本發(fā)明屬于重組蛋白的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源程序性死亡因子配體hpd-l2蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

pd-l2作為b7家族的第5個(gè)成員，曾被命名為b7-dc或btdc，是程序性死亡因子1（programmeddeath-1，pd-1）的主要配體之一。b7家族是僅可以從抗原遞呈細(xì)胞apc單向傳遞信號(hào)至t細(xì)胞的共刺激分子。在t淋巴細(xì)胞增殖過程中，pd-l2信號(hào)通路充當(dāng)免疫反應(yīng)負(fù)性反饋調(diào)節(jié)信號(hào)，在免疫調(diào)節(jié)方面起十分重要的作用。pd-l2與t細(xì)胞表面的pd-1受體結(jié)合后通過pd-1-pd-l2信號(hào)通路調(diào)控t細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌，負(fù)性調(diào)節(jié)t細(xì)胞活化并促進(jìn)t細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。該信號(hào)通路作為重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，發(fā)揮著特異性的抗原依賴性負(fù)性調(diào)控作用，是藥物干涉機(jī)制以及抗腫瘤免疫治療的靶分子之一，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。hpd-l2蛋白可作為抗原提供抗體結(jié)合的表位，該蛋白的制備是后續(xù)hpd-l2單克隆抗體制備的前提條件，也為單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白的制備方法。

為此采用如下的技術(shù)方案：

一種人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白，氨基酸序列和核苷酸序列如seqidno.1-2所示。

所述的蛋白質(zhì)為如下1)-2)所示的蛋白質(zhì)：

1)氨基酸序列和核苷酸序列分別如seqidno.1-2所示組成的蛋白質(zhì)；

2)將seqidno.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)和或幾個(gè)

氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)；

一種人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白的制備方法，采用如下步驟：

1)以人源程序性死亡因子配體pd-l2的全長編碼基因（序列號(hào)為nm025239.3）為模板，利用pcr技術(shù)獲得hpd-l2整個(gè)胞外段基因，利用ndei與xhoi限制性內(nèi)切酶同時(shí)雙酶切pcr產(chǎn)物與載體pet-22b，利用t4dna連接酶進(jìn)行連接，獲得連接產(chǎn)物；

2)制備dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，送至公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序成功，獲得pet-22b-hpd-l2重組質(zhì)粒;

3)制備rosseta^tm(de3)的感受態(tài)細(xì)胞，將步驟2)獲得的pet-22b-hpd-l2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至rosseta^tm(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌的單菌落；

4)挑取單菌落，于10ml含有50μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基，在37℃條件下過夜培養(yǎng)接種液，接種液按照1：100的體積比接入1l含有50μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600nm值為0.6-0.8之間，然后加入終濃度為0.8mm的iptg于22℃誘導(dǎo)8h，收集菌體；

5)將上述菌體重懸于裂解緩沖液pbs中，超聲破碎，離心，收集上清；

6)將步驟5)獲得的上清，利用ni-nta柱親和層析法純化；

7)將步驟6)中收集的目的蛋白洗脫液裝進(jìn)透析袋中，利用pbs緩沖液進(jìn)行蛋白透析；

8)將步驟7)中透析后的hpd-l2蛋白液置于濃縮管中濃縮，獲得高濃度的hpd-l2蛋白；

9)利用western-blot技術(shù)檢測(cè)獲得的hpd-l2蛋白；

10)利用圓二色譜技術(shù)（cd）測(cè)定步驟8)中獲得hpd-l2蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該重組蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊較好，以β折疊為主。

所述hpd-l2的基因片段長度為600bp，編碼200個(gè)氨基酸。

所述步驟2)中連接產(chǎn)物和dh5α感受態(tài)細(xì)胞的體積比為1：3；所述步驟3)中重組質(zhì)粒和rosseta^tm(de3)感受態(tài)細(xì)胞體積比為1：60。

