專利名稱：：用于治療蛋白質(zhì)錯折疊及蛋白質(zhì)聚集疾病的組合物和方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及小分子量分子，其包括(但不限于)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的非天然狀態(tài)并防止未折疊、異常折疊或錯折疊的蛋白質(zhì)聚集的肽、肽類似物和擬肽。本發(fā)明還涉及利用肽、肽類似物或擬肽或者利用編碼所述述肽的核苷酸來治療蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)是由基因編碼的氨基酸序列組成并通過細胞的蛋白質(zhì)合成機制來合成的多肽鏈。蛋白質(zhì)合成后，折疊成功能性的立體結(jié)構(gòu)，該過程通常需要被稱為分子伴侶的單獨蛋白質(zhì)參與。分子伴侶是內(nèi)源性的專門化蛋白質(zhì)，其幫助合成的多肽正常折疊成它們的功能形式。正確折疊的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到它們的目的地并在那里行使其功能。突變、分子及環(huán)境應激、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)水解和衰老可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導致未折疊或錯折疊的、功能改變的蛋白質(zhì)。所述改變的功能可以通過許多機制導致發(fā)病率的升高，所述機制包括(但不限于)重要細胞進程的破壞、聚集導致的毒性以及細胞死亡反應。分子伴倡與部分折疊多肽之間的相互作用是對蛋白質(zhì)未折疊和聚集疾病的一種天然防御。當體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)因為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而獲得或失去功能時，就會發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病。蛋白質(zhì)聚集疾病是蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的一個亞類，其中未折疊或錯折疊的蛋白質(zhì)形成對細胞有毒的聚集物。許多蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病是衰老的自然結(jié)果。隨著衰老，細胞保護自身免受蛋白質(zhì)未折疊和聚集的致命影響的能力大大減弱。作為抵抗蛋白質(zhì)未折疊和錯折疊的天然防御分子，分子伴侶的能力也隨著衰老而急劇下降，而未折疊和錯折疊的蛋白質(zhì)數(shù)量則急劇增加。因此，當類似重新折疊和降解的保護途徑變得無效而不能將非功能性的結(jié)構(gòu)缺陷蛋白從細胞和/或組織中清除時，就會導致蛋白質(zhì)錯折疊和聚集疾病(表1)(Sanders和Myers，An皿.Rev.Biophys.Biomol.Struct"33:25-51，2004)。表l:蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病以及其中涉及到的各病原學蛋白質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>雖然分子伴侶可以由數(shù)千個肽組成，但是只有少數(shù)肽對于抗蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的功負^是必需的(Santhoshkumar禾口Sharma,Afo/ecw/arCe〃w/ar5/oc/2em^^y267:147-155,2004)。盡管蛋白質(zhì)分子伴侶在體內(nèi)非常有效，但它們非常大，限制了它們在治療應用中的生物利用度。因此，現(xiàn)有技術(shù)存在這樣一個明確的、未滿足的需求更容易制備并用于多種治療和生產(chǎn)應用的具有分子伴侶功能特性的肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及能穩(wěn)定并減少未折疊、異常折疊或錯折疊的蛋白質(zhì)聚集的多肽、肽類似物和擬肽。因此，本發(fā)明提供了基于肽的組合物、肽變異體組合物或擬肽組合物，這些組合物可抑制蛋白質(zhì)錯折疊和/或聚集，并因而可用于多種治療和生產(chǎn)應用，包括例如蛋白質(zhì)錯折疊和/或聚集相關(guān)疾病和病征的治療以及用于生產(chǎn)和純化重組蛋白的方法。本發(fā)明提供了多肽組合物、功能性變異體及其擬肽，還提供了用于治療哺乳動物受治療者疾病的方法，所述方法包括給有相應需要的受治療者施用具有分子伴侶活性、長度最多約50個氨基酸的多肽。該方法能有效治療蛋白質(zhì)聚集相關(guān)疾病，以及例如年齡相關(guān)性肌病和心臟局部缺血。本發(fā)明提供了一種用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使蛋白質(zhì)與具有分子伴侶活性、長度最多約50個氨基酸的多肽相接觸。本發(fā)明提供了一種提高治療性蛋白功效以治療疾病的方法。本發(fā)明還提供了^種提高重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的方法。這些方法提供了一種長度最多約50個氨基酸的多肽，作為活性蛋白組合物，所述多肽限制了蛋白質(zhì)聚集并為重組蛋白提供了正確的多肽折疊。