專利名稱：：抗程序性死亡配體1(pd-l1)的人單克隆抗體的制作方法抗程序性死亡配體1(PD-L1)的人單克隆抗體相關申請的交叉參考本申請要求2005年7月1日提交的美國臨時專利申請No.60/696,426的權利；該申請全文引入本文作為參考。發(fā)明背景程序性死亡1(PD-l)是CD28受體家族的成員，包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-l和BTLA。該家族的最初成員CD28和ICOS通過對添加單克隆抗體后增強的T細胞增殖的功能效果而發(fā)現(xiàn)(Hutloff等(l999)Nature397:263-266;Hansen等(1980)Immunogenics10:247-260)。已經(jīng)鑒定了PD-l的兩種細胞表面糖蛋白配體，PD-Ll和PD-L2，已經(jīng)表明它們在與PD-l結合后下調(diào)T細胞活化和細胞因子分泌(Freeman等(2000)JExpMed192:1027-34;Latchman等(2001)NatImmunol2:261-8;Carter等(2002)EurJImmunol32:634-43;Ohigashi等(2005)ClinCancerRes11:2947-53)。PD-Ll(B7畫H1)和PD-L2(B7-DC)都是可與PD-l結合、但是不與其他CD28家族成員結合的B7同源物(Blank等(2004))。也已經(jīng)顯示通過IFN-Y刺激上調(diào)細胞表面上PD-Ll的表達。PD-Ll的表達已經(jīng)在幾種鼠和人類癌癥中發(fā)現(xiàn)，包括人肺癌、卵巢癌和結腸癌和各種骨髓瘤(Iwai等(2002)PNAS99:12293-7;Ohigashi等(2005)ClinCancerRes11:2947-53)。已經(jīng)提示PD-Ll通過提高抗原特異性T細胞克隆的細胞凋亡而在腫瘤免疫中起作用(Dong等(2002)NatMed8:793-800)。也已經(jīng)提示PD-Ll可能與腸粘膜炎癥有關，并且PD-Ll的抑制防止了與結腸炎有關的萎縮病(wastingdisease)(Kanai等(2003)JImmunol171:4156-63)。發(fā)明概述本發(fā)明提供與PD-L1結合并且表現(xiàn)出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。這些特性包括與人PD-L1高親和力結合。另外，已經(jīng)顯示本發(fā)明的抗體在混合淋巴細胞反應中提高T細胞增殖、IFN-y分泌和IL-2分泌。在一個方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體表現(xiàn)出至少一種以下性質(zhì)(a)以lxlO-7M或更低的Kd與人PD-L1結合；(b)在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(c)在MLR試驗中^是高干擾素-y產(chǎn)生；(d)在MLR試驗中提高IL-2分泌；Ce)刺激抗體應答；或(f)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。優(yōu)選地，該抗體為人抗體，但是在替代實施方案中，該抗體也可以是，例如，鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在特定實施方案中，該抗體以5xl(T8M或更低的Kd與人PD-L1結合，以lxlO-8M或更低的Kd與人PD-L1結合，以5xlO'9M或更低的Kd與人PD-L1結合，以5xlO-9M或更低的Kd與人PD-L1結合，或以1x1(T8M至lxl(T"M之間的Kd與人PD-L1結合。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體交叉竟爭結合PD-L1，所述參比抗體包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。在各種實施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:或所述參比抗體包括:(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；19的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VHl-18基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VHl-69基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VH1-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VH3-9基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKL15基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明甚至進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKA27基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。本發(fā)明甚至進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VHl-18基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VHl-69基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VHl-3基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL15的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VHl-69基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKA27的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VH3-9基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL15的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與pd-LI特異性結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人VH3-9基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL18的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-LI特異性結合。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和包含CDRl、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體與人PD-L1特異性結合。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優(yōu)選地，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、2.5、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且(c)該抗體以lxl(y7M或更低的Kd與人PD-L1結合。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體還包括至少一種以下的性質(zhì)(a)該抗體在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(b)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-y產(chǎn)生；或(c)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體特異性結合PD-L1。一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:31的重鏈可變區(qū)CDR2:(c)包含SEQIDNO:41的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:51的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:61的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:71的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:32的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:42的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:52的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:62的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:72的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:33的重鏈可變區(qū)CDR2:(c)包含SEQIDNO:43的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:53的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:63的輕鏈可變區(qū)CDR2;禾(f)包含SEQIDNO:73的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:24(b)包含SEQIDNO:34(c)包含SEQIDNO:44(d)包含SEQIDNO:54(e)包含SEQIDNO:64(f)包含SEQIDNO:74另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:25(b)包含SEQIDNO:35(c)包含SEQIDNO:45(d)包含SEQIDNO:55(e)包含SEQIDNO:65(f)包含SEQIDNO:75另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:26(b)包含SEQIDNO:36(c)包含SEQIDNO:46(d)包含SEQIDNO:56(e)包含SEQIDNO:66(f)包含SEQIDNO:76另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:27(b)包含SEQIDNO:37(c)包含SEQIDNO:47(d)包含SEQIDNO:57(e)包含SEQIDNO:67(f)包含SEQIDNO:77另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2;的重鏈可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1;的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕《連可變區(qū)CDR3。的重鏈可變區(qū)CDR1;的重《連可變區(qū)CDR2;的重《連可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1;的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕鏈可變區(qū)CDR3。的重鏈可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2;的重鏈可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1;的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕鏈可變區(qū)CDR3。的重《連可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2;的重《連可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1;的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕鏈可變區(qū)CDR3。的重鏈可變區(qū)CDR1;18(b)包含SEQIDNO:38的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:48的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:58的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:68的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:78的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:39的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:49的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:59的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:69的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:79的輕鏈可變區(qū)CDR3。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:40的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:50的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:60的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:70的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:80的輕鏈可變區(qū)CDR3。其他本發(fā)明優(yōu)選的抗體或其抗原結合部分包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。另一種優(yōu)選的組合包括(a)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的另一方面，提供了與上述任意抗體竟爭結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明的抗體可以是，例如，如IgGl或IgG4同種型的全長抗體?；蛘?，這些抗體可以是抗體片段，如Fab或Fab'2片段，或單鏈抗體。本發(fā)明也提供一種免疫偶聯(lián)物，其包含與諸如細胞毒素或放射性同位素等治療劑連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明也提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同的結合特異性。還提供包含本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子和藥學上可接受的載體的組合物。以及包含這些核酸的表達載體，和包含這些表達載體的宿主細胞。而且，本發(fā)明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達本發(fā)明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)受試者中的免疫應答的方法，包括給該受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分，使得受試者中的免疫應答得到調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體增強、刺激或提高受試者中的免疫應答。在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制受試者中的胂瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-L1抗體代替(或者與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體組合)。例如，在抑制腫瘤生長的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-L1抗體。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-L1抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替(或者與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體組合)。例如，在治療傳染病的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。另外，本發(fā)明提供一種增強受試者中對抗原的免疫應答的方法，包括給該受試者施用(i)抗原；和(ii)抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者中對抗原的免疫應答得到加強。所述抗原可以是，例如，肺瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替(或者與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體組合)。例如，在增強受試者中對抗原的免疫應答的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。本發(fā)明也提供基于本文提供的抗-PD-Ll抗體的序列制備"第二代"抗-PD-Ll抗體的方法。例如，本發(fā)明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的CDR1序列、選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的CDR2序列、和選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的CDR3序列；或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的CDRl序列、選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的CDR2序列、和選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的CDR3序列；(b)改變至少一種可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點通過下面的詳述和實施例將是顯而易見的，該詳述和實施例不應理解為限制性的。貫穿本申請中引用的所有參考文獻、Genbank項、專利和公布的專利申請的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。圖1A顯示3G10人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:81)和氨基酸序列(SEQIDNO:1)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:21)、CDR2(SEQIDNO:3l)和CDR3(SEQIDNO:41)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖1B顯示3G10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:91)和氨基酸序列(SEQIDNO:11)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:51)、CDR2(SEQIDNO:61)和CDR3(SEQIDNO:71)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖2A顯示12A4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:82)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:22)、CDR2(SEQIDNO:32)和CDR3(SEQIDNO:42)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖2B顯示12A4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:92)和氨基酸序列(SEQIDNO:12)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:52)、CDR2(SEQIDNO:62)和CDR3(SEQIDNO:72)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖3A顯示10A5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:83)和氨基酸序列(SEQIDNO:3)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:23)、CDR2(SEQIDNO:33)和CDR3(SEQIDNO:43)區(qū),并指出了V和J的種系來源。圖3B顯示10A5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:93)和氨基酸序列(SEQIDNO:13)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:53)、CDR2(SEQIDNO:63)和CDR3(SEQIDNO:73)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖4A顯示5F8人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:84)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:24)、CDR2(SEQIDNO:34)和CDR3(SEQIDNO:44)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖4B顯示5F8人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:94)和氨基酸序列(SEQIDNO:14)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:54)、CDR2(SEQIDNO:64)和CDR3(SEQIDNO:74)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5A顯示10H10人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:85)和氨基酸序列(SEQIDNO:5)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:25)、CDR2(SEQIDNO:35和CDR3(SEQIDNO:45)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5B顯示10H10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:95)和氨基酸序列(SEQIDNO:15)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:55)、CDR2(SEQIDNO:65)和CDR3(SEQIDNO:75)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖6A顯示1B12人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:86)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:26)、CDR2(SEQIDNO:36)和CDR3(SEQIDNO:46)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖6B顯示1B12人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:96)和氨基酸序列(SEQIDNO:16)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:56)、CDR2(SEQIDNO:66)和CDR3(SEQIDNO:76)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖7A顯示7H1人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:87)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:27)、CDR2(SEQIDNO:37)和CDR3(SEQIDNO:47)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖7B顯示7H1人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:97)和氨基酸序列(SEQIDNO:17)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:57)、CDR2(SEQIDNO:67)和CDR3(SEQIDNO:77)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖8A顯示11E6人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核普酸序列(SEQIDNO:88)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:28)、CDR2(SEQIDNO:38)和CDR3(SEQIDNO:48)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖8B顯示11E6人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:98)和氨基酸序列(SEQIDNO:18)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:58)、CDR2(SEQIDNO:68)和CDR3(SEQIDNO:78)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖9A顯示12B7人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:89)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:29)、CDR2(SEQIDNO:39)和CDR3(SEQIDNO:49)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖9B顯示12B7人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:99)和氨基酸序列(SEQIDNO:19)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:59)、CDR2(SEQIDNO:69)和CDR3(SEQIDNO:79)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖10A顯示13G4人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:90)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:30)、CDR2(SEQIDNO:40)和CDR3(SEQIDNO:50)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖10B顯示13G4人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:100)和氨基酸序列(SEQIDNO:20)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:60)、CDR2(SEQIDNO:70)和CDR3(SEQIDNO:80)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖11顯示13G10的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-18氨基酸序列(SEQIDNO:IOI)的比對。圖12顯示12A4的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VHl-69氨基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖13顯示10A5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-3氨基酸序列(SEQIDNO:103)的比對。圖14顯示5F8的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-69氨基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖15顯示IOHIO的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh3-9氛基酸序列(SEQIDNO:104)的比對。