所述步驟5)中裂解緩沖液pbs中含有：122mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，2mmkh2po4，ph7.4。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用原核細(xì)胞rosseta^tm(de3)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，能夠穩(wěn)定高效的獲得人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白，且獲得的蛋白具有純度高，產(chǎn)量高，均一性好等特點(diǎn)。本發(fā)明所采用的人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白的制備方法具有流程簡(jiǎn)便、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1：瓊脂糖凝膠電泳鑒定hpd-l2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域基因的pcr結(jié)果。泳道

1：pd-l2，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2：15%聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）鑒定hpd-l2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖。泳道1：誘導(dǎo)前破碎的全菌總蛋白；泳道2：誘導(dǎo)8h后破碎的全菌總蛋白；泳道3：誘導(dǎo)8h破碎離心后的沉淀；泳道4：誘導(dǎo)8h破碎離心后的上清。

圖3：hpd-l2重組蛋白純化后的sds-page圖。泳道1：hpd-l2包涵體溶解液；泳道2：過柱流穿液；泳道3-6分別為洗雜和洗脫液，咪唑濃度依次為：10mm、20mm、30mm、50mm、250mm。

圖4：?jiǎn)慰箼z測(cè)hpd-l2蛋白的wb結(jié)果圖。

圖5：cd測(cè)定hpd-l2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該蛋白在192nm呈現(xiàn)正峰，在218nm處有一個(gè)明顯的負(fù)峰，說明hpd-l2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊較好，且主要以β折疊為主的構(gòu)象存在。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

除非另有其他明確表示，否則在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”或其變換如“包含”或“包括有”等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而并非排除其他元件或其他組成部分。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

具體采用如下步驟：

1）hpd-l2基因的獲取和分子克隆以及重組質(zhì)粒pet-22b-hpd-l2的構(gòu)建：本發(fā)明涉及hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白制備，其堿基數(shù)約為560bp，蛋白分子量約為22kda。利用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的上游引物：5’ggactgccatatgttcacagtgacagtcc3’（酶切位點(diǎn)，ndei）和下游引物：5’aatctcgaggtcaatgctggccaaag3’（酶切位點(diǎn)，xhoi）。取人工合成的hpd-l2全長基因（序列號(hào)為nm025239.3）1.5μl，上述引物正反引物各1μl，加入15μl2×dntp，2μl的pcrdna聚合酶，最后加入4.5μlddh2o，混勻，進(jìn)行pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

pcr擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，共循環(huán)35次。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如附圖1所示），切取片段大小為560bp左右的片段，利用sanprep柱式dna膠回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物。按照takara公司的標(biāo)準(zhǔn)雙酶切體系，取16μl上述純化的pcr產(chǎn)物，1μl限制性內(nèi)切酶ndei，1μl限制性內(nèi)切酶xhoi，2μl10×bufferh，混勻，于22℃靜置3-4h，然后加入2μl10×loadingbuffer終止反應(yīng)。按照同樣的方法對(duì)pet-22b載體進(jìn)行雙酶切。利用pcr清潔試劑盒對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。對(duì)于純化后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，步驟為：雙酶切后的pcr產(chǎn)物8μl，雙酶切后的載體pet-22b8μl，t4dna連接酶（takara）2μl，t4dna連接酶buffer（takara）2μl，混勻，于16℃反應(yīng)16h。