本發(fā)明提供了多肽X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、乂廣PFFPFHSP-X2、乂廣FPFHSPSIl-:X2、乂廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2或X廣IAIHHPWI-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中，X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S吏序列，n為0-50，X,和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP畫X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPS尺曙X2、X,-DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2或X廣IAIHHPWI-X2相同。本發(fā)明提供了多肽X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF-X2、X廣LRPPSFLR-X2、X廣PPSFLRAP-X2、X廣SFLRAPSW-X2、X廣LRAPSWFD-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S交序列，n為0-50,X!和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣SLSPFYLRPPSFLRAP畫X2、X廣SPFYLRPP國X2、X廣SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF畫X2、X廣:LRPPSFL尺-X2、X廣PPSFLRAP-X2、X廣SFLRAPSW畫X2、X,-LRAPSWFD-X2相同。本發(fā)明提供了X廣RLEKDRFS-X2、Xi-FSVNLDVK-X2、X廣LKVKVLGD-X2、Xi-FISREFHR-X2、X廣HGFISREF-X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI畫X2、XrSREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP-X2或X廣LTVNGPRK-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S臾序列，n為0-50，X,和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣RLEKDRFS-X2、X廣FSVNLDVK-X2、X廣LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR-X2、X廣HGFISREF-X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP-X2或X廣LTVNGPRK-X2相同。本發(fā)明提供了一種多肽一XrRTIPITRE-X2或者其功能性變異體或模擬物，其中X!和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，n為0-50,X，和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基g臾取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣RTIPITRE-X2相同。所述功能性變異體含有I-X-I/V氨基酸基序。本發(fā)明提供了一種用于治療哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，所述方法包括給有相應需要的受治療者施用一種多肽，其中所述多肽是XrWIRRPFFPFHSP-X2、XrWIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSH-乂2、乂廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-乂2、X廣IAIHHPWI-X2、X,-SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYL尺-乂2、X廣FYLRPPSF-X2、乂廠LRPPSFL尺隱X2、X廣PPSFLRAP-X2XrRLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2X-GVLTVNGP-X2X廣SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK國X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S1序列，n為0-50,X,和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣WIRRPFFPFHSP畫X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X-FPFHSPSR-X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2XrEFHRKYRI-X2X廣GVLTVNGP-XX廣L證SFLR-X2Xi-LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2X,畫KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2X廣FYLRPPSF-X2、X廣SFLRAPSW-X2、X廣FSVNLDVK-X2、X廣HGFISREF-X2、、X,-SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2相同。