專利名稱：：用于體外蛋白質(zhì)折疊的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明處于蛋白質(zhì)化學(xué)的一般領(lǐng)域中。更具體地，本發(fā)明涉及用于再折疊(refolding)通過重組技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的方法和系統(tǒng)。2.相關(guān)技術(shù)重組蛋白質(zhì)的典型的商業(yè)生產(chǎn)方案涉及轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通常細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(￡.co/z),以產(chǎn)生通常為哺乳動物來源的外源產(chǎn)物。將編碼所述蛋白質(zhì)的基因插入到宿主細(xì)胞中并通過正常的細(xì)胞介導(dǎo)的產(chǎn)生翻譯成對應(yīng)的蛋白質(zhì)。然而，細(xì)菌宿主細(xì)胞可能不能正確折疊這種重組蛋白質(zhì)，因為它缺乏哺乳動物細(xì)胞中存在的環(huán)境和細(xì)胞器來進(jìn)行這種折疊。結(jié)果，細(xì)胞可能產(chǎn)生未折疊或者不正確折疊蛋白質(zhì)的團(tuán)聚體。當(dāng)以高濃度產(chǎn)生時，未折疊和部分折疊的蛋白質(zhì)可能開始形成不溶性團(tuán)聚體或者稱作包含體的團(tuán)聚的、不溶性實體。這些團(tuán)聚體聚集在周質(zhì)空間中并且有時候可以占細(xì)菌細(xì)胞總蛋白質(zhì)50%以上。包含體的大部分由目的蛋白質(zhì)組成(有時產(chǎn)生超過90%的純化蛋白質(zhì))，使得它已經(jīng)是高度純化的，小分子、宿主細(xì)月包蛋白質(zhì)和核酸組成包含體的剩余部分。盡管有通常發(fā)生的錯折疊，在大腸桿菌細(xì)胞而不是哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白的優(yōu)點是細(xì)菌細(xì)胞容易得到，生長更快并且可以過量產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。它們也不能藏匿可以在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的某些病毒。于是，已經(jīng)嘗試從大腸桿菌純化和再折疊蛋白質(zhì)，從而使得產(chǎn)品更經(jīng)濟(jì)和對于人體注射更安全。例如，從團(tuán)聚體或者包含體分離蛋白質(zhì)后，純化蛋白質(zhì)的第一步是將其用強鹽濃度，例如，6M鹽酸胍(GuHCL)或8M尿素溶解。兩種鹽都是離液劑，它們通過破壞將包含體維持在一起的氳鍵和疏水相互作用而4吏蛋白溶解和解3斤疊。參見，例長口，Ladisch,MichaelR,BioseparationsEngineering:Principles,PracticeandEconomics(2001)JohnWileyandSons,Inc.,118-123。此外，可能需要還原試劑如二石危蘇糖醇、半胱氨酸或者卩-巰基乙醇破壞在蛋白質(zhì)的產(chǎn)生中錯誤連接的二硫鍵。隨后用再折疊緩沖液(可能含有環(huán)氧改組試劑以幫助二硫鍵形成)稀釋或者透析解折疊的蛋白質(zhì)溶液以減小變性劑濃度，使得蛋白質(zhì)能用它的固有化學(xué)結(jié)構(gòu)再折疊。在再折疊步驟中產(chǎn)物損失的主要途徑是團(tuán)聚。當(dāng)分離的蛋白質(zhì)之間的吸引力比蛋白質(zhì)和溶質(zhì)之間的吸引力更有利時，發(fā)生團(tuán)聚。隨后有利的分子內(nèi)殘基-殘基吸引(其幫助再折疊蛋白質(zhì)成它的天然狀態(tài))與不利的分子間吸引力竟?fàn)帲瑢?dǎo)致可溶的團(tuán)聚體。這些可溶的團(tuán)聚體然后積累并導(dǎo)致不溶性團(tuán)聚體的沉淀。盡管團(tuán)聚有時是可逆反應(yīng)，但是試圖再折疊團(tuán)聚體是不希望的，因為這增加生產(chǎn)時間和成本。所以，一旦之前團(tuán)聚或者聚集的蛋白質(zhì)被溶解，通常避免進(jìn)一步團(tuán)聚。迄今為止，蛋白質(zhì)再折疊和團(tuán)聚的詳細(xì)機理是復(fù)雜的并且仍有待討論。已知再折疊不在一個步驟中發(fā)生；相反，隨著變性劑被除去，蛋白質(zhì)發(fā)生不連續(xù)的構(gòu)象改變。在這些未折疊和折疊狀態(tài)之間的中間構(gòu)象下，再折疊、團(tuán)聚或者錯折疊(產(chǎn)物損失的另一途徑)途徑發(fā)生竟?fàn)?。蛋白質(zhì)的環(huán)境條件和固有的化學(xué)結(jié)構(gòu)幫助指示哪個竟?fàn)幫緩綄⒃谠僬郫B期間占優(yōu)勢。通過改變蛋白質(zhì)-溶質(zhì)混合物的環(huán)境條件，包括蛋白質(zhì)濃度、變性劑濃度和局部溫度，已經(jīng)進(jìn)行了在再折疊期間避免團(tuán)聚的嘗試。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)團(tuán)聚反應(yīng)的動力學(xué)在蛋白質(zhì)濃度方面處于比折疊反應(yīng)更高的級另'J(Kiefhaber,T.,Rudolph,R.,Kohler,H,H.,Buchner,J."ProteinAggregationinvivo:AQuantitativeModeloftheKineticCompetitionBetweenFoldingandAggregation."Sz'o/Tec/zwo/ogy,1991,9,825-829)。對于該反應(yīng)，通常在相對于溶解度極限的稀釋條件下進(jìn)行再折疊。