用前用37°C預溫的含20%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640洗柱。DC的培養(yǎng)為，靜脈抽取健康成人外周血50ml/人，EDTA-K3抗凝，用Ficoll-Hypaque分離PBMC，以完全的RPMI1640懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為2xl()6/m1,加入24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml，37°C，5%C02孵箱培養(yǎng)2h,使其中的單核細胞貼壁，用溫熱的無血清的RPMI1640液輕輕洗培養(yǎng)板以去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞，將其分為五組，分別為單獨經(jīng)LPS刺激組，未經(jīng)LPS刺激組，LPS+25ug/ml大黃素組，LPS+100ug/ml大黃素組和LPS+200ug/ml大黃素組，在培養(yǎng)板中加入含rhGM-CSF1000IU/ml、rh-IL-4800IU/ml的AIM-V培養(yǎng)基，置于37'C5%C02孵箱中，隔天半量更換培養(yǎng)液。在培養(yǎng)的第3及第5天，單獨經(jīng)LPS刺激組，LPS+25ug/ml大黃素組，LPS+100ug/ml大黃素組和LPS+200ug/ml大黃素組每孔加入LPS(lug/ml)，在培養(yǎng)的第7天，LPS+25ug/ml大黃素組，LPS+100ug/ml大黃素組和LPS+200ug/ml大黃素組分別加入不同濃度的大黃素(25ug/ml，100ug/ml,200ug/ml)共培養(yǎng)10天。收集各組培養(yǎng)的DC,用含50嗎/ml絲裂霉素C(MMC)37。C作用45分鐘，用RPMI1640培養(yǎng)基充分清洗后。加入96孔圓底培養(yǎng)板，細胞數(shù)為lxloV孔，分別加入同種異體T細胞作為效應細胞，DC和T細胞作用比例為DCK:IO,共培養(yǎng)96小時，PBMC+IL-2(IL-230U/ml，隔天半量換液)組作為陰性對照，氚摻入法測定增殖指數(shù)(SI),每個樣本設三復孔，結果以均值表示。每次實驗均重復三次。結果發(fā)現(xiàn)促異體T淋巴細胞增殖的能力的強弱依次為單獨經(jīng)LPS刺激組〉未經(jīng)LPS刺激組>LPS+25ug/ml大黃素組〉LPS+100ug/ml大黃素組〉LPS+200ug/ml大黃素組〉PBMC+IL-2組(圖3)。對于大黃素作用前后DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力的比較，發(fā)現(xiàn)大黃素作用后DC對促同種異體T細胞增殖的能力明顯低于未經(jīng)大黃素刺激組DC細胞促增殖的能力。實施例4清潔級健康雄性Wistar大鼠作為供者，體重180230g,清潔級健康雄性SD大鼠作為受者，體重220260g，根據(jù)前人研究(陶然.肝移植動物模型〃鄭樹森.肝臟移植.北京:人民衛(wèi)生出版社.2001:140-143),利用改良雙套管法建立大鼠原位肝移植模型。將肝移植大鼠模型隨機分為5組，每組9只，其中3組分別給予大黃素2.0、10.0和50.0mg/kg/d，另夕卜2組分別給予CsA(10.0mg/kg/d)和生理鹽水(0.5ml/d)作為對照，均為腹腔途徑給藥。觀察各組大鼠的存活時間(見表2)。表2肝移植大鼠存活時間比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>比較發(fā)現(xiàn)，使用10.O和50.0mg/kg/d者的存活時間明顯長于生理鹽水對照組(PO.Ol),使用50.0mg/kg/d者的存活時間與CsA對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。實施例5大黃素的給藥時間對存活時間的影響取肝移植大鼠模型分為8組，每組9只，分別為實驗組和相應的對照組，實驗組分別于術前8天至手術當天、術前天至術后4天、術后第卜8天及術后第8-16天腹腔注射給予大黃素50.0mg/kg/d(將大黃素溶于生理鹽水，配制為100.0mg/ml注射液)。觀察各組大鼠的存活時間。術前8天至手術當天用藥者及其不用藥對照組的存活時間分別為(15.3士1.6)天、(15.6士2.2)天，差異無統(tǒng)計學意義；術前4天至術后4天用藥者與其不用藥對照組的存活時間分別為(15.8士1.9)天、(14.8±2.4)天，差異無統(tǒng)計學意義；術后第18天用藥者及其不用藥對照組的存活時間分別為(25.3士3.7)天、(14,8士2.4)天，用藥者存活時間明顯長于對照組(P〈0.01);術后第816天用藥者及其不用藥對照組的存活時間分別為(23.1士3.8)天、(15.3士5.3)天，用藥者存活時間明顯長于對照組(P〈0.01)。結果證明術后開始用藥者的效果明顯優(yōu)于術前用藥。說明大黃素可降低大鼠排斥的不良反應。實施例6用藥組合對肝排斥反應的影響取肝移植大鼠模型，隨機分為4組，每組9只，對照組不用藥，實驗組分別給予CsA、大黃素以及CsA與大黃素聯(lián)用，其中CsA的用量為10.0mg/kg/d，大黃素的用量為50.0mg/kg/d,各組于手術當天至術后第8天連續(xù)給藥。