更具體地，功能性變異體X廣RTIPITRE-X2多肽含有I-X-I/V氨基酸基序。所述疾病包括(但不限于)亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。所述疾病還包括(但不限于)年齡相關(guān)性肌病或心臟局部缺血。本發(fā)明提供了一種用于治療哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，所述方法包括給有相應需要的受治療者施用編碼一種多肽的核酸，其中所述多肽是X,-WIRRPFFPFHSP-X2、XrWIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSH-乂2、X!-DQFFGEHL-X2、X,-FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF-X2、乂廣PPSFLRAP-乂2、X廣SFLRAPSW-乂2、.X廣RLEKDRFS-X2、X廣PSVNLDVK-X2、X廣SPFYLRPP-X2X,-LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD陽X2X廣LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR誦X2、X廣HGFISREF誦X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY隱X2、X廣LTITSSLS-X2、X-GVLTVNGP-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，n為0-50,X,和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序歹'J與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、乂廣PFFPFHSP-乂2、X廣FPFHSPSH-乂2、乂廣DQFFGEHL-乂2、X廣FFGEHLLE-X2或X,-IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP隱X2、X廣LRPPSFLR隱X2、X,-LRAPSWFD畫X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2,X廣LTITSSLS-X2、X廣RTIPITRE畫X2相同X-SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2X,畫FYLRPPSF-X2XrSFLRAPSW-X2X,-FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X陽LTVNGPRK隱X2或X廣GVLTVNGP-X2、更具體地，功能性變異體X,-RTIPITRE-X2多肽含有I-X-I/V氨基酸基序。所述疾病包括(但不限于)亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。所述疾病還包括(但不限于)年齡相關(guān)性肌病或心臟局部缺血。本發(fā)明提供了一種用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使蛋白質(zhì)與一種多肽接觸，所述多肽是X廠WIRRPFFPFHSP-X2、X廠WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2X廣FFGEHLLE-X2、X,-SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR誦X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2Xi-KYRIPADV-X2XrFPFHSPSR"X2、乂)匿DQFFGEHL-X2X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR隱X2X廣EFHRKYRI陽X2X'-FYLRPPSF-X2X廣SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LTITSSLS畫X2、X廣GVLTVNGP-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中Xi和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，n為0-50,X,和X2中的n可以相同或不同。另一方面，所述功能性變異體或^f莫擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氛基酉復序歹11與XrWIRRPFFPFHSP-X2、XrWIRRPFFP-X2、乂廣PFFPFHSP-X2、X!隱FPFHSPSFl-X2、乂廠DQFFGEHL-X2、X,-FFGEHLLE-X2或X-IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣LRPPSFLR隱X2、X廣LRAPSWFD-X2、X廣LKVKVLGD-X2XrKYRIPADV-X2、x廣;ltitssls畫X2、x廣rtipitre畫x2相同X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR畫X2X廣EFHRKYRI-X2X,-GVLTVNGP-X7X廣FYLRPPSF畫X2XrSFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY畫X2X廣LTVNGPRK-X2或更具體地，功能性變異體X廣RTIPITRE-X2多肽含有l(wèi)-X-I/V氨基g菱基序。