在此類條件下，分子相互作用的機會和吸引的可能性被減小。在實驗上，蛋白質(zhì)也顯示出在中間變性劑濃度下，在再折疊期間傾向于團(tuán)聚。當(dāng)處于中間構(gòu)象時，蛋白質(zhì)可以具有暴露的區(qū)域，其具有在它的疏水殘基處團(tuán)聚的可能性，如上所述。如果變性劑除去或者減少太慢，那么再折疊可能失敗。此外，對蛋白質(zhì)的熱脅迫將增加再折疊期間.蛋白質(zhì)團(tuán)聚的可能性。似乎對于許多蛋白質(zhì)在低溫下團(tuán)聚反應(yīng)被抑制，而對于報道在較高溫度下再折疊的其他蛋白質(zhì)，團(tuán)聚可能不是重要的途徑。該再折疊/團(tuán)聚行為的機理還沒有被最終建立。它可以是由于涉及蛋白質(zhì)之間非極性表面屏蔽的疏水力的溫度依賴性(參見，例如，Baldwin,R丄.Temperaturedependanceofthehydrophobicinteractioninproteinfolding.尸toc.A/〃.爿c^/.1986，83,8069-8072)或者傾向于團(tuán)聚的中間體的另一單獨的途徑。從有關(guān)再折疊期間團(tuán)聚的知識，濃縮的物質(zhì)需要與稀釋劑緩沖液快速混合以避免任何局部的高蛋白質(zhì)濃度、高變性劑濃度和高溫區(qū)域。當(dāng)前的實驗步驟涉及在無擋板槽中使用斜葉攪拌器(pitchedbladeimpellor)來快速混合濃縮形式的溶解蛋白質(zhì)與稀釋劑緩沖液。該類型的動力混合器是工業(yè)中用于劇烈混合的最常用裝置。最初將混合器設(shè)置在以湍流速度攪拌以在稀釋劑緩沖液中誘導(dǎo)渦流。然后對準(zhǔn)該渦流或者直接對準(zhǔn)高速攪拌器的滴管緩慢遞送濃縮的蛋白質(zhì)溶液。然而，已經(jīng)證明按比例放大該機械混合器是有困難的。研究已經(jīng)表明在混合不是湍流的低攪拌速度下，形成分離的混合區(qū)(Makino,T.,Ohmura,H.,Kataoka,K.ObservationofIsolatedMixingRegionsinaStirredVessel,Jow/-""/CTzemz.ca/￡Vzg/"ee">g2001,34「5」，574-578)。在這些區(qū)域中，蛋白質(zhì)被過度濃縮并且有團(tuán)聚的危險，如上所述。然后將以高湍流速度攪拌該溶液以避免在再折疊期間分離的混合區(qū)。然而，考慮到亞聲速脈沖引起的大量的來自攪拌器的剪切力和葉片后緣附近局部的空泡形成，蛋白質(zhì)可能隨著該方法^f皮放大而經(jīng)歷更高的機械變性脅迫。參見，例如，F(xiàn)ennema,OR.1996.FoodChemistry.第三版.MarcelDekker,Inc.,NewYork.第6章。此外，高攪拌速率向該系統(tǒng)中產(chǎn)生高功率輸入，從而可能通過功率損耗對所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生熱變性脅迫。用于大規(guī)模產(chǎn)生蛋白質(zhì)，尤其是重組蛋白質(zhì)的改進(jìn)的蛋白質(zhì)再折疊方法，包括改進(jìn)的混合方案將是所希望的。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供再折疊蛋白質(zhì)的方法解決了這些需要，所述方法包括靜態(tài)混合變性蛋白質(zhì)的濃縮溶液與再折疊稀釋劑以得到與所述再折疊蛋白質(zhì)的混合物。該方法尤其適于大規(guī)模加工體積，如30L或者以上，例如高達(dá)200或者1000或甚至10,000L中的樣i生物產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。通過從微生物宿主分離蛋白質(zhì)并將它們暴露于變性劑中，可以得到變性蛋白質(zhì)溶液。將該溶液在與所述蛋白質(zhì)的正確折疊相容的混合條件下與合適的再折疊稀釋劑混合，從而快速并且以高產(chǎn)率得到具有生物活性的再折疊蛋白質(zhì)。本發(fā)明可具體用于大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)，尤其是重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了適于實施本發(fā)明的蛋白質(zhì)再折疊方法的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括靜態(tài)混合器、與該靜態(tài)混合器相配并且處于該靜態(tài)混合器上游的導(dǎo)管，所述靜態(tài)混合器上游導(dǎo)管的入口，和所述靜態(tài)混合器下游的低剪切力動態(tài)混合容器。操作時，將再折疊稀釋劑源遞送到該靜態(tài)混合器上游的導(dǎo)管，并且通過所述靜態(tài)混合器上游的入口將濃縮的變性蛋白質(zhì)來源遞送到導(dǎo)管。靜態(tài)混合后，使溶液保持在低剪切力動態(tài)混合容器中一段時間以優(yōu)化方法產(chǎn)率。靜態(tài)混合器包括導(dǎo)管中的一系列混合元件。所述混合元件可以是固定的或者可移動的，但是是無動力的(即，靜態(tài)的)并且僅僅通過液流在它們上方的移動提供混合作用。當(dāng)結(jié)合附圖閱讀下面本發(fā)明的詳細(xì)描述時，本發(fā)明的這些和其他方面和特征將變得更充分地顯而易見。附圖簡述圖l是簡化的示意圖，其圖解了本發(fā)明使用的靜態(tài)混合器的主要特征。圖2是框圖，其圖解了本發(fā)明用于從變性蛋白質(zhì)溶液回收再折疊蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的主要特征。圖3是流程圖，其圖解了本發(fā)明用于從變性蛋白質(zhì)溶液回收再折疊蛋白質(zhì)的方法。