停藥后l周處死大鼠，觀察各組大鼠移植肝組織病理學變化，根據(jù)Banff分級方案(見表3)確定排斥活動指數(shù)(RAI):表3Banff移植肝急性排斥反應診斷分級標準<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>輕度急性排斥反應，57分為中度急性排斥反應，7分以上為重度急性排斥反應。各組移植肝的排斥活動指數(shù)見表4。結果顯示，使用CsA和大黃素組合者的排斥活動指數(shù)明顯低于其它三組(P0.05),CsA組與大黃素組比較，差異無統(tǒng)計學意義(PX).05)。表4各組移植肝的排斥活動指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注:a與不用藥對照組比較，p<0.05;b與CsA組、大黃素組比較，p<0.05Banff分級方案是國際移植學會制訂的肝移植術后急性排斥反應的組織病理學診斷標準。結果發(fā)現(xiàn)不用藥對照組發(fā)生了重度急性排斥反應，而使用CsA和大黃素者存在中度急性排斥反應，其排斥活動指數(shù)明顯低于不用藥對照組，提示大黃素具有一定的抗排斥作用，而將CsA與大黃素聯(lián)合應用者，排斥活動指數(shù)僅2.00土0.78，低于3分，提示二者合用的抗排斥效果較好，在抗排斥反應方面具有一定的協(xié)同作用。實施例7大黃素對大鼠腎移植排斥反應的影響構建腎移植大鼠模型，隨機分為4組，每組6只(以Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者)，對照組不用藥，實驗組分別給予CsA、大黃素以及CsA+大黃素，其中CsA的用量為lO.Omg/kg/d，大黃素的用量為50.0mg/kg/d,各組于手術當天至術后第8天連續(xù)給藥。停藥后l周處死大鼠，觀察各組大鼠腎移植后外周血中調(diào)節(jié)性T細胞的變化，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對照組受者Treg比例僅為2.7士1.2。/。，與之相比，CsA組、大黃素組以及CsA+大黃素組的Treg的比例均顯著的升高(見圖4)。在腎移植中調(diào)節(jié)性T細胞為一個重要的調(diào)節(jié)免疫排斥的因素，其增多可有效抑制免疫排斥，在對于腎移植大鼠研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)大黃素作用后觀察大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細胞變化，對于單用大黃素組可獲得同CsA同樣的抑制效果，而CsA+大黃素組可更為顯著的增多大鼠循環(huán)中調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量，增強對于移植排斥的免疫抑制。說明大黃素可用做腎移植免疫排斥藥物，而且與其它免疫抑制藥物聯(lián)用，其免疫抑制效果更為明顯。實施例8大黃素對腎移植大鼠存活時間的影響構建腎移植大鼠模型，隨機分為4組，每組6只(以Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者)，對照組不用藥，實驗組分別給予CsA、大黃素以及CsA+大黃素，其中CsA的用量為lO.Omg/kg/d，大黃素的用量為50.0mg/kg/d，各組于手術當天至術后第8天連續(xù)給藥。觀察各組大鼠的存活時間。實驗結果見表5:表5腎移植大鼠存活時間比較實驗組存活時間(天)生理鹽水對照組14.3±2.6CsA對照組57.1±7.2大黃素50.0mg/kg/d實驗組47.1士3.2大黃素50.0mg/kg/d+CsA組97.1士9.1結果證明經(jīng)大黃素作用后，大黃素組的存活時間與生理鹽水對照組有明顯差異，與CsA作用組的存活時間接近，即大黃素和CsA可獲得同同樣的抑制效果，而聯(lián)用CsA+大黃素組可更為顯著的增強對于移植排斥的免疫抑制，延長存活時間。說明大黃素可用做腎移植免疫排斥藥物，而且與其它免疫抑制藥物聯(lián)用，其免疫抑制效果更為明顯。權利要求1、大黃素在抗移植排斥藥物制備中的應用。2、如權利要求l所述的應用，所述抗移植排斥是指抑制樹突狀細胞的成熟及免疫刺激功能。3、如權利要求1所述的應用，所述抗移植排斥是指促進調(diào)節(jié)性T細胞增殖。4、如權利要求l、2或3所述的應用，其特征在于，所述抗移植排斥藥物含有其它免疫抑制劑。5、如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述其它免疫抑制劑是環(huán)胞素A。6、如權利要求l-5任一所述的應用，其特征在于，所述抗移植排斥藥物含有藥用載體。7、如權利要求1-6任一所述的應用，所述移植是指肝移植。8、如權利要求1-6任一所述的應用，所述移植是指腎移植。全文摘要本發(fā)明涉及大黃素在抗移植排斥免疫抑制藥物中的應用。本發(fā)明基于大黃素對樹突狀細胞的成熟、分化、免疫刺激的抑制作用及促進調(diào)節(jié)性T細胞增殖的作用，將大黃素施用于移植動物模型，實驗證明大黃素確實具有抗移植排斥的藥效，而且大黃素可與其它免疫抑制劑協(xié)同作用，提高抗移植排斥效果。文檔編號A61K31/122GK101461794SQ20081011678公開日2009年6月24日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權日2008年7月17日發(fā)明者林勝璋申請人:溫州醫(yī)學院