2）取-80℃保存的空的dh5α大腸桿菌于lb固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，放于22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16h。從平板上挑取單菌落接種于50ml的lb液體培養(yǎng)基中，22℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2h左右，直至對(duì)數(shù)生長期（od600nm為0.6左右）；用滅菌的50ml離心管收集菌液，冰上放置15min（低溫使菌體一直處于對(duì)數(shù)生長期，菌體能保持最大的活力），4℃、4000rpm離心10min；棄掉上清，收集菌體，加入0.4倍體積的buffertfbi（ph5.8，300mm乙酸鉀，100mm氯化鉀，10mm氯化鈣，50mm四水氯化錳，15%甘油），吹勻重懸菌體后冰上放置20min，4℃、4000rpm離心10min；棄掉上清收集菌體，用移液槍吸取加入0.04倍體積的buffertfbii（ph1.5，10mmmops，75mmcacl2，10mmkcl，15%甘油），吹勻重懸菌體后冰上放置20min，分裝在滅菌的1.5ml離心管，每管60μl。按照同樣的方法制備rosseta^tm（de3）感受態(tài)細(xì)胞。取20μl酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至60μldh5α超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，冰上放置30min，42℃水浴鍋中熱激90s，熱擊后迅速拿出放入冰盒中冰浴2min，加入800μl含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基，于22℃、200rpm的搖床上培養(yǎng)45min左右，4℃，4000rpm離心2min，無菌條件下取出600μl上清，剩余液體吹勻，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的瓊脂糖平板上，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，于5ml含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。對(duì)于雙酶切驗(yàn)證的陽性結(jié)果的重組菌，送至測(cè)序公司進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)粒測(cè)序。

3）取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pet-22b-hpd-l2，轉(zhuǎn)化至rosseta^tm（de3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆，接種于10ml含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)接種液，接種液按照1:100的體積比例接種到1l含有50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)2.5-3h至od600nm值為0.6-0.8之間，加入終濃度為0.8mm的iptg，于22℃，200rpm條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8h。4℃、8000g離心5min收集菌體。使用pbs緩沖液洗滌菌體兩次，然后利用50ml的pbs重懸菌體，超聲破碎，破碎條件為：超聲破碎儀的變幅桿插入液面三分之一處，功率10%，工作2s，停3s，破碎持續(xù)45min。破碎結(jié)束后取樣作為破碎的全菌，剩下的菌體4℃下12000g離心10min，收集上清，棄去沉淀，并把上清與沉淀取樣后保存在4℃冰箱。

4)sds-page檢測(cè)hpd-l2蛋白的表達(dá)情況：將步驟3)中破碎的全菌，上清和沉淀以及誘導(dǎo)前的樣品進(jìn)行處理，上樣。在電泳過程中采用恒壓100v進(jìn)行蛋白樣品的濃縮和恒壓120v進(jìn)行蛋白樣品的分離。電泳完畢后取下凝膠置于染色液中，在60℃下染色（考染法染色）1h左右，放入脫色液中進(jìn)行脫色，將脫色完的凝膠進(jìn)行拍照（如附圖2所示）。

5)ni-nta柱親和層析純化hpd-l2蛋白：

a)取5mlni-nta填料置于玻璃柱中，自然沉降30min；

b)利用30ml的ddh2o清洗柱子，然后用30ml平衡液（ph8.5，100mmtris-hcl，300mmnacl）平衡柱子，流速3s每滴；

c)將待過柱的hpd-l2蛋白樣品13000g，4℃離心15min，收集上清，0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾，待上樣；

d)將過濾后的蛋白上樣，2-3s每滴的流速，冰上收集流穿樣品；

e)用不同咪唑濃度的緩沖液洗雜和洗脫hpd-l2蛋白，3s每滴的流速。

6)將步驟5)純化獲得的hpd-l2重組蛋白裝進(jìn)預(yù)處理好的透析袋，置于pbs緩沖液中透析3次。

7)取步驟6)透析袋中的蛋白溶液，置于濃縮管濃縮，獲得高濃度（10mg/ml）的hpd-l2蛋白。

實(shí)施例2

利用western-blot技術(shù)檢測(cè)hpd-l2蛋白，具體操作步驟如下：

1)對(duì)純化后獲得的hpd-l2蛋白樣品，利用15%的sds-page進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后取下膠，與pvdf膜做成“三明治”形狀，用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；