圖16顯示1B12的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-69氨基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖17顯示7H1的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH1-69氨基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖18顯示11E6的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh1-69氛基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖19顯示12B7的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系Vh1-69氛基酸序列(SEQIDNO:102)的比對。圖20顯示13G4的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VH3-9氨基酸序列(SEQIDNO:104)的比對。圖21顯示3G10的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:105)的比對。圖22顯示12A4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:105)的比對。圖23顯示10A5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL15氨基酸序列(SEQIDNO:106)的比對。圖24顯示5F8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKA27氨基酸序列(SEQIDNO:107)的比對。圖25顯示10H10的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL15氨基酸序列(SEQIDNO:106)的比對。圖26顯示1B12的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:105)的比對。圖27顯示7H1的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:105)的比對。圖28顯示11E6的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VkA27氛基酸序列(SEQIDNO:107)的比對。圖29顯示11E6a的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDN0:109)與人種系VKA27氨基酸序列(SEQIDNO:107)的比對。圖30顯示12B7的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL6氨基酸序列(SEQIDNO:105)的比對。圖31顯示13G4的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:108)的比對。圖32A-C顯示流式細胞實驗結果，該結果證明抗人PD-L1的人單克隆抗體3G10、10A5和12A4與全長人PD-L1轉(zhuǎn)染的CHO細胞的細胞表面結合。(A)3G10的流式細胞分析圖，(B)10A5的流式細胞分析圖，(C)12A4的流式細胞分析圖。圖33顯示流式細胞實驗的結果，該結果證明抗人PD-L1的人單克隆抗體3G10、10A5和12A4以濃度依賴的方式與全長人PD-L1轉(zhuǎn)染的CHO細胞的細胞表面結合。圖34顯示ELISA實驗的結果，該結果證明抗人PD-L1的人單克隆抗體3G10、10A5和12A4與PD-Ll-Fc融合蛋白結合。圖35顯示證明在刺激的人CD4+T細胞上HuMab滴定的實驗的結果。圖36顯示證明在刺激的食蟹猴PBMC上HuMab滴定的實驗的結果。圖37A-C顯示流式細胞實驗的結果，該結果證明抗人PD-L1的人單克隆抗體3G10、10A5和12A4與活化的T細胞表面上的PD-L1結合。(A)3G10的流式細胞分析圖，(B)10A5的流式細胞分析圖，(C)12A4的流式細胞分析圖。圖38證明HuMab與ES-2細胞結合。圖39A-D顯示實驗結果，證明抗人PD-L1的人單克隆抗體在混合淋巴細胞反應試驗中促進T細胞增殖、IFN-y分泌和IL-2分泌。圖39A是顯示使用HuMAb10A5的濃度依賴性T細胞增殖的條圖；圖39B是顯示使用HuMAb10A5的濃度依賴性IFN-y分泌的條圖；圖39C是顯示使用HuMAb3G10和12A4的濃度依賴性IFN-y分泌的條圖；圖39D是顯示使用HuMAb10A5的濃度依賴性IL-2分泌的條圖。圖40證明在MLR中使用異基因樹突細胞和T細胞(CD4+效應T細胞)樹突細胞，人抗PD-L1抗體對增殖和IFN-y分泌的影響。圖41A-D顯示實驗結果，證明抗人PD-L1的人單克隆抗體在含有T調(diào)節(jié)細胞的MLR中促進T細胞增殖和IFN-y分泌。圖41A是顯示使用HuMAb10A5的濃度依賴性T細胞增殖的條圖；圖41B是顯示使用HuMAb10A5的濃度依賴性IFN-y分泌的條圖。圖42證明在存在調(diào)節(jié)T細胞的混合淋巴細胞反應中抗PD-L1抗體對細胞增殖的結果。圖43證明在存在調(diào)節(jié)T細胞的混合淋巴細胞反應中抗PD-L1抗體對細胞因子產(chǎn)生的結果。圖44證明抗pd-L1抗體對CMV裂解液刺激的人pbmcIFN-y分泌的結果。圖45顯示流式細胞實驗結果，證明抗人PD-L1的人單克隆抗體阻斷PD-L1與表達PD-1的CHO轉(zhuǎn)染細胞的結合。圖46顯示抗PD-L1抗體阻斷PD-L1與IFN-y處理的ES-2細胞的結合。圖47顯示抗PD-L1抗體對體內(nèi)腫瘤生長的影響。發(fā)明詳述在一個方面，本發(fā)明涉及特異性結合PD-L1的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出一種或多種所需的功能性質(zhì)，如與人PD-L1的高親和力結合，在混合淋巴細胞反應中增強T細胞增殖、IFN-y和/或IL-2分泌的能力，抑制PD-L1與PD-1受體結合的能力，刺激抗體應答的能力，和/或逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞的抑制功能的能力。另外或者可替代地，本發(fā)明的抗體源自特定重鏈和輕鏈種系序列，和/或包含特定結構特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。例如，本發(fā)明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯(lián)物和雙特異性分子、和含有本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及使用抗PD-L1抗體抑制受試者中胂瘤細胞生長的方法。本發(fā)明也涉及利用該抗體改變免疫應答，以及治療疾病如癌癥或傳染病，或刺激保護性自身免疫應答或刺激抗原特異性免疫應答的方法(例如通過抗PD-L1和目標抗原的共給藥)。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術語。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。術語"免疫應答"是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、和補體)的作用，其導致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌細胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細胞或組織。"信號轉(zhuǎn)導途徑"是指在信號從一個細胞的一部分向一個細胞的另一部分傳送中起作用的多種信號轉(zhuǎn)導分子之間的生化關系。本文使用的短語"細胞表面受體"包括，例如，能夠接收信號和跨過細胞質(zhì)膜傳播這種信號的分子和分子復合物。本發(fā)明的"細胞表面受體"的一個例子是PD一L1受體。這里提到的術語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即"抗原結合部分，，)或單鏈。"抗體"是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結構域Cw、Ch2和Ch3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為V。和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結構域CL組成。Vh和Vi區(qū)可進一步再分為高變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR),CDR散布在被稱為構架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個Vh和Vl均由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3,CDR3,FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結合結構域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。本文所用的術語抗體的"抗原結合部分"(或簡稱為"抗體部分")是指保留與抗原(例如PD-L1)特異性結合的能力的抗體的一個或多個片段。已證明抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來行使。術語抗體的"抗原結合部分"中所包括的結合片段的例子包括(i)Fab片段，即由V。VH、Cl和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)由Vh和Cm結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的V^和VH結構域組成的Fv片段；(v)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546);和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域Vl和VH由單獨的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中Vl和VH區(qū)配對構成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術語抗體的"抗原結合部分，，內(nèi)。這些抗體片段用本領域技術人員公知的常規(guī)技術獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實用性進行篩選。本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與PD-L1特異性結合的分離的抗體基本不含與除PD-L1以外的抗原特異性結合的抗體)。但是，與PD-L1特異性結合的分離的抗體與諸如來自其他物種的PD-L1分子等其他抗原可能具有交叉反應性。而且，分離的抗體可基本不含其他細胞材料和/或化學物質(zhì)。本文使用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位的單一結合特異性和親和性。本文使用的術語"人抗體，，包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，構架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術語"人抗體"不包括其中源自另一哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構架序列上的抗體。術語"人單克隆抗體"是指表現(xiàn)單一結合特異性的抗體，其具有其中構架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，該B細胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中獲得。本文使用的術語"重組人抗體"包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達人抗體的宿主細胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)乂人重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或者，當使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，經(jīng)歷體內(nèi)體細胞誘變)，因此重組抗體的Vh和VL區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系VH和VL序列并與之相關的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。本文使用的術語"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。短語"識別抗原的抗體，，和"抗原特異性抗體，，在此與術語"與抗原31特異性結合的抗體"可互換使用。術語"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物。術語"人源化抗體"是指其中來源于另外一種哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構架序列上的抗體。在人構架序列內(nèi)也可以進行其它的構架區(qū)修飾。術語"嵌合抗體"是指其中可變區(qū)序列來源于一個物種而恒定區(qū)序列來源于另一個物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。本文使用的術語"與人PD-Ll特異性結合"的抗體是指以Ixl0-7M或更低、更優(yōu)選5xlO—8M或更低、更優(yōu)選1x10—8M或更低、更優(yōu)選5xlO力M或更低、甚至更優(yōu)選1x10—Sm至lxl(T"M或更低的K。與人PD-L1結合的抗體。本文使用的術語"Ka，c"或"Ka"是指特定抗體-抗原相互作用的結合速率，而本文使用的術語"Kdis"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術語"KD"是指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度(M)。抗體的Kd植可能用本領域建立的方法測定。測定抗體KD的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如81&00^@系統(tǒng)。本文使用的術語IgG抗體的"高親和力"是指抗體對于靶抗原的KD為10-SM或更低、更優(yōu)選10M或更低、甚至更優(yōu)選10'"M或更低。但是對于其他抗體同種型來說，"高親和力"結合可能不同。例如，對于IgM同種型來說，"高親和力"結合是指抗體具有1(^M或更低、更優(yōu)選l(ySM或更低、甚至更優(yōu)選10力M或更低的KD。本文使用的術語"受試者，，包括任何人或非人類動物。術語"非人類動物，，包括所有脊推動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動物、爬行類動物等。本申請的各個方面在下面的章節(jié)中進一步詳細描述?？?PD-Ll抗體本發(fā)明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與人PD-L1特異性結合。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以高親和力與PD-L1結合，例如Ko為lxlO々M或更低。本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體優(yōu)選地表現(xiàn)出以下一種或多種特性(a)以1x1(T7m或更低的Kd與人PD-L1結合；(b)在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(c)在MLR試驗中提高干擾素-y產(chǎn)生；(d)在MLR試驗中提高IL-2分泌；(e)刺激抗體應答；和/或(f)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。優(yōu)選地，該抗體以5xl(T8M或更{氐的Kd與人PD-L1結合，以lxl(T8M或更低的Kd與人PD-L1結合，以5xl(T9M或更低的KD與人PD-L1結合，以4xl(T9M或更低的Kd與人PD-L1結合，或以2xlO—9M或更低的Kd與人PD-L1結合，或以lxlO—9M至lxl(r"M或更低的Kd與人PD-L1結合。評價抗體對PD-L1的結合能力的標準試驗在本領域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印跡分析和RIA。合適的試-驗在實施例中詳細描述?？贵w的結合動力學(例如結合親和力)也可以通過本領域^^知的標準試驗(如8!30)^@分析)來評價。單克隆抗體3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4本發(fā)明優(yōu)選的抗體是如實施例1和2所述分離并進行結構表征的人單克隆抗體3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4。3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VH氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中。3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VL氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中。假定這些抗體中的每一個都能夠與PD-L1結合，則Vh和Vl序列可以"混合并匹配"，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PD-Ll結合分子。PD-L1與這些"混合并匹配的"抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗(例如ELISA)檢測。優(yōu)選地，當Vh和Vi鏈混合并匹配時，來自特定VH/V^配對的VH序列被替換為結構上相似的VH序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/Vt配對的Vi序列被替換為結構上相似的Vl序列。因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1、優(yōu)選與人PD-L1特異性結合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供包含3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的重鏈和輕《連CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中。3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VHCDR2的氨基酸序列示于SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VHCDR3的氨基酸序列示于SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VKCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VKCDR2的氨基酸序列示于SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的VKCDR3的氨基酸序列示于SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242)勾畫出。假如這些抗體均能與PD-L1結合，并且抗原結合特異性主要是由CDR1、2和3區(qū)提供的，則VHCDR1、CDR2和CDR3序列與VKCDRl、CDR2和CDR3序列可以"混合并匹配，，(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個抗體必須含有VHCDR1、CDR2和CDR3和VKCDR1、CDR2和CDR3),從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PD-Ll結合分子。PD-L1與這些"混合并匹配的"抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗(例如ELISA,Biacore分析)檢測。優(yōu)選地，當VHCDR序列混合并匹配時，來自特定Vh序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結構上相似的CDR序列。同樣，當VKCDR序列混合并匹配時，來自特定Vk序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結構上相似的CDR序列。對于本領域技術人員而言顯而易見的是，通過將一個或多個Vh和/或VLCDR區(qū)序列替換為來自此處公開的單克隆抗體3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的CDR序列的結構上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和Vl序列。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:21、22、23、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含選自SEQIDNO:31、32、33、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:41、42、43、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:51、52、53、59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含選自SEQIDNO:61、62、63、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含選自SEQIDNO:71、72、73、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與PD-L1、優(yōu)選與人PD-L1特異性結合。3624、25、26、27、28、34、35、36、37、38、44、45、46、47、48、54、55、56、57、58、64、65、66、67、68、和74、75、76、77、78、在一個優(yōu)選實施方案中，(a)包含SEQIDNO:21(b)包含SEQIDNO:31(c)包含SEQIDNO:41(d)包含SEQIDNO:51(e)包含SEQIDNO:61(f)包含SEQIDNO:71在另一優(yōu)選實施方案中，(a)包含SEQIDNO:22(b)包含SEQIDNO:32(c)包含SEQIDNO:42(d)包含SEQIDNO:52(e)包含SEQIDNO:62(f)包含SEQIDNO:72在另一優(yōu)選實施方案中，(a)包含SEQIDNO:23(b)包含SEQIDNO:33(c)包含SEQIDNO:43(d)包含SEQIDNO:53(e)包含SEQIDNO:63(f)包含SEQIDNO:73在另一優(yōu)選實施方案中，(a)包含SEQIDNO:24(b)包含SEQIDNO:34(c)包含SEQIDNO:44(d)包含SEQIDNO:54(e)包含SEQIDNO:64(f)包含SEQIDNO:74在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包4舌的重鏈可變區(qū)CDR1的重鏈可變區(qū)CDR2的重鏈可變區(qū)CDR3的輕鏈可變區(qū)CDR1的輕鏈可變區(qū)CDR2的輕鏈可變區(qū)CDR3。該抗體包括的重鏈可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2的重鏈可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕鏈可變區(qū)CDR3。該抗體包括的重鏈可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2的重鏈可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕鏈可變區(qū)CDR3。該抗體包括的重鏈可變區(qū)CDR1;的重鏈可變區(qū)CDR2的重鏈可變區(qū)CDR3;的輕鏈可變區(qū)CDR1的輕鏈可變區(qū)CDR2;的輕《連可變區(qū)CDR3。該抗體包括(a)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:35的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:45的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:55的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:65的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:75的輕鏈可變區(qū)CDR3,在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:36的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:46的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:56的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:66的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:76的輕鏈可變區(qū)CDR3在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:37的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:47的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:57的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:67的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:77的輕鏈可變區(qū)CDR3在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:38的重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:48的重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:58的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:68的輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:78的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:39的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:49的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:59的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:69的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:79的輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:40的重4連可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:50的重鏈可變區(qū)CDR3:(d)包含SEQIDNO:60的輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:70的輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:80的輕鏈可變區(qū)CDR3。本領域公知，不依賴于CDR1和/或CDR2域，單獨的CDR3域即可以決定抗體對于同源抗原的結合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預測性地產(chǎn)生具有相同結合特異性的多種抗體。參見，例如，Klimka等，Sn'^/zJ.o/C""cw83(2):252-260(2000)(描述了僅使用鼠抗-CD30抗體Ki-4的重鏈可變域CDR3產(chǎn)生人源化抗-CD30抗體)；Beiboer等，J.Mo/歷o/.296:833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠MOC-31抗-EGP-2抗體的重鏈CDR3序列產(chǎn)生重組上皮糖蛋白-2(EGP畫2)抗體)；Rader等，尸度.淑/.爿cadMA95:8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯(lián)蛋白0^(33抗體LM609的重鏈和輕鏈可變CDR3域的一組人源化抗整聯(lián)蛋白0^|33抗體，其中每個成員抗體在CDR3域之外含有不同的序列，并且能夠與親本鼠抗體結合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣高或更高)；Barbas等，/爿w.C77e肌Soc.116:2161-2162(1994)(公開了CDR3域?qū)乖Y合提供了最重要的貢獻)；Barbas等，尸rac'淑/.爿cad".W.92:2529-2533(1995)(描述了三種抗人胎盤DNA的Fab(SI-l,SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列向抗破傷風類毒素Fab的重鏈上的移植，由此替換了存在的重鏈CDR3,并且證明單獨的CDR3提供結合特異性)；和Ditzel等，/mmw"o/.157:739-749(1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異性IgG破傷風類毒素結合Fabp313抗體轉(zhuǎn)移親本多特異性FabLNA3的重鏈CDR3足以保留親本Fab的結合特異性)。