圖4A是變性劑濃度對溶液中未折疊的蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)的代表圖。圖4B是對于動態(tài)和靜態(tài)混合來說時間對混合蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)(混合行為和速率)的代表圖。圖5是時間對％活性的曲線圖，圖解了下面實施例2中描述的實驗的結(jié)果。本發(fā)明具體實施方案描述現(xiàn)在將參考一些實施方案描述本發(fā)明的方法和系統(tǒng)。在正文結(jié)構(gòu)中闡明了所述實施方案的重要性質(zhì)和特征。盡管將結(jié)合這些實施方案描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解本發(fā)明無意被局限于這些實施方案。相反，它意在覆蓋備選方案、修改和等同方案，這些可以被包括在如所述權(quán)利要求定義的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)。在下面的描述中，給出了許多特定細(xì)節(jié)以便提供對本發(fā)明的完全理解?？梢栽谌狈@些具體細(xì)節(jié)的一些或者全部的情況下實施本發(fā)明。在其他實施方案中，為了不會不必要地使本發(fā)明晦澀難懂，沒有詳細(xì)描述公知的方法操作。引言本發(fā)明提供了回收再折疊蛋白質(zhì)的方法，其通過靜態(tài)混合變性蛋白質(zhì)的濃縮溶液與再折疊稀釋劑以得到與所述再折疊蛋白質(zhì)的混合物。該方法尤其適于大的加工體積中通過微生物產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)，如干擾素卩-lb,所述加工體積為諸如10L,30L或100L或者以上，如高達(dá)200L或1000L或甚至10,000L。通過從微生物宿主分離蛋白質(zhì)并將它們暴露于變性劑，可以得到變性的蛋白質(zhì)溶液。將該變性蛋白質(zhì)溶液在與該蛋白質(zhì)的正確折疊相容的靜態(tài)混合條件下與合適的再折疊稀釋劑混合，從而快速并且高產(chǎn)率地得到具有生物活性的再折疊蛋白質(zhì)。本發(fā)明尤其可用于大規(guī)模生產(chǎn)再折疊蛋白質(zhì)，尤其是重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了用于實施本發(fā)明的再折疊蛋白質(zhì)回收方法的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括靜態(tài)混合器，與該靜態(tài)混合器連接并且位于其上游的導(dǎo)管，和所述靜態(tài)混合器上游導(dǎo)管的入口。操作時，將再折疊稀釋劑源遞送到該靜態(tài)混合器上游的導(dǎo)管，并且通過所述靜態(tài)混合器上游的入口將濃縮的變性蛋白質(zhì)源遞送到導(dǎo)管。該靜態(tài)混合器包括導(dǎo)管中的一系列混合元件。所述混合元件可以是固定的或者可移動的，但是是無動力的(即，靜態(tài)的)并且僅僅通過液流在它們上方的移動提供混合作用。靜態(tài)混合蛋白質(zhì)混合是兩種現(xiàn)象的偶聯(lián)可能的易于團(tuán)聚環(huán)境的局部面積的減小，和對該蛋白質(zhì)的機械脅迫的增加。因而，當(dāng)?shù)投然旌蠒r，作用于蛋白質(zhì)的剪切力低，但是蛋白質(zhì)可能經(jīng)歷局部的高蛋白質(zhì)濃度，允許它團(tuán)聚。當(dāng)高度混合時，來自環(huán)境的團(tuán)聚可能性較低，但是作用于該蛋白質(zhì)的機械脅迫高，可能破壞該蛋白質(zhì)。存在機械混合的最佳水平，需要確定該水平以發(fā)現(xiàn)再折疊期間剪切力和易于團(tuán)聚環(huán)境的局部面積之間的中點。本發(fā)明用靜態(tài)混合為用于蛋白質(zhì)折疊的有效混合的挑戰(zhàn)提供了新方法。靜態(tài)混合器是導(dǎo)管(例如，管)內(nèi)的一系列幾何元件，其被構(gòu)造用來使用液體流動能量在流過混合器的兩種或多種液體之間產(chǎn)生混合。那么，靜態(tài)混合是僅使用液體流動能量來混合兩種或多種流動液體的混合。幾何混合元件可以是安裝在靜態(tài)混合器導(dǎo)管內(nèi)材料的任何構(gòu)造，其導(dǎo)致在所述元件上經(jīng)過的液流的混合。所述元件通常是固定的，但是它們可以移動，只要所述元件的任何移動是由于在所述元件上待混合的液體的移動而不是外部動力源。優(yōu)選的實例包括槳葉和螺旋。參考圖1，典型的靜態(tài)混合器100是管102和一組固定的螺旋元件104的組合，它分離液流然后通過溫和渦旋混合所得到的液流。該系列事件在每個元件繼續(xù)。通過主入口106和次入口108為混合器IOO提供待混合的液體，主入口106與混合器連接，通常用于較大體積液體，次入口108通過緊鄰混合元件104上游的導(dǎo)管壁進(jìn)入?；旌蠝睾偷焖?，避免了鹽濃度、溫度和蛋白質(zhì)濃度的任何局部化。用于本發(fā)明系統(tǒng)的適合的靜態(tài)混合器可以具有多種幾何結(jié)構(gòu)和構(gòu)造，它們可以至少部分地取決于處理體積。對于30-200L范圍內(nèi)的體積，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)直徑從小于％到高達(dá)2英寸的導(dǎo)管是可以接受的，例如，3/16英寸、3/4英寸、l英寸和2英寸。適合的靜態(tài)混合器可以具有約2到20個混合元件，例如，6到12個混合元件，例如，6或12個元件。這些元件可以是固定的或者可移動的或者其組合。所述元件可以具有任何適合的形狀和結(jié)構(gòu)。在具體實施方案中，靜態(tài)混合器具有6個或者12個固定的螺旋形元件。