2)電轉(zhuǎn)完畢，取下pvdf膜，加入5%bsa-tbst(蛋白面朝下），于22?c搖床搖蕩（65rpm）封閉1h，以消除非特異性背景；

3)封閉結(jié)束后用tbst洗掉5%bsa-tbst，加入購買的pd-l2抗體作為一抗，于脫色搖床搖蕩孵育（60rpm）1h或者4?c孵育過夜（12-16h），使一抗與hpd-l2蛋白特異性結(jié)合；

4)回收一抗，用tbst在搖床中洗3次（60rpm），每次5min；

5)加入二抗，于脫色搖床孵育（60rpm）1h，使二抗與一抗充分結(jié)合；

6)回收二抗，用tbst在搖床中洗3次（60rpm），每次5min；

7)用ecl顯色試劑盒（200μl試劑a/張+200μl試劑b/張）孵育3min。去掉反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至保鮮膜上，壓片顯影定影。定影后自然干燥，佳能相機(jī)拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如附圖4）。

實(shí)施例3

利用圓二色譜技術(shù)測(cè)定hpd-l2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊情況，具體操作步驟如下：

1)將獲得的高純度的hpd-l2蛋白稀釋至緩沖液ph7.6，20mmtris-hcl

中，終濃度為：0.5mg/ml，12000g離心10min，取上清待用。

2)打開圓二色譜儀（cd），室溫靜置30min。

3)將步驟1)準(zhǔn)備好的hpd-l2蛋白樣品放入石英比色皿中，進(jìn)行測(cè)定，

記錄譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：獲得的hpd-l2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊較好，且以β折疊為主（如圖5）。

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>一種人源程序性死亡因子配體pd-l2蛋白的制備方法

<130>4

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>201

<212>prt

<213>hpd-l2氨基酸序列

<400>1

leuphethrvalthrvalprolysgluleutyrileilegluhisgly

151015

serasnvalthrleuglucysasnpheaspthrglyserhisvalasn

202530

leuglyalailethralaserleuglnlysvalgluasnaspthrser

354045

prohisarggluargalathrleuleuglugluglnleuproleugly

505560

lysalaserphehisileproglnvalglnvalargaspgluglygln

65707580

tyrglncysileileiletyrglyvalalatrpasptyrlystyrleu

859095

thrleulysvallysalasertyrarglysileasnthrhisileleu

100105110

lysvalprogluthraspgluvalgluleuthrcysglnalathrgly

115120125

tyrproleualagluvalsertrpproasnvalservalproalaasn

130135140

thrserhisserargthrprogluglyleutyrglnvalthrserval

145150155160

leuargleulysproproproglyargasnphesercysvalphetrp

165170175

asnthrhisvalarggluleuthrleualaserileaspleuglnser

180185190

glnmetgluproargthrhisprothr

195200

<210>2

<211>603

<212>dna

<213>hpd-l2核苷酸序列

<400>2

ttattcacagtgacagtccctaaggaactgtacataatagagcatggcagcaatgtgacc60

ctggaatgcaactttgacactggaagtcatgtgaaccttggagcaataacagccagtttg120

caaaaggtggaaaatgatacatccccacaccgtgaaagagccactttgctggaggagcag180

ctgcccctagggaaggcctcgttccacatacctcaagtccaagtgagggacgaaggacag240

taccaatgcataatcatctatggggtcgcctgggactacaagtacctgactctgaaagtc300

aaagcttcctacaggaaaataaacactcacatcctaaaggttccagaaacagatgaggta360

gagctcacctgccaggctacaggttatcctctggcagaagtatcctggccaaacgtcagc420

gttcctgccaacaccagccactccaggacccctgaaggcctctaccaggtcaccagtgtt480

ctgcgcctaaagccaccccctggcagaaacttcagctgtgtgttctggaatactcacgtg540

agggaacttactttggccagcattgaccttcaaagtcagatggaacccaggacccatcca600

act603

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggactgccatatgttcacagtgacagtcc29

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aatctcgaggtcaatgctggccaaag26