上述每一參考文獻都全文引入作為參考。因此，在某些方面，本發(fā)明提供包含一個或多個來自非人抗體如小鼠或大鼠抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結合CD19。在某些實施方案中，這些本發(fā)明的包含一個或多個來自非人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本非人抗體(a)能夠竟爭結合；(b)保留功能特性；(c)結合相同的表位；和/或(d)具有類似的結合親和力。在其他方面，本發(fā)明提供包含一個或多個來自第一人抗體(如從非人動物獲得的人抗體)的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠特異性結合CD19，并且其中來自該第一人抗體的CD3域代替了缺乏對PD-L1的結合特異性的人抗體中的CDR3域，從而產(chǎn)生能夠特異性結合PD-L1的第二人抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的包含一個或多個來自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本第一人抗體(a)能夠竟爭結合；(b)保留功能特性；(c)結合相同的表位；和/或(d)具有類似的結合親和力。具有特定種系序列的抗體在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VHl-18基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人Vh1-69基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VHl-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VH3-9基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKL15基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKA27基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產(chǎn)自或源自人VKL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或源自人VH1-18、1-69、l-3或3-9基因(該基因分別編碼SEQIDNO:101、102、103和104所示的氨基酸序列)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或源自人VKL6、L15、A27或L1基因(該基因分別編碼SEQIDNO:105、106、107和108所示的氨基酸序列)的輕鏈可變區(qū)；且(c)與PD-Ll、優(yōu)選與人PD-L1特異性結合。分別具有VHl-18和VkL6的Vh和Vk的抗體的一個例子是3G10。分別具有VH1-69和VkL6的Vh和Vk的抗體的例子是12A4、1B12、7H1和12B7。分別具有VH1-3和VkL15的Vh和Vk的抗體的一個例子是10A5。分別具有VH1-69和VkA27的Vh和Vk的抗體的例子是5F8、11E6禾口11E6a。分別具有VH3-9和VkL15的Vh和Vk的抗體的一個例子是IOHIO。分別具有VH1-3和VkL15的Vh和Vk的抗體的一個例子是10A5。分別具有VH3-9和VkL18的Vh和Vk的抗體的一個例子是13G4。在本文中，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該人抗體包含"產(chǎn)自"或"源自"特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。"產(chǎn)自"或"源自"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。"產(chǎn)自"或"源自"特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細胞突變或定點突變的有意引入而導致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列通常至少90%相同，并且含有當與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時確認該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。在某些實施方案中，源自特定人種系序列的人抗體表現(xiàn)與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過IO個氨基酸的差異。在某些其他實施方案中，該人抗體可能表現(xiàn)與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個、或者甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。同源抗體在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明抗-PD-L1抗體的所需功能特性。例如，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和IO的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(c)該抗體以lxl(y7M或更^f氐的Kd與人PD-L1結合；(d)該抗體在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(e)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-y產(chǎn)生；(f)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌；(g)該抗體刺激抗體應答；且(h)該抗體逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。在另外一些實施方案中，Vh和/或Vi氨基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和Vl^區(qū)高度(即80%或更高)同源的Vh和Vl區(qū)的抗體可以如下獲得誘變(例如定點誘變或PCR介導的誘變)編碼SEQIDNO:25、26、27、28、29和30的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗檢測編碼的被改變抗體的保留的功能(即以上(c)到(h)所述的功能)。本文使用的兩個氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個序列之間的百分同一性?？紤]為了兩個序列之間進行最佳比對所需要引入的空位的數(shù)目和每個空位的長度后，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性=相同位點的數(shù)目/位點的總數(shù)x100)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實施例中所述用數(shù)學算法實現(xiàn)。兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權重殘基表，12的空位長度罰分，4的空位罰分。另外，兩個氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從www.gcg.com荻得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權重，和l、2、3、4、5或6的長度權重。在某些情況中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進一步作為"查詢序列，，用于進行公共數(shù)據(jù)庫的檢索，例如鑒定相關序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)進行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進行，得分=50,字長=3,以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以采用如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所迷的空位BLAST。當采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。具有保守修飾的抗體在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個或多個包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-PD-Ll抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序歹'j的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以lxlO々M或更低的Kd與人PD-L1結合；(d)該抗體在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(e)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-Y產(chǎn)生；(f)該抗體在MLR試-瞼中提高IL-2分泌；(g)該抗體刺激抗體應答；且(h)該抗體逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。在一個優(yōu)選實施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。本文使用的術語"保守序列修飾"是指不會顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領域公知的標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族在本領域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸)、(3-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以被置換為來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗檢測改變的抗體保留的功能(即以上(C)至(h)所述的功能)。與本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體結合相同表位的抗體在另一實施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明的任意PD-L1單克隆抗體結合相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任意單克隆抗體交叉竟爭結合PD-L1的抗體)。在優(yōu)選實施方案中，用于交叉竟爭研究的參比抗體可以是單克隆抗體3G10(具有分別如SEQIDNO:l和11所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體12A4(具有分別如SEQIDNO:2和12所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體10A5(具有分別如SEQIDN0:3和13所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體10A5(具有分別如SEQIDNO:3和13所示的VH和Vl序列)，或單克隆抗體5F8(具有分別如SEQIDNO:4和14所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體10H10(具有分別如SEQIDNO:5和15所示的VH和Vl序列)，或單克隆抗體1B12(具有分別如SEQIDNO:6和16所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體7H1(具有分別如SEQIDNO:7和17所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體11E6(具有分別如SEQIDNO:8和18所示的Vh和Vl序歹Q)，或單克隆抗體12B7(具有分別如SEQIDNO:9和19所示的VH和Vl序列)，或單克隆抗體13G4(具有分別如SEQIDNO:10和20所示的Vh和V匕序列)。這些交叉竟爭抗體可以根據(jù)它們在標準PD-L1結合測定中與3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4交叉竟爭的能力來鑒定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測定或流式細胞分析來證明與本發(fā)明抗體的交叉竟爭。被測試抗體抑制例如3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4與人PD-L1結合的能力證明，該測試抗體可以與3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4竟爭結合人PD-L1，因此所結合的人PD-L1上的表位與3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4相同。在一個優(yōu)選實施方案中，所結合的人PD-L1上的表位與3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4相同的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實施例所述制備和分離。工程化抗體和修飾的抗體本發(fā)明的抗體進一步可以利用具有此處所公開的一種或多種VH和/或Vt序列的抗體作為起始材料來制備，以構建一種修飾的抗體，過修飾一個或兩個可變區(qū)(即Vh和/或V。例如一個或多個CDR區(qū)內(nèi)和/或一個或多個構架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基來構建抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來構建抗體，例如改變該抗體的效應功能?？梢赃M行的一種類型的可變區(qū)工程化是CDR移植?？贵w主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負責大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構建如下的表達載體能夠表達模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上(參見，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature332:323-327;Jones，P.等(1986)Nature321:522-525;Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美國專利5,225,539，和Queen等的美國專利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。因此，本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30，SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40,和SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含47選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60,SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70,和SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4的Vh和VLCDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構架序列。這些構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或發(fā)表的參考文獻中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)"VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫(可乂人因凈47網(wǎng)上www,mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得)，以及Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242;Tominson,I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox,J.P.L.等(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836;其內(nèi)容均？I入本文作為參考。使用本領域技術人員公知的一種被稱為缺口BLAST(Altschul等(1997)NucleicAcidsResearch25:3389-3402)的序列相似性檢索方法，將抗體蛋白質(zhì)序列與匯編的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較。BLAST是一種啟發(fā)式算法，其中抗體序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的統(tǒng)計學顯著性比對可能含有所比對的字句的高得分的片段對(HSP)。延伸或修剪不能提高其得分的片段對被稱為命中(hit)。簡要地說，翻譯VBASE來源的核香酉臾序歹'J(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php),而寸呆留FR1至FR3構架區(qū)之間并且包括該構架區(qū)的區(qū)域。數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的平均長度為98個殘基。除去在蛋白質(zhì)全長上準確匹配的重復序列。使用程序blastp,除關閉的低復雜性過濾器和BLOSUM62置換矩陣以外應用缺省標準參數(shù)對蛋白質(zhì)進行BLAST檢索，對于排名前5位的命中，過濾器產(chǎn)生序列匹配。在所有6個框架內(nèi)的核苷酸序列都翻譯，在數(shù)據(jù)庫序列的匹配片段中沒有終止密碼子的框架被認為是潛在命中。然后使用BLAST程序tblastx進行證實。該程序翻譯所有6個框架內(nèi)的抗體序列，并且比較其翻譯與在所有6個框架內(nèi)動態(tài)翻譯的VBASE核苷酸序列。同一性是抗體序列和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫之間在序列全長上的完全氨基酸匹配。陽性(同一性+置換匹配)不同，但是氨基酸置換由BLOSUM62置換矩陣指導。如果抗體序列以相同的同一性匹配兩個數(shù)據(jù)庫序列，則陽性最強的命中被判斷為匹配序列命中。用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構架序列在結構上類似于所選擇的本發(fā)明抗體使用的構架序列，例如，類似于本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體使用的VHl-18構架序列(SEQIDNO:101)和/或VHl-69構架序列(SEQIDNO:102)和/或VH1-3構架序列(SEQIDNO:103)和/或VH3-9構架序列(SEQIDNO:104)和/或VKL6構架序列(SEQIDNO:105)和/或VkL15枸架序列(SEQIDNO:106)和/或VKA27構架序列(SEQIDNO:107)和/或VkL18枸架序列(SEQIDNO:107)。VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以一皮移才直到與該構架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個或多個突變的構架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構架區(qū)內(nèi)的殘基進行突變對于保持或增強抗體的抗原結合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國專利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是突變Vh和/或VkCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標抗體的一種或多種結合特性(例如親和力)?？梢赃M行定點誘變或PCR介導的誘變，以引入突變，對抗體結合的影響，或者其他目標功能特性，可以用此處所述和實施例中提供的體外或體內(nèi)試驗來評價。優(yōu)選引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)的不超過1、2、3、4或5個殘基。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-PD-Ll單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)VHCDRl區(qū)，其包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，或與SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列，或與SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列，或與SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；((I)VkCDRI區(qū)，其包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列，或與SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列，或與SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和①VkCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列，或與SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對其VH和/或VK內(nèi)的構架殘基進行了修飾的抗體。進行這樣的構架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個構架殘基"回復突變"為相應的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構架殘基。通過比較抗體構架序列與4汙生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，如下所述，抗-PD-l抗體3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的構架區(qū)中的大量氨基酸改變不同于親本種系序列。為了使構架區(qū)序列中的一個或多個氨基酸殘基恢復為其種系構型，可以通過(例如)定點誘變或PCR介導的誘變，將該體細胞突變"回復突變"為種系序列。3G10的VH區(qū)與親本種系VH1-18序列的比對顯示在圖11中。12A4的VH區(qū)與親本種系VH1-69序列的比對顯示在圖12中。10A5的VH區(qū)與親本種系Vh1-3序列的比對顯示在圖13中。5F8的VH區(qū)與親本種系Vpjl-69序列的比對顯示在圖14中。10H10的VH區(qū)與親本種系VH3-9序列的比對顯示在圖15中。1B12的VH區(qū)與親本種系VHl-69序列的比對顯示在圖16中。7H1的VH區(qū)與親本種系VHl-69序列的比對顯示在圖17中。11E6的VH區(qū)與親本種系VHl-69序列的比對顯示在圖18中。12B7的VH區(qū)與親本種系VHl-69序列的比對顯示在圖19中。13G4的VH區(qū)與親本種系VH3-9序列的比對顯示在圖20中。例如，對于3G10，VH的氨基酸殘基弁79(FR3內(nèi))是纈氨酸，而在相應的VH1-18種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，可以通過(例如)定點誘變或PCR介導的誘變，將該體細胞突變"回復突變"為種系序列(例如，3G10的Vh的殘基#79(FR3的殘基弁13)可以從纈氨酸"回復突變"為丙氨酸)。另一個例子是，對于12A4,VH的氨基酸殘基弁24(FR1內(nèi))是蘇氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12A4的Vh的殘基弁24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12A4,VH的氨基酸殘基弁27(FR1內(nèi))是天冬氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12A4的Vh的殘基弁27從天冬氨酸"回復突變"為甘氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12A4，Vh的氛基酸殘基弁95(FR3內(nèi))是苯丙冬氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12A4的Vh的殘基#95(FR3的殘基弁29)從苯丙氨酸"回復突變"為酪氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于5F8,氨基酸殘基#24(FR1內(nèi))是纈氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將5F8的vh的殘基弁24從纈氨酸"回復突變，，為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于5F8，氨基酸殘基#28(FR1內(nèi))是異亮氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將5F8的Vh的殘基弁28從異亮氨酸"回復突變"為蘇氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于10H10,氨基酸殘基#24(FR1內(nèi))是纈氨酸，而在相應的vh3-9種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將10H10的vh的殘基弁24從纈氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于10H10,可以在氨基酸殘基#97(FR3內(nèi))后插入氨基酸。該氨基酸為纈氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將在10H10的vh的殘基弁97之后插入的氨基酸"回復突變"，從而刪除該纈氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于1B12,氨基酸殘基弁24(FR1內(nèi))是蘇氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將1B12的vh的殘基弁24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于1B12，氨基酸殘基#27(FR1內(nèi))是天冬氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將1B12的Vh的殘基弁27從天冬氨酸"回復突變"為甘氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于1B12,氨基酸殘基#95(FR3內(nèi))是苯丙氨酸，而在相應的VH1-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將1B12的Vh的殘基弁95(FR3的殘基#29)從苯丙氨酸"回復突變"為酪氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于7H1，氨基酸殘基#24(FR1內(nèi))是蘇氨酸，而在相應的VH1-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將7H1的vh的殘基弁24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于7H1，氨基酸殘基#77(FR3內(nèi))是蘇氨酸，而在相應的VH1-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將7H1的Vh的殘基弁72(FR3的殘基#11)從蘇氨酸"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于11E6，氨基酸殘基弁78(FR3內(nèi))是丙氨酸，而在相應的VH1-69種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將11E6的Vh的殘基弁78(FR3的殘基12)從丙氨酸"回復突變"為蘇氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12B7，氨基酸殘基弁13(FR1內(nèi))是谷氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為賴氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的Vh的殘基弁13從谷氨酸"回復突變"為賴氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12B7，氨基酸殘基#30(FR1內(nèi))是天冬酰胺，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的Vh的殘基弁30從天冬酰胺"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12B7,氨基酸殘基#77(FR3內(nèi))是天冬酰胺，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的Vh的殘基弁377(FR3的殘基ll)從天冬酰胺"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于12B7，氨基酸殘基#82(FR3內(nèi))是天冬氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為谷氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的Vh的殘基弁82(FR3的殘基#16)從天冬氨酸"回復突變"為谷氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一個例子是，對于13G4，氨基酸殘基#27(FR1內(nèi))是異亮氨酸，而在相應的VHl-69種系序列中該殘基為苯丙氨酸。