此類靜態(tài)混合器可以從例如KofloCorporation,Cary，IL得到。如下文適當(dāng)操作此類混合器用于蛋白質(zhì)折疊應(yīng)用最初的濃縮的蛋白質(zhì)可以低至所希望的濃度，但是通常濃度為約10mg/ml變性劑并且可以更高，例如，高達(dá)約20mg/ml或者以上，只要保持可溶性。變性劑可以為例如約3-10M,如5M或8M,Gu-HCL或者尿素。濃縮的變性蛋白質(zhì)溶液在靜態(tài)混合器中被稀釋至再折疊發(fā)生點。例如，可以進(jìn)行IO、20、30或者60倍稀釋。通常，再折疊稀釋劑是緩沖液，所述蛋白質(zhì)在其中是可溶的并且其促進(jìn)該蛋白質(zhì)的正確折疊。這可以是蛋白質(zhì)特異的，盡管對于許多蛋白質(zhì)來說已知適合的再折疊緩沖液，但是對于給定的蛋白質(zhì)來說，可能需要一定程度的實驗來確定用作再折疊稀釋劑的合適緩沖液，這處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的專業(yè)知識范圍內(nèi)。適合作為本發(fā)明的再折疊稀釋劑的緩沖液的一些實例包括約5mM甘氨酸(pH約3)、約5mM磷酸(pH約2-3)和約2mM天冬氨酸(pH約4)。該方法的合適的溫度范圍為約2到30°C,例如約2-8°C,如4°C。當(dāng)不存在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性問題時，優(yōu)選室溫，使得不需要冷藏設(shè)備。選擇混合物的流速使得靜態(tài)混合器具有約200到7000的雷諾數(shù)(ReynoldsNumber)。該方法能夠在小于1天內(nèi)、或者小于1小時，例如小于30分鐘或者小于5分鐘內(nèi)實現(xiàn)大于75%單體(或者至少80、85、90、95、97、98或99%)的產(chǎn)率。盡管不限制本發(fā)明，但是認(rèn)為單體百分比與所述蛋白質(zhì)進(jìn)行與醫(yī)學(xué)病癥減輕相關(guān)的生物功能的能力相關(guān)，所述生物功能在本文中稱作生物活性或者生物學(xué)上有活性的。在蛋白質(zhì)再折疊中使用靜態(tài)混合器可以通過兩種機制在蛋白質(zhì)折疊中減少團(tuán)聚靜態(tài)混合器快速并有效地混合液流以將濃縮的變性蛋白質(zhì)快速稀釋到再折疊稀釋劑中。例如，適合的靜態(tài)混合器可以一般在小于30分鐘，例如約20-30分鐘內(nèi)混合30-200L流體；相比，動態(tài)混合這些大體積需要約6小時或者更長時間。因此，使用靜態(tài)混合器，極大地降低了支持高團(tuán)聚傾向種類(例如，熔球)的變性劑的瞬時濃度。閾值團(tuán)聚濃度將隨蛋白質(zhì)而變。例如，對于卩干擾素，應(yīng)該避免高于約0.2mg/ml的濃度口袋(例如，0.1mg/ml是可接受的)。對于TFPI,應(yīng)該避免高于約2mg/ml的濃度。通常，優(yōu)選盡可能高并且沒有團(tuán)聚問題風(fēng)險的濃度以減小處理體積。而且，靜態(tài)混合器比動態(tài)混合產(chǎn)生更低的蛋白質(zhì)脅迫環(huán)境。對于攪拌的槽，蛋白質(zhì)經(jīng)歷高剪切力的時間與規(guī)^^莫成比例，因為在向稀釋劑中加入蛋白質(zhì)整個期間，整體再折疊溶液被連續(xù)渦旋。隨著該方法在攪拌槽中放大，蛋白質(zhì)可以經(jīng)歷延長幾分鐘到幾小時的脅迫。然而，在靜態(tài)混合器中，蛋白質(zhì)與稀釋劑快速混合(通常在數(shù)秒內(nèi))，然后排出到低剪切混合容器中，產(chǎn)生較短的高速混合停留時間從而產(chǎn)生較低的脅迫。靜態(tài)混合器的另一重要的優(yōu)點是它在驅(qū)動該方法所需的功率中的效率。如以前陳述的，功率增加引起的不利影響是由于功率損耗而向該系統(tǒng)中加入了更大量的熱。對于200L方法，對攪拌槽和靜態(tài)混合器的能量需求進(jìn)行比較。攪拌槽的典型的能量需要將為約2-5HP/1000gal(Rushton，J.H.,Costich,E.W.andEverett,H.J.PowerCharacteristicsofMixingImpeller,Part1,C7zewz'ca/5V7gz力ee〃力g尸rogress,1950,46,467),而靜態(tài)混合器的能量需求為約0.005HP?？梢?吏用等式3計算溫度的相應(yīng)改變等式3其中m為質(zhì)量，Cp是比熱，T是溫度，t是時間?？紤]20分鐘處理時間，-假設(shè)所有功率都一皮轉(zhuǎn)化成熱并且液體凈皮分離，我們發(fā)現(xiàn)△T擾拌容器0.22DC禾口△T靜態(tài)混合器0。C。盡管這些潛在熱效應(yīng)當(dāng)在槽上平均時非常小，但是在高速混合器附近產(chǎn)生局部加熱效應(yīng)，產(chǎn)生高溫，其是處理中需要重點考慮的。為了放大該靜態(tài)混合器，確定混合的數(shù)值是有用的并且通常是必要的。液體的混合依賴于混合區(qū)的特征長度尺度和混合種類的特征速度。在管中的大分子規(guī)模下，可以將混合區(qū)定義為管的長度并將速度定義為進(jìn)入液體的流速。從而，如果我們保持流速和管的直徑成比例，那么我們在放大時保持混合恒定。將速度和直徑關(guān)聯(lián)起來的常用的縮放因子是雷諾值。對于靜態(tài)混合器，這通過等式l給予Re=^Z^等式i其中Q是流速(gal/min),S是比重，p是粘度(cP),D是管的內(nèi)徑。系統(tǒng)和方法圖2是框圖，圖解了本發(fā)明用于從變性蛋白質(zhì)溶液回收再折疊蛋白質(zhì)的系統(tǒng)的主要特征。系統(tǒng)200包括靜態(tài)混合器202。靜態(tài)混合器202與導(dǎo)管(例如管)204連接，該導(dǎo)管通常具有與靜態(tài)混合器相同的直徑。