所述用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法還提供了所述蛋白質(zhì)為一種治療性蛋白。所述治療性蛋白質(zhì)包括(但不限于)疫苗、胰島素、生長因子或抗體。另一方面，所述蛋白質(zhì)是一種重組產(chǎn)生的蛋白。所述用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法還包括提高治療性蛋白的穩(wěn)定性以治療哺乳動物受治療者的疾病。所述方法還包括抑制蛋白質(zhì)錯折疊或減少蛋白質(zhì)聚集。所述方法還包括恢復蛋白質(zhì)正確或天然的折疊。本發(fā)明提供了一種用于診斷哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，所述方法包括使哺乳動物受治療者的組織樣品與一種多肽接觸，所述多肽是X,-WIRRPFFPFHSP-X2、X,醒WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPS尺-乂2、乂廣DQFFGEHL-乂2、X廣FFGEHLLE-X2、X畫IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF-X2、X廣LRPPSFLR-X2、X「PPSFLRAP-X2、X廣SFLRAPSW-X2、X廣LRAPSWFD畫X2、X廣RLEKDRFS-X2、X廣FSVNLDVK國X2、X廣LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR-X2、乂廣HGFISREF國乂2、X廣KYRIPADV誦X2、X廠EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY隱X2、X廣LTITSSLS畫X2、X廣GVLTVNGP國X2、X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，n為0-50，X,和X2中的n可以相同或不同；檢測錯折疊蛋白、未折疊蛋白或聚集蛋白與所述多肽的結(jié)合；確定哺乳動物受治療者中是否存在所述疾病。另一方面，通過蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或聚集的階段來檢測是否存在所述疾病。另一方面，所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。具體地，所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X!-PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSH-X2、乂廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣LRPPSFLR-X2、X廠LRAPSWFD-X2XrLKVKVLGD-X2X,-KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2、X廣RTIPITRE-X2相同X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI畫X2XrFYLRPPSF-X2X廣SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK畫X，或X廣GVLTVNGP-X2、更具體地，X廣RTIPITRE-X2多肽含有I-X-I/V氨基酸基序。所述疾病包括(但不限于)亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。所述疾病還包括(但不限于)年齡相關(guān)性肌病或心臟局部缺血。圖1是描述Intellipeptide穩(wěn)定錯折疊蛋白和/或防止蛋白質(zhì)聚集的治療性應用的示意圖。圖2是描述Intellipeptide在體外對pH誘導的(3淀粉樣蛋白聚集的影響的條形圖。圖3是描述Intellipeptide在體外對Cu+,秀導的卩淀粉樣蛋白聚集的影響的條形圖。圖4顯示了阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)中的淀粉樣變性以及使用Intellipeptide可能的介入的示意圖。圖5顯示了一種利用靜電表面的分子模型來設計具有多肽特征的合成分子的方法。圖6總結(jié)了從多肽SLSPFYLRPPSFLRAPS、EKDRFSVNLDVKHFS、HGFISREFHRKYR、DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ和PERTIPITREEK的多肽序列衍生的一系列肽。圖7顯示了從序列SLSPFYLRPPSFLRAPS衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖8顯示了從序列EKDRFSVNLDVKHFS衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖9顯示了從序列HGFISREFHRKYR衍生的一系列肽的氨基S菱序列。的氨基酸序列。圖ll顯示了從序列PERTIPITREEK衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖12顯示了蛋白質(zhì)針腳陣列(pinarray)檢測的示意圖。