為了使構架區(qū)序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的Vh的殘基弁27從異亮氨酸"回復突變"為苯丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。另一種類型的構架修飾涉及對構架區(qū)內(nèi)、乃至一個或多個CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基進行突變，以除去T細胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為"脫免疫，，，在Carr等的公布號為20030153043的美國專利中詳細記載。除了在構架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一4義是為了改變該抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學修飾(例如一個或多個化學部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變該抗體的一種或多種功能特性。這些實施方案均在下文詳細描述。Fc區(qū)中殘基的編號是Kabat的EU指數(shù)的編號。在一個實施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等的美國專利No.5,677,425號中詳細記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了(例如)促進輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區(qū)進行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區(qū)引入一個或多個氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結合比天然Fc-鉸鏈結構域與SpA的結合減弱。該方法在Ward等的美國專利No.6，165,745號中詳細記載。在另一實施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，如Ward的美國專利No.6,277,375所述，可以引入一個或多個如下突變T252L、T254S、T256F?；蛘撸鏟resta等的美國專利No.5,869,046和6,121,022所述，為了^是高生物半衰期，該抗體可以在CH1或CL區(qū)內(nèi)進行改變，使之含有來自IgGFc區(qū)CH2結構域的兩個環(huán)的補救受體結合表位。在其他一些實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對效應配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結合能力。其親和力被改變的效應配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補體的Cl成分。該方法在Winter等的美國專利No.5,624,821和5,648,260中更詳細地描述。在另外一個實施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結合改變和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等的美國專利No.6，194,551中更詳細地描述。在另外一個實施例中，改變氨基酸位點231和239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變該抗體固定補體的能力。該方法在Bodmer等的PCT公布WO94/29351中進一步描述。在另外一個實施例中，為了提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fcy受體的親和力，通過在下列位點處修飾一個或多個氨基酸來修飾Fc區(qū)238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、,438或439。該方法在Presta的PCT公布WO00/42072中進一步描述。而且，人IgGl上對于FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的結合位點已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結合的變體(參見，Shields,R丄.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位點256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcyRIII的結合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcyRIII的結合T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在另一實施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過(例如)改變抗體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點來實現(xiàn)。例如，可以進行一個或多個氨基酸置換，使一個或多個可變區(qū)構架糖基化位點消失，從而消除該位點處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法在Co等的美國專利No.5,714,350和6,350,861中更詳細地描述。在某些其他實施方案中，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結構增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過(例如)在糖基化機制改變的宿主細胞中表達抗體來實現(xiàn)。糖基化機制改變的細胞在本領域中已有描述，能夠用作宿主細胞，在其中表達本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，細胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8(a(l,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709細胞系中表達的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。通過使用兩種替代載體定向破壞CHO/DG44細胞中的FUT8基因，產(chǎn)生Ms704、Ms705和Ms709FUT8、田胞系(參見Yamane等的美國專利申請No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)BiotechnolBioeng87:614-22)。另一個例子是，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細月包系，該基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，由于減少或消除了a(l，6)鍵相關的酶，在這種細胞系中表達的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結合抗體Fc區(qū)的N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有酶活性的細胞系，例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公布WO03/035835記載了一種變異CHO細胞系，Lecl3細胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導致在該宿主細胞中表達的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields,R丄.等(2001)J,Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公布WO99/54342記載了表達糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如(3(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTin))的工程化細胞系，因此該工程化細胞系中表達的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結構增加，導致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(l999)Nat,Biotech.17:176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例如，巖藻糖苷酶a-L-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基(Tarentino，A丄.等.(1975)Biochem.14:5516-23)。本發(fā)明涉及的對此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個或多個PEG基團與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應性酯或醛衍生物反應。優(yōu)選地，通過與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻M行PEG化。本文使用的術語"聚乙二醇"包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(Cl-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，將要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等的EP0154316和Ishikawa等的EP0401384?？贵w工程化方法如上所述，能夠利用具有此處公開的Vh和Vk序列的抗-PD-L1抗體，通過修飾Vh和/或Vk序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-PD-Ll抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體(例如3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4)的結構特征，產(chǎn)生結構上相關的抗-PD-Ll抗體，該結構上相關的抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人PD-L1結合。如上所述，例如，3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4的一個或多個CDR區(qū)或其突變可以與已知的構架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-PD-L1抗體。其他類型的修飾包括以上部分所迷的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列，或其一個或多個CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定必須實際制備(即表達為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列，或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該"第二代"序列，并將其表達為蛋白質(zhì)。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的CDR1序列、選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的CDR1序列、選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)?？梢岳脴藴史肿由飳W技術制備和表達所述改變的抗體序列。優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-PD-Ll抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(i)以lxlO々M或更低的Kd與人PD-L1結合；(ii)在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(iii)在MLR試驗中提高干擾素-y產(chǎn)生；(iv)在MLR試驗中提高IL-2分泌；(v)刺激抗體應答；和/或(vi)逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。改變的抗體的功能特性可以用本領域中使用的和/或此處所述的(如實施例中所述的)標準試驗(例如流式細胞術、結合測定)來評價。在本發(fā)明抗體的工程化方法的某些實施方案中，可以沿全部或部分抗-PD-Ll抗體編碼序列隨機或選擇性引入突變，并可以針對結合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-PD-Ll抗體。突變方法在本領域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等的PCT公布WO03/074679也記載了利用計算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細胞、細胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標準技術和本領域公知的其他方法與其他細胞成分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時，核酸是"分離的"或"基本上純的"。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA,并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選實施方案中，該核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可以利用標準分子生物學技術獲得。對于雜交瘤(例如，由如下文進一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標準PCR擴增或cDNA克隆技術獲得。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術)，可以從文庫中回收編碼該抗體的一種或多種核酸。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4單克隆抗體的Vh和Vl序列的核酸分子。編碼3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的Vh序列的DNA序列分別在SEQIDNO:81、82、83、84、85、86、87、88、89和90中示出。編碼3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的Vl序列的DNA序列分別在SEQIDNO:91、92、93、94、95、96、97、98、99和100中示出。一旦獲得編碼Vh和Vl片段的DNA片段，即可通過標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼Vt或Vh的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另一個DNA片段有效連接。如本文使用的術語"有效連接"意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀框。通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242),包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子有效連接。通過將編碼ViJ々DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼Vl區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領域中公知(參見，i"歹'H口,Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242),包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。在優(yōu)選的實施方案中，輕鏈恒定區(qū)可以是K或X恒定區(qū)，但最優(yōu)選地是K恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和Vl的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個片段有效連接，使得VH和Vi序列可以表達為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其Vl和VH區(qū)通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(mAb)能夠通過多種技術制備，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的標準體細胞雜交技術。雖然優(yōu)選體細胞雜交技術，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細胞的技術是本領域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也是公知的。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述獲得的鼠單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標鼠雜人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等的美國專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國專利No.5,225,539,和Queen等的美國專利No.5,530,101;5，585，089;5,693,762和6,180,370)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗PD-L1人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別被稱作HuMab小鼠和KM小鼠TM的小鼠，并且在此通稱為"人Ig小鼠"。HuMab小鼠(Medarex，Inc.)包含編碼未重排的人重鏈Oi和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源p和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或K表達降低，并且響應于免疫，導入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.等(1994),同上；綜述Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻中詳細描述Taylor,L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen,J.等(1993)InternationalImmunology5:647-656;Tuaillon等(1993)Pro"Natl.Acad.SciUSA90:3720-3724;Choi等(1993)NatureGenetics4:117-123;Chen,J.等(1993)EMBOJ.12:821-830;Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等(l994)InternationalImmunology6:579-591;和Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851,這些文獻的內(nèi)容全文引入本文作為參考。進一步參見，Lonberg和Kay的美國專利No.5,545,806;5，569,825;5，625，126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;和5,770,429;和Surani等的美國專利No.5,545,807;Lonberg和Kay的PCT公布號WO92/03918，WO93/12227，WO94/25585，WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962;和Korman等的PCT公布號WO01/14424。在另一實施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此被稱為"KM小鼠TM",在Ishida等的PCT公布WO02/43478中詳細描述。再者，表達人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)在本領域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等的美國專利No.5,939,598;6,075，181;6,114，598;6,150,584和6,162,963中描述。而且，表達人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)在本領域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠"；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。另外，本領域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889-894)，其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等的美國專利No.5,223,409;5，403，484;和5,571,698;Dower等的美國專利No.5,427,908和5,580,717;McCafferty等的美國專利No.5,969,108和6,172,197;和Griffiths等的美國專利No.5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,9130，31，32,33，34，35和36,593,081。本發(fā)明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構了人免疫細胞，因此在免疫時能夠產(chǎn)生人抗體應答。這種小鼠在例如Wilson等的美國專利No.5,476,996和5,698,767中描述。人Ig小鼠的免疫當使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時，根據(jù)Lonberg,N.等(1994)Nature368(6474):856-859;Fishwild,D.等(l996)NatureBiotechnology14:845-851;和PCT公布WO98/24884和WO01/14424所述，用純化的或富集的PD-L1抗原和/或重組PD-L1或PD-L1融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的PD-L1抗原的制劑(5-50iag)腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。產(chǎn)生抗PD-L1完全人單克隆抗體的詳細程序在下面的實施例1中描述。應用各種抗原積累的經(jīng)驗證明，當最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應答。但是，發(fā)現(xiàn)弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時，全細胞具有高度免疫原性。在免疫方案進程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-PD-Ll人免疫球蛋白效價的小鼠進行融合。用抗原對小鼠進行靜脈內(nèi)加強免疫，3天后處死并且取出脾臟。預期每次免疫可能需要2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另夕卜，HCo7和HCo12轉(zhuǎn)基因可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠?？商娲鼗蛘吡硗?，如實施例1所述，可以使用KM小鼠TM系。產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細胞和/或淋巴結細胞，并且與合適的無限增殖化細胞系(例如小鼠骨髓瘤細胞系)融合。根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，可以使用50%PEG,將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1580)融合。將細胞以大約2xl05的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20%胎克隆血清，18%"653，，條件基質(zhì)，5%Origen(IGEN)，4mML-谷氨酰胺，lmM丙酮酸鈉，5mMHEPES，0.055mM2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;融合后24小時加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后通過ELISA根據(jù)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ.)進4亍親和層析。洗脫下來的IgG通過;疑月交電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且在-8(TC下保存。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備利用(例如)本領域公知的重組DNA技術和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison,S.(1985)science229:1202),也能在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達抗體或其抗體片段，可通過標準分子生物學技術(例如，使用表達目標抗體的雜交瘤進行PCR擴增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA,并將該DNA插入到表達載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術語"有效連接"意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預期功能。選擇與所用的表達宿主細胞相匹配的表達載體和表達控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個基因插入到同一表達載體中。通過標準方法將抗體基因插入到表達載體中(例如，抗體基因片段上的互補限制性位點與載體連接，或者如果不存在限制性位點的活，則平端連接)。通過插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，使得VH區(qū)段與載體中的CH區(qū)段有效連接，而Vk區(qū)段與栽體中的Cl區(qū)段有效連接，可以利用本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)產(chǎn)生任意抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者可替代地，重組表達載體能編碼有利于宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列。術語"調(diào)節(jié)序列，，包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序歹寸例如在Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990))中描述。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如來源于巨細胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子?？商娲乜梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動子或(3-珠蛋白啟動子。另夕卜，調(diào)節(jié)元件也可由來自諸如SRoc啟動子系統(tǒng)等不同來源的序列組成，SRa啟動子系統(tǒng)含有來自SV40早期啟動子的序列和人1型T細胞白血病病毒的長末端重復序列(Takebe，Y.66等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細胞中復制的序列(例如，復制起點)和選擇性標記基因。