導(dǎo)管204提供了該靜態(tài)混合器的入口，用于兩種液體中的較大體積在靜態(tài)混合器中混合，在這種情況下較大體積液體為蛋白質(zhì)稀釋劑。靜態(tài)混合器的第二個入口206為將要在靜態(tài)混合器中混合的兩種液體中的較小體積提供，在該情況中，較小體積液體為變性的蛋白質(zhì)溶液。用于本發(fā)明系統(tǒng)的適合的靜態(tài)混合.器可以具有多種幾何結(jié)構(gòu)和構(gòu)造，它們可以至少部分地取決于處理體積。對于30-200L范圍內(nèi)的體積，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有從小于％到高達(dá)2英寸的導(dǎo)管是可以接受的，例如，3/16英寸、％英寸、l英寸和2英寸。適合的靜態(tài)混合器可以具有約2到20個混合元件，例如，6到12個混合元件，例如，6或12個元件。這些元件可以是固定的或者可移動的或者其組合。所述元件可以具有任何合適的結(jié)構(gòu)和形狀。在具體實施方案中，靜態(tài)混合器具有6個或者12個固定的螺旋形元件。靜態(tài)混合器202輸出至第二導(dǎo)管208,其通常是第一導(dǎo)管204的延長。第二導(dǎo)管208與動態(tài)混合容器210連接，從而通過靜態(tài)混合器混合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物出口可以通過第二導(dǎo)管208輸送到動態(tài)混合容器210以完成折疊過程。任選地，靜態(tài)混合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以在傳遞到動態(tài)混合容器前，經(jīng)由另一導(dǎo)管(管)通過靜態(tài)混合器202再循環(huán)一次或多次。通常操作動態(tài)混合容器以避免剪切力誘導(dǎo)的蛋白損害。例如，動態(tài)混合可以是非湍流的。然后可以乂人動態(tài)混合容器210以大體積和高產(chǎn)率收集再折疊的蛋白質(zhì)用于貯存或者包裝為藥物產(chǎn)品。以這種方法，動態(tài)混合實現(xiàn)了最佳的蛋白質(zhì)混合，最終正確折疊快速發(fā)生，沒有高濃度口袋、剪切或者生熱，并且具有低功率消耗。圖3是流程圖，圖解了本發(fā)明的從變性蛋白質(zhì)溶液回收再折疊蛋白質(zhì)的方法。該方法涉及提供變性蛋白質(zhì)的濃縮溶液(301)并靜態(tài)混合變性蛋白質(zhì)與再折疊稀釋劑以得到再折疊的蛋白質(zhì)(303)。如上面參照本發(fā)明系統(tǒng)所指出的，在優(yōu)選實施方案中，在靜態(tài)混合操作后，蛋白質(zhì)折疊低剪切混合容器中繼續(xù)。圖4A是變性劑的濃度對溶液中未折疊蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)的代表性曲線圖。該圖闡明變性蛋白質(zhì)在相對狹窄的變性劑(例如，GuHCl)濃度范圍內(nèi)折疊。動態(tài)混合逐漸發(fā)生，從而溶液中被動態(tài)混合的蛋白質(zhì)的折疊條件滿足該曲線圖中的曲線并且對該過程混合條件存在不精確的控制。而且，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合處于部分折疊狀態(tài)時，最可能發(fā)生團(tuán)聚問題，因此縮短蛋白質(zhì)混合物在該狀態(tài)中花的時間量將是有益的。靜態(tài)混合更快地發(fā)生，靜態(tài)混合的蛋白質(zhì)溶液的折疊條件沿著該曲線以點到點(未折疊到折疊)的方式有效移動，在中間的部分混合狀態(tài)中花費很少的時間。這為該過程提供了的更大程度的控制、一致性，以及由此而來的更大的可靠性，允許細(xì)微控制動力學(xué)以實現(xiàn)為天然蛋白質(zhì)折疊優(yōu)化的熱力學(xué)。圖4B是對于動態(tài)和靜態(tài)混合來說時間對混合蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)(混合行為和速率)的代表圖。該圖進(jìn)一步圖解了上面參照圖4A比較動態(tài)和靜態(tài)混合實現(xiàn)的混合相對速率而指出的點。通過曲線410表示的動態(tài)混合僅僅逐漸發(fā)生，導(dǎo)致冗長狀態(tài)的中間混合，而通過曲線420表示的靜態(tài)混合快速發(fā)生。制劑本發(fā)明的方法和系統(tǒng)還可以用于將賦形劑摻入到蛋白質(zhì)混合物中以產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)的治療制劑。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以向待混合的液體中加入海藻糖。本發(fā)明的一種尤其有利的應(yīng)用是大規(guī)才莫生產(chǎn)無HA的重組蛋白，如干擾素卩l(xiāng)b。白蛋白被認(rèn)為與IFN復(fù)合，從而阻止IFN-IFN團(tuán)聚。除去白蛋白以產(chǎn)生無HA的IFN制劑惡化了混合期間的團(tuán)聚問題。盡管本發(fā)明不受到該理論的限制，但是認(rèn)為海藻糖可以減輕在無HA的蛋白質(zhì)制劑中除去白蛋白引起的一些團(tuán)聚問題。在一個實施方案中，待混合的蛋白質(zhì)溶液包括2mM天冬氨酸緩沖液(pH約4)中的0.25mg/ml無HA的干擾素p-1b以及9%海藻糖。該方法的結(jié)果是完全的無HA蛋白質(zhì)(例如，IFN-卩l(xiāng)b)制劑。實施例提供下面的實施例以闡明本發(fā)明的某些方面。