具體方案參考方法部分。圖13顯示了固定在針腳上的人aB晶狀體蛋白8-mer肽在23。c下與未加熱的f3H晶狀體蛋白之間以及在45。c下與預熱的pH晶狀體蛋白之間相互作用15分種的圖式。圖14顯示了固定在針腳上的人aB晶狀體蛋白8-mer肽在23。c下與未加熱的yD晶狀體蛋白之間以及在45。c下與預熱的yD晶狀體蛋白之間相互作用15分種的圖式。圖15顯示了Ph晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、乙醇脫氫酶(ADH)和檸檬酸合成酶(CS)的遠紫外圓二色譜(farUVCD)。匯集了(3H晶狀體蛋白(A:左上)、yD晶狀體蛋白(B:右上)、ADH(C:左下)和CS(右下)在23。c、45。c和5(tc的圖譜。圖16顯示了Ph晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、ADH和CS的近紫外圓二色譜(nearUVCD)。匯集了pH晶狀體蛋白(A:左上)、yD晶狀體蛋白(B:右上)、ADH(C:左下)和CS(D:右下)在23°C、45。C和50°C的圖譜。圖17顯示了人aB晶狀體蛋白肽和ADH之間的相互作用圖式。圖18顯示了人aB晶狀體蛋白肽和CS之間的相互作用圖式。圖19顯示了兩個陽性活性序歹'J73DRFSVNLDVKHFS85和131LTITSSLSDGV141以及來自人aB晶狀體蛋白的a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的一個非活性序列n,HGKHEERQDE，(對照)的分子伴侶才企測。圖20顯示了使用人aB晶狀體蛋白針腳陣列檢測所識別的肽與之前報道的aB晶狀體蛋白活性序列之間的比較。圖21顯示了aB晶狀體蛋白活性結(jié)構(gòu)域的立體圖。圖22顯示了aB晶狀體蛋白和5個aB晶狀體蛋白衍生肽對A(3纖維化的影響。圖23顯示了aB晶狀體蛋白和5個aB晶狀體蛋白衍生肽對YD晶狀體蛋白纖維化的影響。圖24顯示了5個aB晶狀體蛋白衍生肽的分子伴侶檢測。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了穩(wěn)定蛋白質(zhì)的非天然狀態(tài)并防止未折疊、異常折疊或錯折疊蛋白質(zhì)聚集的多肽、肽類似物和擬肽。因此，本發(fā)明提供了基于肽的組合物，這些組合物抑制蛋白質(zhì)錯折疊、異常折疊和/或聚集，因而可在多種治療和生產(chǎn)應用中使用，包括，例如與蛋白質(zhì)錯折疊、異常折疊和/或聚集相關(guān)的疾病和病癥的治療以及用來生產(chǎn)和純化重組蛋白的方法。附圖l描述了Intellipeptide穩(wěn)定錯折疊蛋白和/或防止蛋白質(zhì)聚集的治療性應用。粗連續(xù)箭頭顯示了新合成的蛋白質(zhì)(U)、部分折疊的中間體(I)和完全折疊的天然蛋白質(zhì)(N)的正常路徑的示意圖。圖中細箭頭表示蛋白質(zhì)聚集和降解的路徑。潛在的治療性介入點表示為閃電標志，Intellipeptide能夠在這些點介入來防止蛋白質(zhì)錯折疊和聚集疾病。蛋白質(zhì)針腳陣列使用天然的晶狀體蛋白Ph晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白，以及體外分子伴估耙蛋白，如乙醇脫氫酶和檸檬酸合成酶，確定了人aB晶狀體蛋白中具有分子伴侶活性的活性多肽序列。具有穩(wěn)定并減少錯折疊蛋白質(zhì)聚集活性的多肽片斷包括來自人aB晶狀體蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域、a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域或C末端結(jié)構(gòu)域的多肽序列。N末端結(jié)構(gòu)域含有具有分子伴侶活性的活性多肽序歹ll9WIRRPFFPFHSP20和43SLSPFYLRPPSFLRAP58。N末端結(jié)構(gòu)域還含有下述具有分子伴侶活性的活性多肽序歹'j:WIRRPFFP、PFFPFHSP、FPFHSPSR、DQFFGEHL、FFGEHLLE或IAIHHPWI、SPFYLRPP、SLSPFYLR、FYLRPPSF、LRPPSFLR、PPSFLRAP、SFLRAPSW、LRAPSWFD。a晶卄犬體蛋白一亥心結(jié)構(gòu)域含有下述具有分子伴侶活性的活性蛋白序列75FSVNLDVK82①3)、113FISREFHR12。、mLTITSSLSn8(卩8)和141GVLTVNGPI48((39)。a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域還含有具有分子伴侶活性的活性蛋白序列RLEKDRFS、LKVKVLGD、HGFISREF、KYRIPADV、EFHRKYRI、SREFHRKY或LTVNGPRK。C末端結(jié)構(gòu)域含有活性序列157RTIPITRE164，該序列包括高度保守的I-X-I/V氨基酸基序。將屬于a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的兩個活性序列73DRFSVNLDVKHFS85和131LTITSSLSDGV141合成為肽，并4企測體外的分子伴侶活性。這兩個合成的肽在體外都抑制了Ph晶狀體蛋白、乙醇脫氫酶和檸檬酸合成酶的熱聚集。針腳陣列所確定的7個分子伴侶序列中的5個序列與之前確定為在人aB晶狀體蛋白中產(chǎn)生亞基-亞基相互作用的序列之間是重疊的。結(jié)果表明，人aB晶狀體蛋白中的活性序列具有雙重作用亞基-亞基組裝和分子伴侶活性。要理解本發(fā)明不限于特定的方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，這些應該都可以變化。