選擇性標記基因有利于篩選載體已經(jīng)導入其中的宿主細胞(參見，例如，Axel等的美國專利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，選擇性標記基因一般給已經(jīng)導入載體的宿主細胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨曱喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用于氨曱喋呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。術語"轉(zhuǎn)染"的各種形式包括常用于將外源DNA導入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細胞中，最優(yōu)選在哺乳動物宿主細胞中表達該抗體，因為這樣的真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報道，原核表達抗體基因無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss，M.A.和Wood,C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表達本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卯巢(CHO細胞)(包括Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CHO細胞，和DHFR選擇性標記一起4吏用，例如，如R.J,Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS纟田胞和SP2纟田月包。特別地，用于NSO骨髓瘤細胞的另一種優(yōu)選表達系統(tǒng)是WO87/04462、WO89/01036和EP338,841公開的GS基因表達系統(tǒng)。當將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細胞中表達的時間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細胞生長的培養(yǎng)基中的時間，而產(chǎn)生抗體?？蓱脴藴实鞍踪|(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。抗體與抗原結合的表征通過(例如)標準ELISA，可以檢測本發(fā)明的抗體與PD-L1的結合。簡要地說，用0.25嗎/ml的純化PD-L1在PBS中的溶液包被樣i量滴定板，然后用PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。向各個孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自PD-L1免疫小鼠的血漿的稀釋液)，并且在37。C下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，之后和與^^性磷酸酶偶聯(lián)的第二試劑(例如，對于人抗體，為山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑)一起在37。C下溫育1小時。洗滌后，培養(yǎng)板用pNPP底物(lmg/ml)顯色，并且在OD405-650下分析。優(yōu)選地，用表現(xiàn)出最高效價的小鼠進行融合。如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與PD-L1免疫原有陽性反應性的雜交瘤。將與PD-L1高親合力結合的雜交瘤進行亞克隆，并且進一步表征。從每個雜交瘤中選擇保留母細胞反應性的一個克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細胞庫，保存在-140。C下，用于抗體純化。為了純化抗-PD-Ll抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD，確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80。C下保存。為了確定選擇的抗-PD-Ll單克隆抗體是否與獨特表位結合，可以使用商售試劑(Pierce，Rockford,IL)將每種抗體生物素化?？梢允褂萌缟纤龅腜D-L1包一皮的ELISA板，應用未標記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進行竟爭研究?？梢允褂面溍箍股锼氐鞍?堿性磷酸酶探針檢測生物素化mAb的結合。為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對特定同種型抗體具有特異性的試劑進行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4。C下用l|ag/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用1%BSA封閉之后，平板與l)ag/ml或更少的測試單克隆抗體或純化的同種型對照物在室溫下反應1-2小時。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應。如上所述使平板顯色并且分析?？梢酝ㄟ^Western印跡法進一步檢測抗-PD-Ll人IgG與PD-L1抗原的反應性。簡要地說，制備PD-L1并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測的單克隆抗體探查。人IgG的結合可以用抗人IgG堿性磷酸酶才企測，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,Mo.)顯色?？贵w的物理性質(zhì)本發(fā)明的抗體可以進一步通過抗PD-L1抗體的各種物理性質(zhì)進行表征?？梢岳酶鞣N試驗基于這些物理性質(zhì)檢測和/或區(qū)分不同類別的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中含有一個或多個糖基化位點。可變區(qū)中一個或多個糖基化位點的存在可能由于抗原結合改變而導致抗體的免疫原性提高或者抗體的pK改變(Marshall等(1972)AnnuRevBiochem41:673-702;GalaFA和MorrisonSL(2004)JImmunol172:5489-94;Wallick等人(1988)JExpMed168:1099-109;SpiroRG(2002)Glycobiology12:43R畫56R;Parekh等(1985)Nature316:452-7;Mimura等人(2000)MolImmunol37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序處發(fā)生。可變區(qū)糖基化可以用Glycoblot試驗進行檢測，該試驗切割抗體，產(chǎn)生Fab，然后利用測定高碘酸鹽氧化和席夫堿形成的試驗檢測糖基化?；蛘?，可變區(qū)糖基化也可以用Dionex光層析法(Dionex-LC)檢測，該方法從Fab上切下糖成為單糖，并且分析各個糖的含量。在某些情況中，優(yōu)選不含可變區(qū)糖基化的抗-PD-Ll抗體。這可以通過選擇在可變區(qū)中不含糖基化基序的抗體或者利用本領域公知的標準技術突變糖基化基序內(nèi)的殘基來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體不含天冬酰胺異構化位點。脫酰胺或異天冬氨酸作用可以分別在N-G或D-G序列上發(fā)生。脫酰胺或異天冬氨酸作用導致產(chǎn)生異天冬氨酸，這通過在側鏈羧基末端而不是在主鏈上產(chǎn)生扭結的結構而降低了抗體的穩(wěn)定性。異天冬氨酸的產(chǎn)生可以用iso-quant試驗來測定，該試驗利用反相HPLC檢測異天冬氨酸。每種抗體具有獨特的等電點(pi)，但是通?？贵w落入6至9.5的pH范圍內(nèi)。IgGl抗體的pi—般落入7-9.5的pH范圍內(nèi)，IgG4抗體的pI—般落入6-8的pH范圍內(nèi)?？贵w可以具有該范圍之外的pl。盡管這種作用通常未知，但是推測pi落于正常范圍之外的抗體在體內(nèi)條件下可能具有一定的解折疊和不穩(wěn)定性。等電點可以用毛細管等電聚焦試驗來測定，該試驗產(chǎn)生pH梯度，并且可以利用激光聚焦來提高精確性(Janini等(2002)Electrophoresis23:1605-11;Ma等(2001)Chromatographia53:S75-89;Hunt等(1998)JChromatogrA800:355-67)。在某些情況中，優(yōu)選pI值落入正常范圍內(nèi)的抗PD-Ll抗體。這可以通過選擇pi位于正常范圍內(nèi)的抗體或者通過利用本領域公知的標準技術突變帶電荷的表面殘基來實現(xiàn)。每種抗體的熔解溫度指示熱穩(wěn)定性(KrishnamurthyR和ManningMC(2002)CurrPharmBiotechnol3:361-71)。較高的熱穩(wěn)定性表示在體內(nèi)有較高的總體抗體穩(wěn)定性?？贵w的熔點可以用諸如差示掃描量熱法(Chen等(2003)PharmRes20:1952-60;Ghirlando等(1999)ImmunolLett68:47-52)等技術來測量。TM1表示抗體最初解折疊的溫度。T磁表示抗體完全解折疊的溫度。通常，優(yōu)選地本發(fā)明的抗體的T固大于60。C，優(yōu)選大于65°C,甚至更優(yōu)選大于70°C。此外，抗體的熱穩(wěn)定性也可以利用圓二色性來測量(Murray等(2002)J，ChromatogrSci40:343-9)。本文公開的抗PD-L1抗體的熱穩(wěn)定性總結在表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在一個優(yōu)選實施方案中，選擇不快速降解的抗體?？筆D-L1抗體的破裂可以用本領域公知的毛細管電泳(CE)和MALDI-MS來測定(AlexanderAJ和HughesDE(1995)AnalChem67:3626-32)。在另一個優(yōu)選實施方案中，選擇具有最小的聚集作用的抗體。聚集可以導致觸發(fā)不希望的免疫應答和/或改變的或不利的藥代動力學性質(zhì)。通常，抗體具有25%或更少的聚集是可以接受的，優(yōu)選20%或更少，甚至更優(yōu)選15%或更少，甚至更優(yōu)選10%或更少，甚至更優(yōu)選5°/?；蚋?。聚集可以用本領域公知的幾種技術來測定，包括大小排阻柱(SEC)高效液相層析(HPLC)和光散射法，用來鑒定單體、二聚體、三聚體或多聚體。免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明涉及與諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯(lián)的抗-PD-Ll抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為"免疫偶聯(lián)物"。包括一個或多個細胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作"免疫毒素"。細胞毒素或細胞毒劑包括對細胞有害(例如殺傷細胞)的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和噤呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基噤呤、6-硫代鳥。票呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧。定、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酉臾氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酉臾氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(n)(DDP)順鉬)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC)),和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的彩f生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個例子是可作為商品購得的(MylotargTM;Wyeth-Ayerst)。可以利用本領域使用的連接體技術將細胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細胞毒素與抗體偶聯(lián)的連接體類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體?？梢赃x擇，例如，在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在胂瘤組織中優(yōu)先表達的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關于細胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的連接體和方法的進一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;Trail,P.A.等(2003)Cancer,Immunol.Immunother.52:328-337;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter,P.D.和Springer,C丄(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細胞毒性放射性藥物，也被稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括Zevalin(IDECPharmaceuticals)和Bexxar(CorixaPharmaceuticals),并且能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可用于修飾特定的生物學反應，且藥物部分不應理解為局限于經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-y;或生物學反應調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1("IL-1")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒細胞集落刺激因子("G-CSF")或其他生長因子。將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術是眾所周知的，參見，例如，Amon等，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等(ed.)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",inpp.303-16(AcademicPress1985),和Thorpe等,"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates,"Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。雙特異性分子另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗-PD-L1抗體或其片段的雙特個功能性分子上，如另一個肽或蛋白質(zhì)(例如另一個抗體或受體的配體)上，從而生成可與至少兩個不同結合位點或靶分子結合的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體實際上可以被衍生化或連接到一個以上的其他功能性分子上，從而生成可與兩個以上不同結合位點和/或革巴分子結合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在本文使用的術語"雙特異性分子"內(nèi)。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可與一個或多個其他結合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結合模擬物功能性連接(如通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價結合等)，從而得到雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，其具有至少一種對于PD-L1的第一結合特異性和對于第二種目標表位的第二結合特異性。在本發(fā)明一個特定實施方案中，第二種目標表位是Fc受體，如人FcyRI(CD64)或人Fca受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括既能與表達FcyR或FcaR的效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))結合，又能與表達PD-L1的靶細胞結合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達PD-L1的細胞導向于效應細胞，并且觸發(fā)Fc受體介導的效應細胞活性，如表達PD-L1的細胞的吞噬作用、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放、或超氧陰離子的產(chǎn)生。在其中雙特異性分子是多特異性分子的本發(fā)明的一個實施方案中，除抗-Fc結合特異性和抗-PD-Ll結合特異性之外，該分子還可包括第三結合特異性。在一個實施方案中，該第三結合特異性是抗增強因子(EF)部分，例如與參與細胞毒性活性的表面蛋白質(zhì)結合因而增強針對靶細胞的免疫應答的分子。"抗增強因子部分"可以是與諸如抗原或受體等特定分子結合，從而導致結合決定簇對Fc受體或靶細胞抗原的作用增強的抗體、功能性抗體片段或配體。"抗增強因子部分"可與Fc受體或靶細胞抗原結合。可替代地，抗增強因子部分可以與一種實體結合，該實體不同于第一和第二結合特異性所結合的實體。例如，抗增強因子部分可與細胞毒性T細胞結合(如經(jīng)由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細胞，該細胞導致針對靶細胞的免疫應答增強)。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段作為結合特異性，包括(例如)Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其最小片段，如Fv或單鏈構建體，如Ladner等的美國專利No.4,946,778所述，該專利的內(nèi)容引入本文作為參考。在一個實施方案中，對于Fc7受體的結合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。本文使用的術語"IgG受體"是指位于染色體1上的8個y-鏈基因的任意一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分組為3個Fcy受體類別FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)cY受體是人高親和力FcyRI。人FcyRI是72kDa的分子，對單體^0表現(xiàn)出高親和力(108-109^1-1)。某些優(yōu)選抗-Fcy單克隆抗體的制備和表征由Fanger等在PCT申請WO88/00052和美國專利號4,954,617中描述，在此處將其內(nèi)容整體引入作為參考。這些抗體在與受體的Fcy結合位點不同的位點處與FcyRI、FcYRII或FcYRIII的表位結合，因而，其結合基本不被生理學水平的IgG阻斷?？捎糜诒景l(fā)明中的特定抗-FcyRI抗體為mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。產(chǎn)生mAb32的雜交瘤可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，ATCC保藏號為HB9469。在另外一些實施方案中，抗-Fcy受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征在G認iano,R.F.等(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和Tempest等的PCT公布WO94/10332中描述。產(chǎn)生H22抗體的細胞系以HA022CL1的名稱保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CRL11177。在另外一些優(yōu)選實施方案中，對Fc受體的結合特異性由可與人IgA受體如Fc-a受體(FcaRI(CD89))結合的抗體提供，該抗體的結合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語"IgA受體"包括位于染色體19上的一個a-基因的基因產(chǎn)物(FcaRI)。已知該基因編碼幾個55-110kDa的可變剪接跨膜同種型。FcaRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性和嗜中性粒細胞上組成型表達，但不在非效應細胞群體上組成型表達。FcaRI對IgAl和IgA2兩者均具有中等親和力(約5xl07M"),在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細胞因子后該親和力增力口(Morton，H.C.等(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已描述了4種FcaRI-特異性單克隆抗體，它們-敗確定為A3、A59、A62和A77，它們在IgA配體結合域之外與FcaRI結合(Monteiro,R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。FcotRI和Fc7RI是用于本發(fā)明的雙特異性分子的優(yōu)選觸發(fā)受體，因為它們(l)主要表達于諸如單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞的免疫效應細胞上；(2)高水平表達(如每個細胞表達5,000-100，000個)；(3)是細胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介質(zhì)；(4)介導導向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強的抗原呈遞。優(yōu)選人單克隆抗體，可以在本發(fā)明的雙特異性分子中使用的其他抗體包括鼠、嵌合和人源化單克隆抗體?？赏ㄟ^應用本領域中公知的方法偶聯(lián)組成的結合特異性，如抗-FcR和抗-PD-Ll結合特異性，制備本發(fā)明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結合特異性可單獨生成，然后彼此偶聯(lián)。當結合特異性是蛋白質(zhì)或肽時，可以使用多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑進行共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5,5，-二硫代二(2-硝基苯曱酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己基-l-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132);Brennan等(1985)Science229:81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可從PierceChemicalCo.(Rockford，IL)獲得。當結合特異性是抗體時，它們可通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而偶聯(lián)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，對鉸鏈區(qū)進行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個，優(yōu)選l個巰基殘基?？商娲?，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細胞中表達和裝配。當雙特異性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab，)2或配體xFab融合蛋白時，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和一個結合決定簇的單鏈分子，或包含兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個單鏈分子。制備雙特異性分子的方法例如在美國專利5,260,203、美國專利5,455,030、美國專利4,881,175、美國專利5,132,405、美國專利5,091,513、美國專利5,476,786、美國專利5,013,653、美國專利5,258,498和美國專利5,482,858中描述。定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(如生長抑制)或Western印跡分析來證實。這些試驗中的每一個通常通過應用對目標復合物具有特異性的標記試劑(如抗體)來檢測特定目標蛋白質(zhì)-抗體復合物的存在。例如，可以利用識別和特異性結合抗體-FcR復合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測FcR-抗體復合物。或者，這些復合物可利用多種其他免疫分析中的任一種來檢測。例如，可對抗體進行放射性標記并且在放射免疫測定(RIA)中使用(參見，例如，Weintraub,B.，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,1986年3月，引入本文作為參考)?？梢酝ㄟ^諸如使用y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器的手段或者通過放射自顯影方法^f全測放射性同位素。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以含有結合靶抗原上的不同表位或具有互補本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體聯(lián)合至少一種其他的抗炎劑或免疫抑制劑。可在聯(lián)合治療中使用的治療劑的例子在下面本發(fā)明抗體的應用一節(jié)中更詳細地描述。本文使用的"藥學上可接受的載體"包括生理學相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包裹于一種材料中，以保護該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學上可接受的鹽。"藥學上可接受的鹽"是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和石威加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、^琉酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N,N，-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機胺衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的例子包括(l)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、石危酸氫鈉、焦亞好u酸鈉，亞碌u酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥曱苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、oc-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本發(fā)明藥物組合物中的適當?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射用有機酯如油酸乙酯。例如通過應用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應用表面活性劑，能夠維持適當?shù)牧鲃有浴＿@些組合物還可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對羥基苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑范圍外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應用。還可以向組合物中摻入補充的活性化合物。治療,性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卯磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當?shù)牧鲃有浴Ｔ诤芏嗲闆r下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空千燥和冷凍干燥(凍干)，由其預先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100%計，這個量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學上可接受的載體相組合。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的期望的反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個單位含有預定量的活性化合物，經(jīng)計算該預定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨特特性和要達到的特定治療效果，和(b)本領域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。對于抗體的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg范圍內(nèi)。