這些實施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明但是無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例l:具有一個二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性用于商業(yè)生產(chǎn)的一種目的蛋白質(zhì)是干擾素卩(IFN-(3),尤其是干擾素卩l(xiāng)b(IFN-卩l(xiāng)b),其是18.5kD合成的IFN-卩重組蛋白質(zhì)類似物。IFN-卩l(xiāng)b是再折疊的蛋白質(zhì)，其17位的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基置換。作為微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，IFN-(3lb是未糖基化的。它還具有N末端甲硫氨酸缺失。它的特征是天然狀態(tài)下的非常疏水的表面和一個二硫鍵，該二石危鍵在整個處理中^f呆持完整。以Betaseron⑧上市的IFN-(3lb已經(jīng)配置為成功的藥物，其已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療和控制多發(fā)性硬化(MS)。該蛋白質(zhì)類似物、其生產(chǎn)所需的材料和技術(shù)、作為治療劑的制劑和治療MS的用途已經(jīng)在許多美國專利和申請中描述和要求保護(hù)，所述美國專利和申請包括申請?zhí)?35,154(1982年10月19日提交)；專利號4,588,585(1986年5月13日出版)；專利號4,737,462(1988年4月12日出版)；和專利號4,959,314U990年9月25日出版)，出于所有目的將它們每一個以其整體通過參考引入本文。此外，一些IFN-j3藥物制劑，包括Betaseron⑧，含有常用的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑人血清白蛋白(HA或HSA)。HA是人血產(chǎn)物并且供應(yīng)日益降低。因此，近來需要無HA的藥物制劑。該實l僉研究了使用靜態(tài)混合器再折疊無HA的IFN的可能性并對多種變量(包括不同的雷諾數(shù)；T形管(tee)距離和溫度)測試了它們對單體百分?jǐn)?shù)的影響，單體百分?jǐn)?shù)即沒有分子間鍵的正確折疊的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。通過體積排阻層析HPLC測定單體百分?jǐn)?shù)。將測試的變量與用機械混合方法在相似條件下得到的單體百分?jǐn)?shù)相比較。為了在O.lg規(guī)模再折疊IFN,將含有5M鹽酸胍(GuHCl)的10mg/mL無HA的IFN-(3lb溶液用稀釋劑在2-8°C冷室中稀釋60倍。該實馬全最初使用Koflo12-元件3/16"—次性管內(nèi)(inline)混合器，其經(jīng)改良而包括混合元件上游約lmm處的漸縮管倒鉤適配器(T形管)。使用下面為lg規(guī)模描述的Koflo6-元件3/5"管內(nèi)混合器進(jìn)行以后的試驗。測試的雷諾數(shù)在300到2000的值之間。用加入至472mL再折疊稀釋劑的8mLIFN溶液在攪拌平板上劇烈混合進(jìn)行對照。該階段的結(jié)果在下面的表I中。表I.O.lg規(guī)模下IFN的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>倍。最初的實驗使用Koflo6-元件3/5"—次性管內(nèi)(靜態(tài))混合器，在入口之前2.5"到4"之間連接漸縮T形管。以后的試驗在5g規(guī)模下使用下述3/4"不銹鋼靜態(tài)混合器。測試的雷i若數(shù)為2000-7000之間。地磅顯示最終的希望體積后停止流速。在該階段的結(jié)果在下面的表II中。表II.1g規(guī)模下IFN的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在5g規(guī)模下，將10mg/mL濃IFN用再折疊稀釋劑稀釋60倍。％"KoFlo6-元件不銹鋼靜態(tài)混合器在緊接混合元件的上游安裝!/2"漸縮T形管。將混合器夾緊至50L有夾套的不銹鋼罐的底部部分，罐壁葉輪在相反側(cè)運行。使用平均的總流速，對于所有靜態(tài)混合器運行，雷諾數(shù)為約4000。在/人濃縮的IFN并瓦清空全部內(nèi)容物后停止?jié)饪s的IFN泵，而在地磅顯示最終希望的體積(其包括緩沖液罐和再折疊罐之間的維持體積)后停止緩沖液泵(用于再折疊稀釋劑)。在2-10°C處理材料。處理后，讓再折疊罐混合不少于10分鐘。使用安裝3/4"漸縮T形管的2"Koflo不銹鋼6-元件靜態(tài)混合器進(jìn)行額外實驗。雷諾數(shù)保持恒定在4000。結(jié)果在下面的表III中顯示。表III.5g規(guī)模下IFN的結(jié)果處理時間混合器類型漸縮T形管距離溫度%單體RE=400010min3/4，，不銹鋼w/6-元件3"10oC97.81RE=400010min3/4"不銹鋼w/6畫元件3，，5。C98.36RE=40003min2"AL6XNw/12畫元件3"~50C99.50動態(tài)混合30minN/AN/A40C98.02如表I和III中所示，對于每種規(guī)模，最終的單體百分?jǐn)?shù)大于對照百分?jǐn)?shù)。在lg規(guī)模沒有進(jìn)行對照；然而，對于O.lg規(guī)模和5g規(guī)模，每種試驗產(chǎn)生比任一種對照百分?jǐn)?shù)相似或更大的產(chǎn)率。從而，本發(fā)明的基于靜態(tài)混合的方法和系統(tǒng)實現(xiàn)了與常規(guī)方法相比至少一樣好和通常更好的產(chǎn)率。