還要理解本文使用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案的目的，不是要進行限制。如本說明書和權(quán)利要求書使用的單數(shù)形式的包括復數(shù)指代，除非所述內(nèi)容另有清楚說明。因此，例如，"細胞"包括兩個或更多細胞的組合，等等。本文使用的"約"指代可測量值(如數(shù)量、臨時的持續(xù)時間等)時，意為包括具體值的±20%或±10%、更優(yōu)選為±5%、甚至更優(yōu)選為±1%、還更除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領域普通技術(shù)人員所公知的含義相同。雖然本文描述了優(yōu)選的材料和方法，但是與這些所述材料和方法類似或等同的任何材料和方法都能夠用于本發(fā)明試驗的實踐。在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中會使用下述術(shù)語肽本發(fā)明的肽、肽類似物和擬肽在本文被統(tǒng)稱為"Intellipeptide"、"聚集抑制肽"、"抑制蛋白異常折疊、未折疊、錯折疊或蛋白聚集的肽"。Intellipeptide的鑒定是使用蛋白質(zhì)針腳陣列、計算機模型設計、結(jié)構(gòu)和功能上相似的蛋白質(zhì)的多重序列對比分析、分子伴估的體外分光測定和/或體內(nèi)細胞殺傷測定。Lntellipeptide可穩(wěn)定并防止多種靶蛋白的未折疊、錯折疊或聚集，這些靶蛋白包括(但不限于)(3淀粉樣蛋白、p/Y晶狀體蛋白、肌動蛋白、索蛋白、波形蛋白、胰島素、檸檬S臾合成酶、乙醇脫氫酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、a乳清蛋白、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、P轉(zhuǎn)化生長因子、卩神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、卩連環(huán)蛋白、(x肝瘤壞死因子、Bcl-2、Bcl-Xl和胱門蛋白酶。在一種用于治療哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法中，Intellipeptide能有效穩(wěn)定和/或防止多種疾病靶蛋白的未折疊、錯折疊或聚集。疾病靶蛋白包括(但不限于)神經(jīng)變性疾病，阿爾茨海默病((3淀粉樣蛋白、牛磺酸)；帕金森病(a-核突觸蛋白、?；撬?；克-雅病(淀粉樣蛋白)；苦魯病(淀粉樣蛋白)；GSS病(淀粉樣蛋白)；亨廷頓病(亨廷頓病蛋白)；多聚谷氨酰胺病(萎縮蛋白-l、失調(diào)癥蛋白)；朊病毒病(朊病毒蛋白)；牛海綿樣腦病(BSE)(朊病毒蛋白)；肌萎縮性側(cè)索硬化(超氧化物岐化酶)；亞歷山大病(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)；原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病(免疫球蛋白輕鏈或其片斷)；繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病(血清淀粉樣蛋白A的片斷)；老年系統(tǒng)性淀粉樣變性病(轉(zhuǎn)曱狀腺素蛋白及其片斷)；老年淀粉樣變性病(脫輔基脂蛋白A-II);眼病白內(nèi)障(晶狀體蛋白、纖維)；色素性視網(wǎng)膜炎(視紫質(zhì))；黃斑變性(P淀粉樣蛋白、晶狀體蛋白)；和其他疾病胰島淀粉樣蛋白(胰島素)；髓狀曱狀腺瘤(降4丐素)；遺傳性腎淀粉樣變性病(纖維蛋白原)；血液透析相關(guān)的淀粉樣變性病(p2-微球蛋白)；索蛋白相關(guān)的心肌病(索蛋白)；腓骨肌萎縮病(PMP-22);尿崩癥(水通道蛋白)；尿崩癥(血管加壓素受體)；腓骨肌萎縮病(連接蛋白32);嚢性纖維病(CFTR)。參見，例^口Sanders,口Myers,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct"33:25-51,2004。在一個實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide含有aB晶狀體蛋白片斷或者由aB晶狀體蛋白片斷組成。在另外一個實施方案中，本發(fā)明的Intdlipeptide含有肽或者由肽組成，所述肽與從aB晶狀體蛋白鑒定出的親本組肽序列在結(jié)構(gòu)和功能上類似，包括(但不限于)附圖6、7、8、9、10及11和表4所提供的肽。本發(fā)明證明，親本組肽以及親本組肽序列的肽類似物和擬肽干擾了錯折疊或未折疊亞基之間的相互作用，從而抑制了蛋白聚集物的形成。另外，Intellipeptide通過提供有益于重新折疊的保護性環(huán)境而穩(wěn)定錯折疊或未折疊中間體。在某些實施方案中，Intellipeptide包括肽類似物和擬肽。事實上，Intellipeptide包括具有多種不同修飾中任意修飾的肽，包括本文公開的那些。Lntellipeptides類似物一般通過先導肽的化學修飾來設計和生成，所述先導肽包括例如本文描述的任意具體肽，如下述任意序列i)EKDRFSVNLDVKHFS;ii)DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ;iii)LTITSSLSDGVLTVNGPRK;iv)STSLSPFYLRPPSFLRAP;v)SLSPFYLRPPSFLRAPS;vi)GPERTIPITREEK;vii)PERTIPITREEK;viii)HGKHEERQDE;ix)HGFISREFHRKYR;或者這些序列的功能性變異體或擬肽。