一個治療方案的例子需要每周給藥一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-PD-Ll抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體〗吏用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周lmg/kg體重。在一些方法中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)。抗體通常在有必要時多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達到約l-1000|ag/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300|ig/mI?？商娲兀贵w也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預防性的還是治療性的而不同。在預防性應用中，在長時間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預防性方案給患者給藥。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可能改變，以獲得可有效實現(xiàn)對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學因素，包括應用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，應用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與應用的特定組合物聯(lián)合應用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學領域中公知的類似因素。本發(fā)明的抗-PD-L1抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地導致疾病癥狀的嚴重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對于PD-Ll+腫瘤的治療，相對于未接受治療的受試者，"治療有效劑量，，優(yōu)選地將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%，更優(yōu)選至少約40%,更優(yōu)選至少約60%,更優(yōu)選至少約80%?；衔镆种颇[瘤生長的能力可以在預測對人類腫瘤的療效的動物模型系統(tǒng)中評價?；蛘撸部梢酝ㄟ^檢查化合物抑制細胞生長的能力來評價該組合物的這種性能，這種抑制可以通過本領域技術人員公知的試驗在體外測定。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領域技術人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。本發(fā)明的組合物可以利用本領域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領域技術人員應當理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文使用的短語"腸胃外給藥"是指除腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。可替代地，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。活性化合物可以與保護化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護或者通常為本領域技術人員所公知。參見，例如，SustainedandcontrolledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。治療性組合物可應用本領域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603,該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利No.4,486,194,該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233,該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No.4,447,224，該專利7>開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利No.4，439，196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利No.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利引入本文作為參考。本領域技術人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。在某些實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可配制為確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運入特定細胞或器官內(nèi)的一個或多個部分，從而增強定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等的美國專利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134);pl20(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也參見K.Keinanen;M丄.Laukka腿(1994)FEBSLett.346:123;J丄Killion;U.Fidler(1994)Immunomethods4:273。本發(fā)明的應用和方法本發(fā)明的抗體、抗體組合物和方法，具有與(例如)PD-L1的檢測或通過PD-L1的阻斷增強免疫應答有關的許多體外和體內(nèi)應用。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體。例如，這些分子可以施用于在體外或離體培養(yǎng)的細胞，或者(例如)在體內(nèi)施用于人類受試者，從而在多種情況中增強免疫。因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種改變受試者中的免疫應答的方法，包括給該受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分，使得該受試者中的免疫應答被改變。優(yōu)選地，該應答增強、刺激或上調(diào)。本文使用的術語"受試者，，包括人和非人動物。非人動物包括所有脊推動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動物和爬行類動物，但是優(yōu)選哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛和馬。優(yōu)選的受試者包括需要增強免疫應答的人類患者。這些方法特別適合治療患有可通過增強T細胞介導的免疫應答而治療的疾病的人類患者。在特定實施方案中，該方法特別適合在體內(nèi)治療癌細胞。為了實現(xiàn)免疫的抗原特異性增強，抗PD-L1抗體可以與目標抗原一起給藥。當抗PD-L1抗體與另外一種藥物一起給藥時，這兩種藥物可以相繼或同時給藥。本發(fā)明進一步提供檢測樣品中人PD-L1抗原的存在或測量人PD-L1抗原的量的方法，包括在抗體或其部分與人PD-L1之間能夠形成復合物的條件下，使樣品和對照樣品接觸可與人PD-L1特異性結合的的人單克隆抗體或其抗原結合部分。然后檢測復合物的形成，其中樣品與對照樣品之間復合物形成的差異指示樣品中存在人PD-L1抗原。癌癥抗體對PD-L1的阻斷可以增強患者中對癌細胞的免疫應答。PD-L1在正常人細胞中不表達，但是富含于多種人類癌中(Dong等(2002)NatMed.8:787-9)。PD-1與PD-L1的相互作用導致浸潤腫瘤的淋巴細胞減少，T細胞受體介導的增殖減少，以及癌細胞的免疫逃脫(Dong等(2003)JMolMed81:281-7;Blank等(2004)CancerImmunol.Immunother.[epub];Konishi等(2004)Clin.CancerRes.10:5094-100)。抑制PD-Ll與PD-1的局部相互作用可以逆轉(zhuǎn)免疫抑制，當PD-L2與PD-1的相互作用也被阻斷時，效應是加合的(Iwai等(2002)PNAS99:12293-7;B雨n等(2003)J.Immunol.170:1257-66).抗-PD-Ll抗體可以單獨使用，以抑制癌性腫瘤的和平共處?；蛘撸缫韵滤?，抗-PD-Ll抗體可以與其4也免疫原性劑、標準癌癥治療或其他抗體聯(lián)合使用。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分。優(yōu)選地，該抗體是人抗-PD-Ll抗體(如本文描述的任意人抗-PD-Ll抗體)。另外或者可替代地，該抗體可以是嵌合或人源化抗-PD-Ll抗體。使用本發(fā)明的抗體可以抑制其生長的優(yōu)選的癌癥包括一般對免疫治療有應答的癌癥。可治療的優(yōu)選癌癥的非限制性的例子包括黑素瘤(例如轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤)、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌?？梢杂帽景l(fā)明的方法治療的其他癌癥的例子包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環(huán)境誘發(fā)的癌癥，包括石棉誘發(fā)的癌癥，以及所述癌癥的組合。本發(fā)明也可用于治療轉(zhuǎn)移性癌，特別是表達PD-L1的轉(zhuǎn)移性癌(Iwai等(2005)Int.Immunol.17:133-144)。任選地，PD-L1抗體可以與免疫原性劑如癌細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽和碳水化合物分子)、細胞和用編碼免疫刺激細胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細胞聯(lián)用(He等(2004)J.Immunol.173:4919-28)?？梢詰玫哪[瘤疫苗的非限定性實例包括黑素瘤抗原的肽，如gpl00的肽、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶，或轉(zhuǎn)染后表達細胞因子GM-CSF的肺瘤細胞(下文進一步討論)。在人類中，已經(jīng)表明一些腫瘤是具有免疫原性的，如黑素瘤。預期通過PD-L1阻斷來提高T細胞活化的閾值，可以激活宿主中的肺瘤應答。當與接種方案聯(lián)合時，PD-L1阻斷可能最有效。已經(jīng)設計了針對胂瘤接種的許多實驗策略(參見Rosenberg,S.,2000,DevelopmentofCancerVaccines,ASCOEducationalBookSpring:60-62;Logothetis,C，2000,ASCOEducationalBookSpring:300-302;Khayat，D.2000,ASCOEducationalBookSpring:414-428;Foon，K.2000,ASCOEducationalBookSpring:730-738;參見Restifo,N.和Sznol,M.,CancerVaccines,Ch.61,pp.3023-3043，DeVita,V,等(eds.),1997，Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology.第五版)。在這些策略之一中，使用自體或異體腫瘤細胞制備疫苗。已經(jīng)證明，當腫瘤細胞被轉(zhuǎn)導而表達GM-CSF時，這些細胞疫苗最有效。已經(jīng)表明GM-CSF是用于腫瘤接種的抗原呈遞的強激活劑(Dranoff等(1993)ProaNatl.Acad.SciU.S.A.90:3539-43)。各種腫瘤中基因表達和大規(guī)?；虮磉_模式的研究導致定義了所謂的腫瘤特異性抗原(Rosenberg,SA(1999)Immunity10:281-7)。在許多情況下，這些腫瘤特異性抗原是在腫瘤和產(chǎn)生腫瘤的細胞中表達的分化抗原，例如gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，證明這些抗原中的許多是在宿主中發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性T細胞的靶標。PD-L1阻斷可以與重組蛋白和/或腫瘤中表達的肽的組合聯(lián)用，以產(chǎn)生針對這些蛋白質(zhì)的免疫應答。這些蛋白質(zhì)在正常情況下被免疫系統(tǒng)看作自身抗原，因此對其耐受。腫瘤抗原也可以包括蛋白質(zhì)端粒酶，該酶是染色體的端粒合成所必需的，并且在85%以上的人類癌中表達，而僅在有限數(shù)量的自身組織中表達(Kim,N等(1994)Science266:2011-2013)。(這些自身組織可以通過各種手段被保護而免遭免疫攻擊)。由于體細胞突變改變蛋白質(zhì)序列或產(chǎn)生兩種無關序列的融合蛋白(例如，Philadelphia染色體中的bcr-abl)或來自B細胞肺瘤的獨特型，肺瘤抗原也可以是癌細胞表達的"新抗原"。其他腫瘤疫苗可以包括來自與人類癌癥有關的病毒的蛋白質(zhì)，如人類乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西皰瘆肉瘤病毒(KHSV)。可以與PD-L1阻斷聯(lián)合應用的另外一種形式的腫瘤特異性抗原是從腫瘤組織本身中分離的純化的熱休克蛋白(HSP)。這些熱休克蛋白含有來自腫瘤細胞的蛋白質(zhì)的片段，這些HSP在向抗原呈遞細胞遞送以引發(fā)腫瘤免疫方面非常有效(Suot，R和Srivastava,P(1995)Science269:1585-1588;Tamura，Y.等(1997)Science278:117-120)。樹突細胞(DC)是強抗原呈遞細胞，可以用來引發(fā)抗原特異性應答。DC可以在體外產(chǎn)生，并且載有各種蛋白質(zhì)和肽抗原以及腫瘤細胞提取物(Nestle，F(xiàn).等(1998)NatureMedicine4:328-332)。DC也可以通過遺傳手段轉(zhuǎn)導，從而也表達這些腫瘤抗原。DC也已經(jīng)為了免疫而直接融合到腫瘤細胞上(Kugler,A.等(2000)NatureMedicine6:332-336)。作為接種方法，DC免疫可以與PD-L1阻斷有效地組合，以激活更強的抗腫瘤應答。PD-L1阻斷也可以與標準癌癥治療組合。PD-L1阻斷可以與化療方案有效地組合。在這些例子中，它可以減少施用的化療劑的劑量(Mokyr,M.等(1998)CancerResearch58:5301-5304)。這種組合的一個例子是抗PD-L1抗體與氨烯咪胺聯(lián)用治療黑素瘤。這種組合的另外一個實例是抗PD-L1抗體與白介素-2(IL-2)聯(lián)用治療黑素瘤。PD-L1阻斷和化學療法聯(lián)用的科學原理是細胞死亡，這是大多數(shù)化療化合物的細胞毒性作用的結果，應會導致抗原呈遞途徑中的腫瘤抗原水平升高?？梢酝ㄟ^細胞死亡與PD-L1阻斷協(xié)同作用的其他聯(lián)合治療有放射、手術和激素剝奪(hormonedeprivation)。這些方案都在宿主中產(chǎn)生腫瘤抗原的來源。血管發(fā)生抑制劑也可以與PD-L1阻斷組合。血管發(fā)生的抑制導致腫瘤細胞死亡，這可以將腫瘤抗原提供給宿主的抗原呈遞途徑。PD-L1阻斷抗體也可以與將Fca或Fcy受體表達效應細月包革巴向至胂瘤細胞的雙特異性抗原聯(lián)合應用(參見，例如美國專利Nos.5,922.845和5，837，243)。也可以利用雙特異性抗體輩巴向兩種不同的87抗原。例如，已經(jīng)利用抗-Fc受體/抗腫瘤抗原(例如Her-2/neu)雙特異性抗體將巨噬細胞耙向腫瘤部位。這種靶向可以更有效地激活腫瘤特異性應答。利用PD-L1阻斷可以加強這些應答的T細胞方面?；蛘?，可以利用結合肺瘤抗原和樹突細胞特異性細胞表面標記的雙特異性抗體將抗原直接遞送至DC。腫瘤通過多種機制逃避宿主的免疫監(jiān)視。其中許多機制可以通過滅活腫瘤表達的免疫抑制性蛋白質(zhì)來克服。尤其包括TGF-(3(KehrLJ.等(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.和O'Garra，A.(1992)ImmunologyToday13:198-200)和Fas配體(Hahne，M.等(1996)Science274:1363-1365)。每種個體的抗體可以與抗PD-Ll聯(lián)用，來抵抗免疫抑制劑的作用，并且有利于宿主的腫瘤免疫應答。可以用于激活宿主免疫應答的其他抗體可以與抗PD-Ll聯(lián)用。其中包括樹突細胞表面上的分子，這些分子激活DC功能和抗原呈遞?？?CD40抗體能夠有效地替代T細胞輔助活性(Ridge,J.等(1998)Nature393..474-478),并且可以與PD-Ll抗體聯(lián)用(Ito，N.等(2000)Immunobiology201(5)527-40)。也可以為了提高T細胞活化的水平而提供對T細胞共刺激分子如OX-40(Weinberg,A.等(2000)Immunol164:2160-2169)、4-1BB(Melero，I.等(1997)NatureMedicine3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A,等(1999)Nature397:262-266)的活化抗體以及阻斷陰性共刺激分子如CTLA-4(例如，美國專利No.5，811,097)或BTLA(Watanabe，N.等(2003)NatImmunol4:670-9)、B7-H4(Sica,GL等(2003)Immunity18:849-61)的活性的抗體。骨髓移植當前用來治療造血來源的多種腫瘤。移植物抗宿主疾病是這種治療的一種后果，移植物對抗腫瘤的應答可以獲得治療性益處。可以利用PD-Ll阻斷提高植入了腫瘤特異性T細胞的供體的有效性。也有幾種實驗治療方案涉及抗原特異性T細胞的離體激活和擴增以及這些細胞向受體內(nèi)的過繼轉(zhuǎn)移，以用抗原特異性T細胞對抗胂瘤(Greenberg，R.和Riddell，S.(1999)Science285:546-51)。這些方法也可以用來激活T細胞對傳染原如CMV的應答。預期在抗PD-L1抗體存在下離體激活可以提高過繼轉(zhuǎn)移的T細胞的頻率和活性。傳染病可利用本發(fā)明的其他方法治療暴露于特定毒素或病原體的患者。因此，本發(fā)明的另一方面提供一種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用抗PD-L1抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。優(yōu)選地，所述抗體是人抗人PD-L1抗體(如本文所述的任意人抗PD-L1抗體)。另外或者可替代地，所述抗體可以是嵌合或人源化抗體。類似于它對于如上所述的胂瘤的應用，抗體介導的PD-L1阻斷可以單獨使用，或者作為佐劑使用，與疫苗組合使用，來刺激對病原體、毒素和自身抗原的免疫應答。特別可以應用該治療方法的病原體的實例包括當前沒有有效疫苗的病原體，或常規(guī)疫苗不完全有效的病原體。其中包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、皰滲病毒、賈第蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌。PD-L1阻斷特別可用于對抗諸如HIV等病原體已建立的感染，其在感染過程中呈現(xiàn)改變的抗原。在抗人PD-L1給藥時，這些新的表位被作為外源物識別，從而引起不受通過PD-L1的負信號影響的強T細胞應答。引起可用本發(fā)明的方法治療的傳染病的病原體病毒的一些實例包括HIV、肝炎(甲、乙、丙)、皰滲病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6,HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、蟲媒病毒、?？刹《?、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮A袈炎病毒、4侖狀病毒、麻滲病毒、風滲病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲々某病毒腦炎病毒、引起可用本發(fā)明的方法治療的傳染病的病原體細菌的一些實例包括衣原體、立克次氏體菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌(conococci)、克雷伯氏桿菌、變形菌、雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體、和萊姆病細菌。引起可用本發(fā)明的方法治療的傳染病的病原體真菌的一些實例包括假絲酵母(白假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等)、新型隱球菌、曲霉屬(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉屬(毛霉、犁頭霉、根霉)、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夾膜組織胞漿菌。引起可用本發(fā)明的方法治療的傳染病的病原體寄生蟲的一些實例包括溶組織內(nèi)阿米巴、結腸小袋纖毛蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴屬的種、蘭伯賈第蟲、隱孢子蟲屬的種、卡氏肺嚢蟲、間日癥原蟲、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日圓線蟲。在所有上述的方法中，PD-L1阻斷可以與其他形式的免疫療法如細胞因子治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體治療聯(lián)合，雙特異性抗體治療提供增強的肺瘤抗原的呈遞(參見，例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:6444-6448;Poljak(1994)Structure2:1121-1123)。自身免疫反應抗PD-L1抗體可以激起和擴大自身免疫應答。實際上，使用腫瘤細胞和肽疫苗誘導抗胂瘤應答揭示了許多抗腫瘤應答涉及抗自身反應性(vanElsas等(同上)在抗-CTLA-4+GM-CSF-修飾的B16黑素瘤中觀察到的脫色；在接種Trp-2的小鼠中的脫色(Overwijk,W.等(1999)Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987));在人類臨床試驗中觀察到TRAMP腫瘤細胞疫苗引起的自身免疫前列腺炎(Hurwitz,A.(2000)同上)、黑素瘤肽抗原接種和白癲風(Rosenberg,SA和White,DE(1996)J.ImmunotherEmphasisTumorImmunol19(1):81-4)。因此，可以考慮利用抗PD-L1阻斷聯(lián)合多種自身蛋白質(zhì)來設計接種方案，以有效地產(chǎn)生對抗這些自身蛋白質(zhì)的免疫應答，用于疾病治療。例如，阿爾茨海默病涉及AP肽在腦中淀粉樣蛋白沉積物中的不當?shù)姆e累；針對淀粉樣蛋白的抗體應答能夠清除這些淀粉樣蛋白沉積物(Schenk等(1999)Nature400:173-177)。也可以使用其他自身蛋白作為靶標，如用于治療變態(tài)反應和哞喘的IgE,和用于類風濕性關節(jié)炎的TNFoc。最后，可以利用抗PD-L1抗體誘導抗體對各種激素的應答。中和抗體對生殖激素的應答可以用于避孕。中和抗體對激素和特定腫瘤生長所需的其他可溶性因子的應答也可以被認為是可能的接種靶標。如上所述應用抗PD-L1抗體的類似方法可以用來誘導治療性自身免疫應答，以治療具有不恰當?shù)钠渌陨砜乖e累的患者，如淀粉狀蛋白沉積物，包括阿爾茨海默病中的Ap、細胞因子如TNFa和IgE。疫苗也可以通過共施用抗PD-L1抗體和目標抗原(例如疫苗)，利用抗PD-L1抗體刺激抗原特異性免疫應答。因此，本發(fā)明的一個方面提供了增強受試者中對抗原的免疫應答的方法，包括給該受試者施用(i)抗原；和(ii)抗PD-L1抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者中對抗原的免疫應答得到加強。優(yōu)選地，該抗體是人抗人PD-Ll抗體(如本文所述的任意人抗PD-L1抗體)。另外或者可替代地，該抗體可以是嵌合或人源化抗-PD-Ll抗體。所述抗原可以是，例如，胂瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。這些抗原的非限定性實例包括以上章節(jié)中所述的那些，例如以上所述的胂瘤抗原(或腫瘤疫苗)，或來自上述病毒、細菌或其他病原體的抗原?？?PD-Ll抗體也可以用來消除與疾病(如與結腸炎有關的T細胞抑制的萎縮病)有關的繼發(fā)效應(Kanai等(2003)J,Immunol.171:4156-63)。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種消除白細胞浸潤、降低T細胞產(chǎn)生IFN-y、IL-2和IFN-oc的方法。優(yōu)選地，所述抗體是人抗人PD-L1抗體(如本文所述的任意人抗PD-L1抗體)。另外或者可替代地，所述抗體可以是嵌合或人源化抗體?？筆D-L1抗體也可以用來治療如下疾病，如'lt性炎性疾病，如扁平苔蘚、T細胞介導的慢性炎性皮膚粘膜病(Youngnak-Piboo腦tanakit等(2004)ImmunolLetters94;215-22)。因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種用T細胞消除慢性炎性疾病的方法。優(yōu)選地，所述抗體是人抗人PD-L1抗體(如本文所述的任意人抗PD-L1抗體)。另外或者可替代地，所述抗體可以是嵌合或人源化抗體。在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)的適當途徑在本領域中公知，可以由本領域技術人員選擇。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下)給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或制劑。如前所述，本發(fā)明的人抗-PD-Ll抗體可以與諸如細胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑等一種或多種其他治療劑共同給藥。抗體可以與該治療劑連接(作為免疫復合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時給藥，或者可以與其他已知治療如抗癌治療例如i欠射治療共同應用。這些治療劑包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順柏、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對患者具有毒性或亞毒性的水平時有效。順鉑以100mg/劑的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的人抗-PD-Ll抗體或其抗原結合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對人腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用的不同的機制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或胂瘤細胞抗原性改變(這將使它們對抗體沒有反應性)引起的問題。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括藥盒，該藥盒包括本發(fā)明的抗體組合物(例如人抗體、多特異性或雙特異性分子，或免疫偶聯(lián)物)和使用說明。該藥盒可以進一步包括至少一種另外的試劑或一種或多種另外的本發(fā)明的人抗體(例如，具有補充活性的人抗體，它所結合的PD-L1抗原上的表位與第一人抗體不同)。藥盒一般包括表明藥盒內(nèi)容物的預期用途的標簽。術語標簽包括在試劑盒上或與試劑盒一起提供的或以其他方式隨試劑盒提供的任何書面的或記錄的材料。本發(fā)明進一步通過下面的實施例進行闡述，不應將這些實施例理解為進一步的限制。全部附圖和在本申請中引用的全部參考文獻、專利和公開專利申請的內(nèi)容均引入本文作為參考。實施例實施例1:抗PD-L1人單克隆抗體的制備抗原免疫方案使用(i)包含PD-Ll的胞外部分的重組融合蛋白，和(ii)膜結合的全長PD-L1作為抗原。這兩種抗原都通過重組轉(zhuǎn)染方法在CHO細胞系中產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因小鼠(KM-小鼠氣系)用表達人抗體基因的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染色體KM系小鼠制備抗PD-L1的完全人類單克隆抗體。在這種小鼠系中，已經(jīng)如Chen等(1993)EMBOJ.12:811-820所述將內(nèi)源小鼠K輕鏈基因純合地破壞，并且已經(jīng)如PCT公布WO01/09187的實施例1對于HuMab小鼠所述將內(nèi)源小鼠重鏈基因純合地破壞。而且，該小鼠攜帶如Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851所述的人K輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5,和如PCT公布WO02/43478所述的SC20轉(zhuǎn)染色體。KM-小鼠⑧的免疫為了產(chǎn)生抗PD-L1的完全人類單克隆抗體，用純化的重組PD-Ll-Ig和PD-L1轉(zhuǎn)染的CHO細胞作為抗原免疫KM-小鼠@群體。用于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg,N.等(1994)Nature368(6474):856畫859;Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851和PCT公開WO98/24884中描述。在第一次輸注抗原時小鼠為6-16周齡。