另一益處是在更大規(guī)模(即，用于生產(chǎn)的30g規(guī)模)下，靜態(tài)混合時間保持恒定(3-15分鐘)，而動態(tài)混合時間由于對局部化蛋白質(zhì)或者變性劑濃度(其中可以發(fā)生IFN的團(tuán)聚)的考慮而增加(從30分鐘到幾小時)。從而，靜態(tài)混合可以很容易地放大到大規(guī)模生產(chǎn)。還提供了更一致的結(jié)果并且是更可靠的方法。實施例2:在天然狀態(tài)具有三個或者更多二硫鍵的蛋白質(zhì)的復(fù)性雞蛋白溶菌酶是具有四個二硫鍵的14kD分子。它具有復(fù)雜的再折疊方案，但是已經(jīng)被詳細(xì)研究并且已經(jīng)被詳細(xì)地表征。該實驗表明靜態(tài)混合器將適用于比IFN更復(fù)雜的折疊方案。將在37。C下在8MGuHCl，50mMTns,lmMEDTA,32mMDTT緩沖液，pH8中變性1小時的0.3g溶菌酶用1.25MGuHC1,50mMTns,1mMEDTA緩沖液，pH8在5分鐘內(nèi)稀釋16倍并在25。C孵育24小時以產(chǎn)生lmg/mL的終濃度。該實驗使用具有12個螺旋元件的3/16"—次性靜態(tài)混合器，所述螺旋元件在緊接混合元件的上游安裝了漸縮管倒鉤適配器。選擇流速以得到約1000的雷諾數(shù)(即，對于稀釋緩沖液為60mL/分鐘，對于變性溶菌酶溶液為4mL/分鐘)。采集樣品用于通過活性測定法測定純度百分?jǐn)?shù)以評估再折疊動力學(xué)。圖5是時間對％活性圖，圖解了三次單獨再折疊的再折疊動力學(xué)。4吏用乂人Jolles,P.LysozymesfromRabbitSpleenandDogSpleen.M^/^Az"五^ymo/ogy1962,5,137改編的方法在24小時后進(jìn)行溶菌酶動力學(xué)的最后分析。對于三次單獨的試驗，24小時后活性溶菌酶的最后回收為90%或者更高。這與公布的結(jié)果相當(dāng)，其中動態(tài)混合產(chǎn)生約95%的溶菌酶活性(DeBernardez-Clark,E.,Hevehan,D.,Szela,S.，Maachupalli,J.OxidativeRenaturationofHenEgg-WhiteLysozyme.FoldingvsAggregation.萬/她c/wo/ogy/Vogmw1998,14,47-54)。從而,該實驗表明使用靜態(tài)混合器，在再折疊具有多個二硫鍵的重組蛋白質(zhì)中的效用。實驗結(jié)果討論再折疊來自包含體的蛋白質(zhì)的主要問題是團(tuán)聚。團(tuán)聚可被描述為導(dǎo)致團(tuán)聚的吸引力與導(dǎo)致再折疊的吸引力的竟?fàn)帯榱丝刂圃僬郫B期間的團(tuán)聚，使用了劇烈攪拌。然而，使用機械攪拌器的常用混合方案可能破壞該蛋白質(zhì)或者無效地混合該蛋白質(zhì)而引起團(tuán)聚。使用靜態(tài)混合器是該問題的新解決方案，因為它快速混合液流而沒有機械混合引起的極端剪切力，并且可以容易地用于生產(chǎn)車間，因為它可容易地改變規(guī)才莫。來自兩種單獨的蛋白質(zhì)的結(jié)果表明寬范圍的應(yīng)用性。結(jié)論本發(fā)明的基于靜態(tài)混合的方法和系統(tǒng)實現(xiàn)了與常規(guī)方法至少一樣好的產(chǎn)率。此外，它可容易地放大到大規(guī);漠生產(chǎn)、更快、提供更一致的結(jié)果并且是更可靠的方法。盡管為了清楚理解的目的而更詳細(xì)地描述了前面的發(fā)明，但是顯而易見的是在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)可以實施某些改變和修改。應(yīng)注意到有許多備選方案可以實現(xiàn)本發(fā)明的方法和組合物。因此，本發(fā)明的實施方案將被認(rèn)為是闡明性的并且不是限制性的，并且本發(fā)明不限于本文給出的細(xì)節(jié)，而是可以在所附權(quán)利要求的范圍和等同方案內(nèi)被修改。將本文引用的所有文件完整地和為了所有目的引入本文作為參考。權(quán)利要求1.再折疊蛋白質(zhì)的方法，其包括提供變性蛋白質(zhì)的濃縮溶液；和使所述變性蛋白質(zhì)與再折疊稀釋劑靜態(tài)混合以得到包含再折疊蛋白質(zhì)的混合物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過微生物產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述變性蛋白質(zhì)溶液是通過從微生物宿主分離蛋白質(zhì)并將其暴露于變性劑而得到。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述再折疊稀釋劑是緩沖液，所述蛋白質(zhì)在其中可溶。5.權(quán)利要求4的方法，其中靜態(tài)混合于在導(dǎo)管中包含一系列混合元件的靜態(tài)混合器中發(fā)生。6.權(quán)利要求5的方法，其中在導(dǎo)管中所述再折疊稀釋劑流臨近到達(dá)所述靜態(tài)混合器的混合元件前，將所述蛋白質(zhì)溶液遞送到所述再折疊稀釋劑流。7.權(quán)利要求1的方法，其中在所述靜態(tài)混合后為所述混合物被提供至動態(tài)混合容器。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述混合物在所述動態(tài)混合容器中動態(tài)混合。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述再折疊蛋白質(zhì)在小于1小時內(nèi)以大于75%單體的產(chǎn)率被獲得。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述再折疊蛋白質(zhì)以大于95%的產(chǎn)率被獲得。