利用純化的重組PD-Ll-Ig制劑(5-50|ag)和5-10xl(^細胞腹膜內(nèi)(IP)、皮下(Sc)或通過足墊注射免疫小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠用在完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫兩次，然后用在不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原IP免疫3-21天(最多可達總共11次免疫)。通過眼眶后采血監(jiān)測免疫應答。通過ELISA對血漿進行篩選(如下文所述)，用具有足夠的抗-PD-Ll人免疫球蛋白效價的小鼠進行融合。用抗原經(jīng)靜脈內(nèi)對小鼠進行加強免疫，3天后處死并取出脾臟。每種抗原一般進行10-35次融合。每種抗原免疫幾十只小鼠。產(chǎn)生抗-PD-Ll抗體的KM-小鼠⑧的選擇為了選擇產(chǎn)生可與PD-L1結合的抗體的HuMab小鼠@,如Fishwild,D.等(1996)所述，通過ELISA檢測來自被免疫小鼠的血清。簡要地說，用在PBS中濃度為l-2^ig/ml的來自被轉(zhuǎn)染CHO細胞的純化重組PD-L1融合蛋白以100ili1/孔的量包被微量滴定板，4。C下溫育過夜，然后用PBS/Tween(0.05%)中的5%BSA以200^1/孔封閉。將來自PD-L1免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中，在室溫下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌培養(yǎng)板，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgG多克隆抗體在室溫下溫育1小時。洗滌后，培養(yǎng)板用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)顯色，并用分光光度計在OD415-495處分析。用顯示最高抗-PD-Ll抗體效價的小鼠進行融合。融合如下文所述進行，通過ELISA纟全測雜交瘤上清液的抗-PD畫Ll活性。產(chǎn)生抗PD-L1人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生根據(jù)標準程序，用PEG將從KM小鼠中分離的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后根據(jù)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。使用50。/。PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞單細胞懸液與1/4數(shù)量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCCCRL1581)融合。將細胞以約lxl0V孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養(yǎng)基中溫育約兩周，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、10%P388D1(ATCC，CRLTIB-63)條件培養(yǎng)基、在DMEM(Mediatech，CRL10013,含有高濃度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)中的3-5%origen(IGEN)，力口5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma,CRLP-7185)。l-2周后，將細胞在用HT替代了其中的HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后通過ELISA(如上所述)根據(jù)人抗PD-L1單克隆IgG抗體篩選各個孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天后監(jiān)測培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果對于人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將抗PD-L1單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的抗體用于進一步表征。選擇雜交瘤克隆3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4進一步分析。實施例2:人單克隆抗體3G10、12A4和10A5的結構表征利用標準PCR技術從3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4雜交瘤中獲得編碼3G10、12A4、10A5、5F8、IOHIO、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4單克隆抗體的重鏈和輕《連可變區(qū)的cDNA序列，并利用標準DNA測序4支術進行測序。3G10的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQIDNO:81和1中。3G10的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1B和SEQIDNO:91和11中。3G10重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，3G10重鏈應用了來自人種系VH1-18的VH區(qū)段、未確定的D區(qū)段和來自人種系JH6b的Jh區(qū)段。3G10Vh序列與神系VH1-18序列的比對顯示在圖11中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對3G10VH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖IA和11以及SEQIDNO:21、31和41所示。3G10輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，3G10輕鏈應用了來自人種系VKL6的Vl區(qū)段和來自人種系JK1的jk區(qū)^a。3G10V^序列與種系VjcL6序列的比對顯示于圖21中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對3G10Vi序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖IB和21以及SEQIDNO:51、61和71所示。12A4的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQIDNO:82和2中。12A4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQIDNO:92和12中。12A4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，12A4重鏈應用了來自人種系Vh1-69的Vh區(qū)段、來自人種系3-10的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。12A4Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖12中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對12A4Vh序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDRl、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2A和12以及SEQIDNO:22、32和42所示。12A4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，12A4輕鏈應用了來自人種系VkL6的VL區(qū)段和來自人種系JK1的JK區(qū)段。12A4V^序列與種系VKL6序列的比對顯示于圖22中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對12A4V^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖2B和22以及SEQIDNO:52、62和72所示。10A5的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3A和SEQIDNO:83和3中。10A5的輕鏈可變區(qū)的核普酸和氨基酸序列分別顯示于圖3B和SEQIDNO:93和13中。10A5重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，10A5重鏈應用了來自人種系VH1-3的VH區(qū)段、來自人種系5-5的D區(qū)段和來自人種系JH4b的Jh區(qū)段。10A5Vh序列與種系VHl-3序列的比對顯示于圖13中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對10A5Vh序列的迸一歩分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3A和13以及SEQIDNO:23、33和43所示。10A5輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，10A5輕鏈應用了來自人種系VKL15的Vl區(qū)段和來自人種系JK2的JK區(qū)段。10A5V^序列與種系VKL15序列的比對顯示于圖23中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對10A5Vl序列的迸一歩分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖3B和23以及SEQIDNO:53、63和73所示。5F8的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQIDNO:84和4中。5F8的輕鏈可變區(qū)的核普酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQIDNO:94和14中。5F8重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，5F8重鏈應用了來自人種系VH1-69的Vh區(qū)段、來自人種系6-13的D區(qū)段和來自人種系JH4b的Jh區(qū)段。5F8vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖14中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對5F8Vh序列的迸一歩分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4A和14以及SEQIDNO:24、34和44所示。5F8輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，5F8輕鏈應用了來自人種系VKA27的Vl區(qū)段和來自人種系JK1的JK區(qū)段。5F8Vi序列與種系VKA27序列的比對顯示于圖24中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對5F8Vi序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖4B和24以及SEQIDNO:54、64和74所示。10H10的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5A和SEQIDNO:85和5中。10H10的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5B和SEQIDNO:95和15中。10H10重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，10H10重鏈應用了來自人種系VH3-9的VH區(qū)段、來自人種系4-17的D區(qū)段和來自人種系JH4b的Jh區(qū)段。10H10Vh序列與種系VH3-9序列的比對顯示于圖15中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對10H10Vh序列的迸一歩分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖5A和15以及SEQIDNO:25、35和45所示。10H10輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，10H10輕鏈應用了來自人種系VKLI5的Vl區(qū)段和來自人種系JK2的JK區(qū)段。10H10Vl序列與神系VKL15序列的比對顯示于圖25中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對10H10Vt序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖5B和25以及SEQIDNO:55、65和75所示。1B12的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6A和SEQIDNO:86和6中。1B12的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6B和SEQIDNO:96和16中。1B12重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，1B12重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區(qū)段、來自人種系3-10的D區(qū)段和來自人種系JH6b的Jh區(qū)段。1B12Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖16中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對1B12VH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDRl、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖6A和16以及SEQIDNO:26、36和46所示。1B12輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，1B12輕鏈應用了來自人種系VKL6的Vl區(qū)段和來自人種系JK1的Jk區(qū)段。1B12V^序列與種系VKL6序列的比對顯示于圖26中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對1B12Vi序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖6B和26以及SEQIDNO:56、66和76所示。7H1的重鏈可變區(qū)的核普酸和氨基酸序列分別顯示于圖7A和SEQIDNO:87和7中。7H1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖7B和SEQIDNO:97和17中。7H1重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，7H1重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區(qū)段、來自人種系3-10的D區(qū)段和來自人種系JH6b的jh區(qū)段。7H1Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖17中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對7H1VH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖7A和17以及SEQIDNO:27、37和47所示。7H1輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，7H1輕鏈應用了來自人種系VKL6的VL區(qū)段和來自人種系JK1的Jk區(qū)段。7H1Vt序列與種系VKL6序列的比對顯示于圖27中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對7H1VL序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖7B和27以及SEQIDNO:57、67和77所示。11E6的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQIDNO:84和4中。11E6的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQIDNO:94和14中。11E6重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，11E6重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區(qū)段、來自人種系6-19的D區(qū)段和來自人種系JH6c的JH區(qū)段。11E6Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖18中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對11E6VH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖8A和18以及SEQIDNO:28、38和48所示。11E6輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，11E6輕鏈應用了來自人種系VKA27的Vl區(qū)段和來自人種系JK4的jk區(qū)段。11E6V^序列與種系VKA27序列的比對顯示于圖27中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對11E6Vl序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖8B和28以及SEQIDNO:58、68和78所示。另外，包括VK序列的第二相關克隆如所SEQIDNO:109示。該抗體在本文中稱為11E6a。12B7的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖9A和SEQIDNO:89和9中。12B7的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖9B和SEQIDNO:99和19中。12B7重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，12B7重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區(qū)段、來自人種系3-10的D區(qū)段和來自人種系JH6b的JH區(qū)段。12B7Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖19中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對12B7Vh序歹'J的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖9A和19以及SEQIDNO:29、39和49所示。12B7輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，12B7輕鏈應用了來自人種系VKL6的Vl區(qū)段和來自人種系JK5的Jk區(qū)^:。12B7V^序列與種系V(cL6序列的比對顯示于圖29中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對12B7V^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖9B和29以及SEQIDNO:59、69和79所示。13G4的重鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖IOA和SEQIDNO:90和10中。13G4的輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖10B和SEQIDNO:100和20中。13G4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，13G4重鏈應用了來自人種系VH3-9的VH區(qū)段、來自人種系3-9的D區(qū)段和來自人種系JH4b的JH區(qū)段。13G4Vh序列與種系VH3-9序列的比對顯示于圖20中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對13G4Vh序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖10A和20以及SEQIDNO:30、40和50所示。13G4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，13G4輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區(qū)段和來自人種系JK3的JK區(qū)段。13G4V^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖30中。利用KabatCDR區(qū)測定系統(tǒng)對13G4V^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，分別如圖10B和30以及SEQIDNO:60、70和80所示。實施例3:抗-PD-Ll人單克隆抗體的結合特異性和結合動力學的表征在該實施例中，通過Biacore分析^r測了抗-PD-Ll抗體的結合親和力和結合動力學。也通過流式細胞分析檢測了結合特異性和交叉竟爭。結合親和力和動力學通過Biacore分析(BiacoreAB,Uppsala,瑞典)表征了抗-PD-Ll抗體的親和力和結合動力學。使用Biacore提供的標準胺偶聯(lián)化學方法和試劑盒，通過伯胺將純化的重組人PD-L1融合蛋白共價連接到CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)上，使密度為562RU。通過使在HBSEP緩沖液(BiacoreAB提供)中濃度為133nM的抗體以50|al/min的流速流過，來檢測結合。抗原-抗體結合動力學進行1分鐘，解離動力學進行10分鐘。用BAIevaluation軟件(BiacoreAB)將結合和解離曲線與1:1Langmuir結合模型擬合。為了使結合常數(shù)估計中的親合力的影響降至最小，只用對應于結合和解離階段的最初的數(shù)據(jù)段進行擬合。測定的KD、k。n和k。ff值顯示在表2中。表2:PD-L1人單克隆抗體的Biacore結合數(shù)據(jù)樣品編號樣品身份親和力KD結合速率k。n解離速率koffx10-9(M)x105(l/Ms)x10-41/s13G103.395.2517.8310A51.452.583,72數(shù)據(jù)顯示在表3中。表3.PD-L1人單克隆抗體的Biacore平衡結合數(shù)據(jù)克隆身份KD(nM)37CKD(nM)25C12A41.940.767H12.15nd1B121.380.6112B70.830.5310A52.410.5710H105.935.4813G41.873.311E60.532.95F82.170.75經(jīng)流式細胞術測定的結合特異性開發(fā)了在細胞表面表達重組人PD-L1的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，并用它來通過流式細胞術確定PD-L1單克隆抗體的特異性。用含有編碼跨膜形式PD-L1的全長cDNA的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞。通過將被轉(zhuǎn)染的細胞與抗PD-L1人單克隆抗體溫育，評價3G10、10A5和12A4抗PD-L1人單克隆抗體的結合。洗滌細胞，用FITC標記的抗人IgGAb檢測其結合。用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose,CA)進行流式細胞分析。將結合與親本CHO細胞系比較。結果顯示在圖32A(HuMAb3G10)、32B(HuMAb10A5)和32C(HuMAb12A4)中。也使用不同濃度的抗PD-L1抗體檢測結合。結果顯示在圖33中?？筆D-L1人單克隆抗體3G10、10A5和12A4以濃度依賴性的方式與PD-L1轉(zhuǎn)染的CHO細胞結合。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-L1人單克隆抗體與細胞表面PD-L1特異性結合。通過ELISA測定的結合特異性用標準ELISA試驗測定抗PD-L1人單克隆抗體結合與免疫球蛋白Fc區(qū)融合的人PD-L1的特異性。檢測人PD-L1的Fc融合蛋白與抗PD-L1人單克隆抗體3G10、12A4和10A5的結合。進行標準ELISA程序。以不同濃度加入抗PD-L1人單克隆抗體。用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgG(K鏈特異性)多克隆抗體作為第二抗體。結果顯示在圖34中?？筆D-Ll人單克隆抗體3G10、12A4和10A5均與PD-L1高特異性結合。實施例4:抗PD-L1抗體與人和猴T細胞表面上表達的PD-L1結合的表征通過流式細胞分析檢測抗PD-L1抗體與在表面上表達PD-L1的活化的人或食蟹猴T細胞的結合。人或猴T細胞通過抗CD3抗體活化，以在與人抗PD-L1單克隆抗體結合之前誘導PD-L1表達。3G10、1B12、13G4和12A4抗PD-L1人單克隆抗體的結合通過將活化的細胞與連續(xù)稀釋的抗PD-L1人單克隆抗體溫育來評價。用同種型對照抗體作為陰性對照。洗滌細胞，用FITC標記的抗人IgK輕鏈抗體檢測其結合。用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose,CA)進行流式細胞分析。結果顯示在圖35和36中?？筆D-L1單克隆抗體3G10、1B12、13G4和12A4與活化的人和猴T細胞結合。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-L1人單克隆抗體與人和食蟹猴細胞細胞表面PD-L1結合。實施例5:抗PD-L1抗體與人T細胞表面表達的PD-L1的結合的表征通過流式細胞分析檢測抗PD-L1抗體與在細胞表面上表達PD-L1的活化的人T細胞的結合。人T細胞通過抗CD3抗體活化，以在與人抗PD-L1單克隆抗體結合之前誘導PD-L1表達。3G10、10A5和12A4抗PD-L1人單克隆抗體的結合通過將活化的T細胞與濃度為20ng/ml的抗PD-L1人單克隆抗體溫育來評價。用同種型對照抗體作為陰性對照。洗滌細胞，用FITC標記的抗人IgG抗體^r測其結合。用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose，CA)進行流式細胞分析。結果顯示在圖37A(HuMAb3G10)、37B(HuMAb10A5)和37C(HuMAb12A4)中。如直方圖所示，與對照(細線)相比，抗PD-L1單克隆抗體3G10、10A5和12A4與活化的人T細胞結合(粗線)。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-L1人單克隆抗體與人細胞表面PD-L1結合。實施例6:通過流式細胞術分析的結合特異性通過流式細胞術利用在細胞表面表達人PD-L1的ES-2人卵巢癌細胞系確定PD-L1人單克隆抗體的特異性。用500IU/ml重組hIFN-y處理ES-2細胞過夜，以相對于基礎水平提高PD-L1的表達。12A4、1B12、3G10、10A5、12B7、13G4、11E6和5F8抗PD-L1人單克隆抗體的結合通過將誘導的細胞與連續(xù)稀釋的抗PD-L1人單克隆抗體溫育來評價。洗滌細胞，用PE標記的抗人IgG抗體檢測其結合。用FACScan流式細月包4義(BectonDickinson,SanJose，CA)進4亍流式細月包分析。將結合與同種型對照進行比較。結果顯示在圖38中?？筆D-L1人單克隆抗體12A4、1B12、3G10、10A5、12B7、13G4、11E6和5F8以濃度依賴性的方式與hIFN-y誘導的ES-2細胞結合。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-L1人單克隆抗體與細胞表面PD-L1特異性結合。實施例7:人抗PD-L1抗體在混合淋巴細胞反應中對細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生的影響利用混合淋巴細胞反應證明阻斷PD-Ll/PD-1途徑對淋巴細胞效應細胞的影響。在存在或不存在抗PD-Ll人單克隆抗體的情況下檢測該試驗中的T細胞的增殖、IFN-y分泌和IL-2分泌。細胞。樹突細胞來源于與1000U/mlIL-4和500U/mlGM-CSF(R&DBiosystems)培養(yǎng)7天的純化的單核細胞。單核細胞用單核細胞負選擇試劑盒(MitenyiBiotech)制備。每種培養(yǎng)物在200pi總體積中含有105個純化的T細胞和104個異體樹突細胞。抗PD-Ll單克隆抗體10A5、12A4或3G10以不同的抗體濃度加至每種培養(yǎng)物中。不加抗體或用同種型對照抗體作為陰性對照。細胞在37。C下培養(yǎng)5天。5天后，從每個培養(yǎng)中取出100|ul培養(yǎng)基進行細胞因子測定。IFN-y和IL-2水平用OptEIAELISA試劑盒(BDBiosciences)測定。用311-胸苷標記細胞，培養(yǎng)另外18小時，分析細胞增殖。結果顯示在圖39A(T細胞增殖)、39B(使用HuMAb10A5的IFN-y分泌)、39C(使用HuMAb12A4或3G10的IFN-y分泌)、39D(IL-2分泌)中。抗PD-Ll人單克隆抗體10A5以濃度依賴的方式促進T細胞增殖、IFN-y分泌和IL-2分泌?？筆D-Ll人單克隆抗體12A4和3G10也顯示提高IFN-y分泌。相反，含有對照抗體的培養(yǎng)物不顯示T細胞增殖、IFN-y或IL-2分泌的提高。在單獨的實驗中，利用異體混合淋巴細胞反應(MLR)證明在淋巴細胞效應細胞中阻斷PD-Ll/PD-1途徑的作用。在存在或不存在抗PD-L1人單克隆抗體或同種型對照抗體的情況下檢測該試驗中的T細胞的增殖和IFN-y分泌。單核細胞用單核細胞負選擇試劑盒(MitenyiBiotech)制備。樹突細胞來源于與1000U/mlIL-4和500U/mlGM-CSF(R&DBiosystems)培養(yǎng)7天的純化的單核細胞。每種MLR培養(yǎng)物在200|al總體積中含有105個純化的T細胞和104個異體樹突細胞?？筆D-L1單克隆抗體12A4、11E6、3G10、13G4、1B12、10A5和12B7以不同的抗體濃度加至每種培養(yǎng)物中。不加抗體或用同種型對照抗體作為陰性對照。細胞在37。C下培養(yǎng)5天。在第5天，從每個培養(yǎng)中取出50pl培養(yǎng)基進行細胞因子測定，并替換為等體積的含有1MCPH胸苷的培養(yǎng)基。細胞再培養(yǎng)18小時，收獲，分析細胞增殖。培養(yǎng)液中IFN-y的水平用OptEIAhIFN-yELISA試劑盒(BDBiosciences)測定。結果顯示在圖40中。抗PD-L1人單克隆抗體以濃度依賴的方式促進T細胞增殖和IFN-y分泌。相反，含有對照抗體的培養(yǎng)物不顯示T細胞增殖或IFN-y分泌的提高。實施例8:人抗PD-L1抗體對T調(diào)節(jié)細胞的功能的影響T調(diào)節(jié)細胞(CD4+,CD25+)是抑制免疫應答的淋巴細胞。在異體樹突細胞和T細胞MLR中，在存在或不存在抗PD-L1人單克隆抗體的情況下^r測了添加T調(diào)節(jié)細胞對增殖和IFN-y分泌的影響。T調(diào)節(jié)細胞使用CD4+CD25+調(diào)節(jié)細胞分離試劑盒(MitenyiBiotech)從PBMC中純化。以2:1的CD4+CD25-與T調(diào)節(jié)細胞的比例，將T調(diào)節(jié)細胞添加到含有純化的CD4+CD25+T細胞和異體樹突細胞的混合淋巴細胞反應(見上文)中。向每個培養(yǎng)物中加入濃度為10iug/ml的抗PD-L1單克隆抗體10A5。不加抗體或用同種型對照抗體作為陰性對照。細胞在37°C下培養(yǎng)5天，此時應用Beadlyte細胞因子檢測系統(tǒng)(Upstate)分析上清液的IFN-y分泌。用311胸苷標記細胞，再培養(yǎng)18小時，分析細胞增殖。結果顯示在圖41A(T細胞增殖)和41B(IFN-y分泌)中?？筆D-L1人單克隆抗體10A5的添加在異體樹突細胞、T細胞和T調(diào)節(jié)細胞的細胞培養(yǎng)中促進了T細胞增殖和IFN-y分泌，表明抗PD-L1抗體在異體DC-T細胞-MLR中可以逆轉(zhuǎn)T調(diào)節(jié)細胞的作用。在單獨的實驗中，利用含T調(diào)節(jié)細胞的MLR試驗檢測了人抗PD-L1抗體12A4和13G4和對照抗體1D12。結果顯示在圖42(T細胞增殖)和43(IFN-y分泌)中。抗PD-L1人單克隆抗體12A4和13G4的添加在異體樹突細胞、含T調(diào)節(jié)細胞的T細胞的細胞培養(yǎng)中部分逆轉(zhuǎn)了T細胞增殖和IFN-y分泌的抑制，表明抗PD-L1抗體對T調(diào)節(jié)細胞具有作用。實施例9:抗PD-L1抗體對病毒抗原刺激的來自陽性CMV反應供體的PBMC細胞分泌細胞因子的影響在0.5|ug/mlCMV裂解液(AstarteBiologies)+/-滴定的抗PD-L1抗體的存在下，CMV抗原反應性人PBMC(AstarteBiologies,Redmond,WA)以2xl05細胞/孔的密度在TC處理的平底96孔板中培養(yǎng)。加有熱滅活的FBS(10%終濃度)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)以總體積200ial/孔使用。細胞在37。C和5。/。C02下培養(yǎng)5天，此時收獲上清液通過ELISA(OptiEIAhIFN-yELISA試劑盒-BDBiosciences)測定分泌的干擾素-y。結果顯示在圖44中?？筆D-L1人單克隆抗體以劑量依賴的方式促進CMV特異性T細胞分泌IFN-y。與同種型對照相比，抗體13G4、1B12和12A4產(chǎn)生最強的反應。這些結果表明抗PD-L1HuMAb可以在以前針對抗原刺激的PBMC細胞的記憶T細胞應答中刺激IFN-y釋放。實施例10:人抗PD-L1抗體阻斷PD-L1配體與PD-1的結合利用流式細胞分析檢測抗PD-L1人單克隆抗體阻斷配體PD-L1與轉(zhuǎn)染的CHO細胞上表達的PD-1結合的能力。將表達PD-1的CHO細胞懸浮于FACS緩沖液(含有4%胎牛血清的PBS)中。在4。C下向細胞懸浮液中加入各種濃度的抗PD-L1HuMab3G10、10A5或12A4，保持30分鐘，然后加入FITC標記的與免疫球蛋白Fc區(qū)融合的PD-L1。用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose,CA)進行流式細胞分析。結果顯示在圖45中?？筆D-L1人單克隆抗體3G10、10A5和12A4阻斷PD-L1與人PD-1轉(zhuǎn)染的CHO細胞的結合，這通過染色的平均熒光強度(MFI)來測量。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-L1HuMab阻斷PD-L1配體與細胞表面PD-1的結合。107實施例11:人抗PD-L1抗體對可溶性PD-1與細胞表面PD-L1的結合的抑制利用流式細胞分析檢測抗PD-L1人單克隆抗體阻斷可溶性二聚體形式的PD-1受體(PD-l-hFc)與hIFN-y誘導的ES人卵巢癌細胞上表達的PD-Ll的結合的能力。將該阻斷與同種型對照抗體進行比較。ES細胞用500IU/mlhlFN-y誘導過夜，以上調(diào)hPD-Ll細胞表面表達。將誘導的細胞懸浮在FACS緩沖液中。在4。C下向細胞懸浮液管中加入連續(xù)稀釋的抗PD-LlHuMAb12A4、1B12、3G10、10A5、12B7、13G4、11E6和5F8，保4寺30分鐘，然后洗滌兩次，以除去未結合的抗體。然后在4。C下加入恒定2pg/mL的PD-l-hFc蛋白，保持30分鐘，然后洗滌兩次，以除去未結合的PD-l-hFc。然后通過在4°C下加入生物素化的非阻斷性抗PD-LlHuMAb26D5(當結合PD-Ll時它結合PD-1)保持30分鐘，然后洗滌兩次，以除去未結合的抗體，在ES-2細胞上檢測結合的PD-l-Fc。最后，在4。C下加入鏈霉親和素-PE偶聯(lián)物保持30分鐘，然后洗滌兩次以除去未結合的偶聯(lián)物，來檢測結合的26D5。用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,SanJose，CA)進行流式細胞分析。結果顯示在圖46中?？筆D-Ll單克隆抗體12A4、1B12、3G10、10A5、12B7、13G4、11E6和5F8阻斷了PD-Ll與表達人PD-Ll的ES-2細胞的結合，這通過染色的幾何平均熒光強度(MFI)來測量。這些數(shù)據(jù)證明了抗PD-LlHuMab阻斷可溶性PD-1受體與細力包表面PD-Ll的結合。實施例12:使用抗PD-Ll抗體治療體內(nèi)腫瘤模型植入癌性B細胞肺瘤的小鼠用抗PD-Ll抗體在體內(nèi)治療，以檢查這些抗體對腫瘤生長的體內(nèi)效果。用于肺瘤研究的6-8周齡的雌性AJ小鼠(HarlanLaboratories)按體重隨機分入6個組。第0天，小鼠在右脅下皮下植入溶解于200piDMEM培養(yǎng)基中的2x106SA1/N纖維肉瘤。小鼠用PBS載體或10mg/kg的抗PD-Ll抗體處理。在第1、4、8、11天，動物通過腹膜內(nèi)注射大約200pi含有抗體或載體的PBS而給藥。每組包括10只動物，分組包括(i)載體組，(ii)對照小鼠IgG,和(iii)抗PD-Ll抗體。小鼠每周監(jiān)測兩次腫瘤生長，共大約6周。使用電子卡尺從三個維度上測量腫瘤(高度x寬度x長度)，并計算胂瘤體積。當胂瘤達到腫瘤終點(1500mm3)或顯示大于15%的體重減輕時，對小鼠行安樂死。實施例13:聯(lián)合治療(抗CTLA-4和抗PD-L1抗體)對腫瘤建立和生長的體內(nèi)效果將MC38結腸直腸癌細胞(可獲自N.Restifo博士，NationalCancerInstitute,Bethesda，MD;或JeffreySchlom，NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)植入C57BL/6小鼠中(2x106細胞/小鼠)，并在腫瘤達到100-200mm3的大小時選擇治療。在第0天(即治療第1天)，給4個組(每組10只小鼠)中的每一個腹膜內(nèi)(IP)注射以下物質(zhì)之一(1)10mg/kg小鼠IgG和10mg/kg大鼠IgG(對照)，(2)10mg/kg抗-CTLA-4單克隆抗體9D9(小鼠抗小鼠CTLA-4，從J.Allison,MemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,NY獲得)和10mg/kg大鼠IgG，(3)抗-PD-Ll單克隆抗體MIH5(大鼠抗小鼠PD畫Ll,eBioscience)和10mg/kg小鼠IgG,或(4)10mg/kg抗畫CTLA-4抗體9D9和10mg/kg抗-PD-Ll抗體MIH5。然后在第3天和第6天進一步進行抗體注射。使用電子卡尺從三個維度上測量腫瘤(高度x寬度x長度)，并計算腫瘤體積。當腫瘤達到預定的腫瘤終點時，對小鼠行安樂死。結果顯示在圖47中。該研究表明，在MC38鼠腫瘤模型中，單獨的抗-PD-Ll抗體治療對腫瘤生長具有中度的效果，導致腫瘤生長延遲，而抗-CTLA-4抗體在該才莫型中幾乎沒有效果。然而，CTLA-4抗體和PD-L1抗體的聯(lián)合治療對肺瘤生長具有顯著較大的影響，導致小鼠不存在腫瘤。實施例14:〗吏用抗PD-L1抗體的免疫組化研究為了評價HuMab抗-PD-Ll，在一組正常的(非腫瘤)人組織(包括脾、扁桃腺、小腦、大腦、心臟、肝臟、肺、腎、胰、腦垂體、皮膚和小腸)以及肺癌組織(1個樣品/每個腫瘤)中檢查了未修飾的12A4、13G4、3G10和12B7的組織結合分布。用ES-2細胞作為陽性對照。用Hu-IgG,和Hu-IgG4作為同種型對照抗體。驟凍的并且OCT包埋的正常和淋巴瘤組織購自CooperativeHumanTissueNetwork(Philadelphia,PA)或NationalDiseaseResearchInstitute(Philadelphia,PA)。5jum的冷凍切片用丙酮在室溫下固定10分鐘，在使用前貯存于-80。C。使用未修飾的HuMab抗-PD-Ll進行Medarex發(fā)展的免疫組化方案，在加到切片上之前預復合第一抗體(12A4、13G4、3G10和12B7)和第二抗體(FITC偶聯(lián)的山羊抗-Hu-IgG的Fab片l更(JacksonImmunoResearchLaboratories.WestGrove,PA))。簡要來說，1jug/ml或5pg/ml的未偶聯(lián)的第一抗體與3倍過量的第二抗體分別混合，并在室溫下溫育30分鐘，然后加入過量的人y球蛋白，保持30分鐘，以阻斷未結合的第二抗體。平行地，同種型對照抗體Hu-IgG,或Hu-IgG4以相同的方式預復合。將切片用PBS(Sigma，St.Louis,MO)洗滌兩次，然后與DakoEnVision+System(Dako.Carpinteria，CA)提供的過氧化物酶封閉液溫育10分鐘。用PBS洗滌兩次后，將切片與Dako蛋白封閉液溫育，以封閉非特異性結合位點。然后，向切片上加第一抗體或同種型對照的預復合物，并溫育1小時。用PBS洗滌三次后，將切片與小鼠抗FITC抗體(20pg/ml，Sigma)—起溫育30分鐘。用PBS另外洗滌三次后，切片與DakoEnVision+System提供的過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG聚合物一起溫育30分鐘。最后，如上所述洗滌切片，并與DakoEnVision+System提供的DAB底物-發(fā)色團溶液反應6分鐘。然后用去離子水洗滌切片，按照常規(guī)組織學程序用Mayer蘇木精(Dako)復染,脫水，清潔，并蓋上玻片Permount(FischerScientific,FairLawn,NJ)。在ES-2細胞以及肺癌組織的腫瘤細胞中觀察到弱到中度的染色。在扁桃腺切片中，在被淋巴樣細胞高度浸潤的嚢上皮中可見強染色，但是在粘膜成層的鱗狀上皮細胞中沒有見到。在濾泡間區(qū)的某些細胞中可見中度染色，而在生發(fā)中心的分散的大細胞(樹突網(wǎng)狀細胞)中可見極弱的染色。在肺中，在肺泡巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)弱染色。使用商業(yè)抗-PD-LlmAb(eBiosciences,SanDiego，CA)在免疫組化切片中類似地見到扁桃腺和肺組織中的染色。HuMab的染色強度總體較低，特別是對于生發(fā)中心的染色。在脾中，在紅髓中彌散的弱免疫反應性略高于背景染色。另外，在肝臟的枯否樣細胞和派伊爾淋巴集結的擴散細胞以及主要存在于小腸肌層聚焦區(qū)的擴散巨噬細胞樣細胞和成纖維細胞中表現(xiàn)出弱到中度的染色。在小腦、大腦、心臟、腎臟、胰、垂體和皮膚組織中，用全部4種抗-PD-LlHuMab染色時沒有觀察到明顯的染色。除了12B7和/或3G10在肝臟和ES-2細胞中顯示略強的染色外，這4種抗體的染色未見明顯的差異。PD-L1抗體扭無述<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>權利要求1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體特異性結合人PD-L1，并且其中該抗體表現(xiàn)出至少一種以下性質(zhì)(a)以1×10-7M或更低的KD與人PD-L1結合；(b)在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(c)在MLR試驗中提高干擾素-γ產(chǎn)生；或(d)在MLR試驗中提高白介素-2(IL-2)分泌。2.權利要求1的抗體，其為IgGl、IgG2或IgG4同種型的全長抗體。3.權利要求1的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。4.權利要求1的抗體，其中所述抗體以5xl(T9M或更低的KD與人PD-L1結合。5.權利要求1的抗體，其中所述抗體以2xl(T9M或更低的KD與人PD-L1結合。6.—種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體交叉竟爭結合PD-L1，所述參比抗體包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)。7.權利要求6的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:ll的氨基酸序列。8.權利要求6的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。9.權利要求6的抗體，其中所述人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列。10.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產(chǎn)自或源自人VHl-18基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。11.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產(chǎn)自或源自人VHl-69基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。12.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產(chǎn)自或源自人VHl-3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。13.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產(chǎn)自或源自人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。14.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產(chǎn)自或源自人VKL15基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與PD-L1特異性結合。15.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)人VHl-18基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。16.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)人VHl-69基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL6的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。17.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)人VHl-3基因的重鏈可變區(qū)；和(b)人VKL15的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。18.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)；其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體與人PD-L1特異性結合。19.權利要求18的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。20.權利要求19的抗體，其中重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。21.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和IO的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且該抗體以lxl(^M或更低的Kd與人PD-L1結合。22.權利要求21的抗體，其中該抗體進一步包括一種或多種選自以下的性質(zhì)(a)該抗體在混合淋巴細胞反應(MLR)試驗中提高T細胞增殖；(b)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-y產(chǎn)生；和(c)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌。23.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:41、42、43、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:51、52、53,59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:61、62、63、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含選自SEQIDNO:71、72、73、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3;其中該抗體與pd-L1特異性結合。24.權利要求23的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區(qū)(b)包含SEQIDNO:31的重鏈可變區(qū)(c)包含SEQIDNO:41的重鏈可變區(qū)(d)包含SEQIDNO:51的輕鏈可變區(qū)(e)包含SEQIDNO:61的輕鏈可變區(qū)(f)包含SEQIDNO:71的輕鏈可變區(qū)25.權利要求23的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區(qū)(b)包含SEQIDNO:32的重鏈可變區(qū)(c)包含SEQIDNO:42的重鏈可變區(qū)(d)包含SEQIDNO:52的輕鏈可變區(qū)(e)包含SEQIDNO:62的輕鏈可變區(qū)(f)包含SEQIDNO:72的輕鏈可變區(qū)26.權利要求23的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區(qū)(b)包含SEQIDNO:33的重鏈可變區(qū)(c)包含SEQIDNO:43的重鏈可變區(qū)(d)包含SEQIDNO:53的輕鏈可變區(qū)(e)包含SEQIDNO:63的輕鏈可變區(qū)44、45、46、47、4854、55、56、57、5864、65和74、75、66、67、6876、77、78CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3'CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3<CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2和和和(f)包含SEQIDNO:73的輕鏈可變區(qū)CDR3。27.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與PD-L1特異性結合。28.權利要求27的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。29.權利要求27的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。30.權利要求27的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。31.—種組合物，其含有權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，和藥學上可接受的載體。32.—種免疫偶聯(lián)物，其包含與治療劑連接的權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。33.—種組合物，其含有權利要求32的免疫偶聯(lián)物和藥學上可接受的載體。34.權利要求32的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是細胞毒素。35.—種組合物，其含有權利要求34的免疫偶聯(lián)物和藥學上可接受的載體。36.權利要求32的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。37.—種組合物，其含有權利要求34的免疫偶聯(lián)物和藥學上可接受的載體。38.—種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同的結合特異性。39.—種組合物，其含有權利要求38的雙特異性分子和藥學上可接受的載體。40.—種分離的核酸分子，其編碼權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。41.一種表達載體，其包含權利要求40的核酸分子。42.—種宿主細胞，其包含權利要求41的表達載體。43.—種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中該小鼠表達權利要求l-30任一項的抗體。44.由權利要求43的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產(chǎn)生所述抗體。45.—種調(diào)節(jié)受試者中的免疫應答的方法，包括給該受試者施用權利要求l-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得受試者中的免疫應答得到調(diào)節(jié)。46.—種抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-L1抗體或其抗原結合部分。47.權利要求46的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。48.權利要求46的方法，其中所述抗體是人源化抗體。49.權利要求46的方法，其中所述抗體是完全人類抗體。50.權利要求46的方法，其中所述腫瘤細胞是選自黑素瘤、腎癌、前列&泉癌、乳&i癌、結腸癌和肺癌的癌的肺瘤細月包。51.權利要求46的方法，其中所迷腫瘤細胞是選自以下癌的肺瘤細胞骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環(huán)境誘發(fā)的癌癥，包括石棉誘發(fā)的癌癥，以及所述癌癥的組合。52.—種抑制受試者中的胂瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用有效抑制肺瘤生長的量的權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。53.—種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用權利要求l-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。54.權利要求53的方法，其中所述傳染病選自HIV，流行性感冒，皰滲，賈第蟲，瘧疾，利什曼原蟲，以下病毒引起的病原體感染肝炎病毒(甲、乙、丙)、皰滲病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、蟲媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮&泉炎病毒、4侖纟犬病毒、麻滲病毒、風滲病毒、纟田小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒，以下細菌引起的病原體感染衣原體、立克次氏體菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏桿菌、變形菌、雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體、和萊姆病細菌，以下真菌引起的病原體感染假絲酵母(白假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等)、新型隱球菌、曲霉(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉屬(毛霉、犁頭霉、根霉)、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夾膜組織胞漿菌，和以下寄生蟲引起的病原體感染溶組織內(nèi)阿米巴、結腸小袋纖毛蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴屬的種、蘭伯賈第蟲、隱孢子蟲屬的種、卡氏肺嚢蟲、間日瘧原蟲、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日圓線蟲。55.—種增強受試者中對抗原的免疫應答的方法，包括給該受試者施用(i)抗原；和(ii)權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者中對抗原的免疫應答得到加強。56.權利要求55的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。57.—種治療或預防受試者中的炎性疾病的方法，包括給該受試者施用權利要求l-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的炎性疾病得到治療。58.權利要求57的方法，其中所述炎性疾病是扁平苔蘚(LP)。59.—種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的CDR1序列、選自SEQIDNO:31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的CDR2序列、和選自SEQIDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的CDR3序列；或(H)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的CDR1序列、選自SEQIDNO:61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的CDR2序列、和選自SEQIDNO:71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的CDR3序列；(b)改變至少一種可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，所述可變區(qū)抗體序列選自重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。60.抗PD-L1抗體或其抗原結合部分應用于抑制胂瘤細胞生長的方法。61.抗PD-L1抗體或其抗原結合部分在制備抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。62.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于抑制胂瘤細胞生長的方法。63.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備抑制肺瘤細胞生長的藥物中的用途。64.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于治療傳染病的方法。65.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備治療傳染病的藥物中的用途。66.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于治療炎4生疾病的方法。67.權利要求1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備治療炎性疾病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供以高親和力特異性結合PD-L1的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子，用于表達本發(fā)明的抗體的表達載體、宿主細胞和方法。還提供了包含本發(fā)明的抗體的免疫偶聯(lián)物、雙特異性分子和藥物組合物。本申請還公開了檢測PD-L1的方法，以及使用抗-PD-L1抗體治療包括癌癥和傳染病在內(nèi)的各種疾病的方法。文檔編號C07K16/28GK101248089SQ200680028238公開日2008年8月20日申請日期2006年6月30日優(yōu)先權日2005年7月1日發(fā)明者A·J·科曼,D·B·帕斯莫爾,M·J·塞爾比,M·斯里尼瓦桑,王常宇,陳海斌,黃海春申請人:米德列斯公司