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述再折疊蛋白質(zhì)在小于30分鐘內(nèi)被獲得。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述再折疊蛋白質(zhì)在小于5分鐘內(nèi)被獲得。13.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白質(zhì)溶液中所述變性劑的濃度小于3M。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述稀釋為至少10倍。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述稀釋為至少60倍。16.權(quán)利要求l的方法，其中混合期間的溫度為約2到3(TC。17.權(quán)利要求1的方法，其中混合期間的溫度為約4。C。18.權(quán)利要求1的方法，其中混合期間的蛋白質(zhì)濃度小于0.2mg/ml。19.權(quán)利要求18的方法，其中混合期間的蛋白質(zhì)濃度為約0.1mg/ml。20.權(quán)利要求1的方法，其中選擇混合物的流速使得所述靜態(tài)混合器具有約200到7000之間的雷諾數(shù)。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物的體積大于IOL。22.權(quán)利要求l的方法，其中所述混合物的體積大于IOOL。23.權(quán)利要求l的方法，其中所述混合物的體積大于IOOOL。24.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)在其天然狀態(tài)具有一個或多個分子內(nèi)二硫鍵。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述蛋白質(zhì)在其天然狀態(tài)具有一個分子內(nèi)二硫鍵。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述蛋白質(zhì)是干擾素卩。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述蛋白質(zhì)是干擾素P-lb。28.權(quán)利要求27的方法，其中蛋白質(zhì)溶液包含無HA的干擾素卩。29.權(quán)利要求1的方法，其中再折疊的蛋白質(zhì)是生物學(xué)上有活性的。30.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物還包含一般被認(rèn)為是所述活性蛋白質(zhì)的治療制劑的安全成分的賦形劑。31.4又利要求30的方法，其中所述賦形劑包含海藻糖。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述蛋白質(zhì)溶液包含pH約為4的2mM天冬氨酸中的0.1mg/ml無HA的干擾素卩-lb并且所述賦形劑包含9%海藻糖。33.用于從溶液回收再折疊蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，其包括靜態(tài)混合器；與所述靜態(tài)混合器相配并且處于其上游的導(dǎo)管；和所述靜態(tài)混合器上游導(dǎo)管的入口。34.^又利要求33的系統(tǒng)，其還包括再折疊稀釋劑源，其被配置為用于遞送到所述靜態(tài)混合器上游的導(dǎo)管；和濃縮的變性蛋白質(zhì)源，其被配置為用于通過所述靜態(tài)混合器上游的入口遞送到所述導(dǎo)管。35.權(quán)利要求34的系統(tǒng)，其中所述靜態(tài)混合器在導(dǎo)管中包含一系列固定的混合元件、可移動的混合元件，或者其組合。36.權(quán)利要求35的系統(tǒng)，其中所述靜態(tài)混合器導(dǎo)管具有不超過2英寸的直徑。37.權(quán)利要求36的系統(tǒng)，其中所述靜態(tài)混合器導(dǎo)管具有約3/4英寸的直徑。38.權(quán)利要求35的系統(tǒng)，其中所述靜態(tài)混合器具有固定的元件。39.權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其還包括所述靜態(tài)混合器下游的動態(tài)混合容器。全文摘要回收再折疊蛋白質(zhì)的方法，包括使變性蛋白質(zhì)的濃縮溶液與再折疊稀釋劑靜態(tài)混合以得到再折疊蛋白質(zhì)。本方法尤其適于大規(guī)模處理體積的微生物產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。通過從微生物宿主分離蛋白質(zhì)并將它們暴露于變性劑，可以得到變性的蛋白質(zhì)溶液。將該溶液與適合的再折疊稀釋劑在與所述蛋白質(zhì)的正確折疊相容的靜態(tài)混合條件下混合，從而得到所述再折疊蛋白質(zhì)，優(yōu)選快速并且高產(chǎn)率地得到。用于實現(xiàn)再折疊蛋白質(zhì)回收方法的系統(tǒng)包括靜態(tài)混合器、與該靜態(tài)混合器相配并且處于其上游的導(dǎo)管，和所述靜態(tài)混合器上游導(dǎo)管的入口，以及任選地，所述靜態(tài)混合器下游的動態(tài)的、優(yōu)選非湍流的混合容器。本發(fā)明可尤其用于大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)，尤其是重組蛋白質(zhì)。文檔編號C07K1/113GK101233152SQ200680027895公開日2008年7月30日申請日期2006年7月28日優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日發(fā)明者J·盧克,R·圣約翰,T·樂申請人:諾瓦蒂斯有限公司