提供了具有分子伴侶活性的aB晶狀體蛋白的示例性多肽片斷，例25如N-末端結(jié)構(gòu)域多肽片斷為9WIRRPFFPFHSP20或43SLSPFYLRPPSFLRAP58,a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域多肽片斷為75FSVNLDVK82(J33)、113FISREFHR120、131LTITSSLS138(卩8)、141GVLTVNGP148(卩9)、73DRFSVNLDVKHFS85或131LTITSSLSDGV41,C末端結(jié)構(gòu)域多肽片斷為157RTIPITRE164,或者是它們的功能性變異體。本發(fā)明清楚確定，完整形式的這些肽以及通過修飾組成性氨基酸的任意側(cè)鏈所生成的衍生物有能力來防止蛋白質(zhì)聚集、正確折疊并穩(wěn)定蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括長度最多約50個氨基酸的多肽，包括本文描述的氨基S臾序列以及這些序列的功能性變異體或擬肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide包括N末端修飾和C末端修飾。N末端乙?；蛎摪辟x予了防止在酰胺存在時多種氨基肽酶對肽的消化作用，或者，C末端羧基的乙醇取代防止幾種羧肽酶的分解作用，所述羧肽酶包括羧肽酶A和B。在另一實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide包括側(cè)鏈修飾。非天然氨基酸的存在通常會增加肽的穩(wěn)定性。另外，這些氨基酸的至少一種(a氨基異丁酸或Aib)賦予模型肽以重要的限制，降低了它們的構(gòu)象靈活度。因此，Aib的引入有望同時提高肽的穩(wěn)定性和抑制活性。在另一實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide包括a碳的修飾。為提高肽穩(wěn)定性而最常使用的a碳修飾是a-曱基化。另外，與Phe、Val或Leu的a碳相連的氳原子的取代有助于采用(3-彎曲構(gòu)象，這不利于(3-折疊結(jié)構(gòu)的形成。根據(jù)本發(fā)明，抑制劑肽中這些殘基的曱基化有望提高其穩(wěn)定性和效價。在另一實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide包括手性改變。天然的L型基團被D型對映體所取代，顯著提高了其對蛋白質(zhì)水解作用的抵抗力。含有D型對映體的聚集抑制劑在防止聚集方面與聚集抑制親本肽的L型對映體一樣有效。在另一實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide是環(huán)肽。構(gòu)象限制的環(huán)肽較線性肽是更好的候選藥物，因為環(huán)肽的構(gòu)象靈活度降低且對肽鏈端解酶基，通過二硫4定的形成來實現(xiàn)環(huán)化；另一種策略是側(cè)鏈連接，涉及樹脂結(jié)合的頭-尾環(huán)化。為避免肽序列的修飾，則使用后一種方法。聚集抑制肽含有促進大環(huán)化的理想序列，這是因為脯氨酸具有提高翻轉(zhuǎn)和環(huán)化的能力而是許多天然存在或人工合成的環(huán)肽的組成成分。在另一實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide是假肽。假肽或酰胺鍵替代物指在一些(或全部)肽鍵上具有化學修飾的肽。酰胺lt替代物的引入不但減少肽的降解，而且還可以明顯改變肽的一些生化性質(zhì)，特別是構(gòu)象靈活度和疏水性。構(gòu)象靈活度的提高可能有益于使抑制劑對接至結(jié)合位點。另一方面，由于聚集傾向蛋白和抑制劑之間的相互作用似乎很大程度上依賴于疏水性相互作用，提高疏水性的酰胺鍵取代可提高親和力，從而提高抑制劑的效價。另外，提高的疏水性還能提高肽的跨膜轉(zhuǎn)運，從而改善屏障通透性(血-腦屏障和腸屏障)。要取代的酰胺鍵有位于肽末端的酰胺鍵，目的是防止胞外蛋白酶的降解；每個脯氨酸后的酰胺鍵，因為該氨基酸殘基之后具有脯氨酰內(nèi)肽酶的常見內(nèi)肽酶切割位點?？梢赃\用蛋白質(zhì)工程來改善或改變本發(fā)明多肽的特性?？梢允褂帽绢I域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)來生成新型的含有單個或多個氨基酸取代、缺失、添加的突變蛋白或融合蛋白。這些經(jīng)修飾的多肽能夠表現(xiàn)出例如提高的或降低的生物學活性，或者提高的或降低的穩(wěn)定性。另外，它們能夠以較高的產(chǎn)量被純化，并表現(xiàn)出比相應的天然多肽更好的溶解性，至少是在某些純化和貯存條件下是這樣。而且，本發(fā)明的多肽能被制成多聚體，包括二聚體、三聚體和四聚體。可以通過交聯(lián)劑或異源多肽重組來促進多聚化，所述異源多肽如Fc區(qū)?，F(xiàn)有技術(shù)已知，可以從N末端或C末端缺失一個或多個氨基酸而沒有生物學的顯著功能損失。參見，例如Ron等人，BiolChem.,268:2984-2988,1993。相應地，本發(fā)明提供了氨基端有一個或多個氨基酸殘基缺失的多肽。同樣，已知有許多具有生物學功能的C末端缺失的變異體的例子(參見，例如Dobeli等人，1988)。相應地，本發(fā)明提供了羧基端有一個或多個氨基酸殘基缺失的多肽。本發(fā)明還提供了如下文所述的同時在氨基端和羧基端具有一個或多個氨基酸殘基缺失的多肽。除了上述討論的N末端和C末端缺失的蛋白質(zhì)形式，本發(fā)明還包括其他變異體。因此，本發(fā)明還包括具有顯著的分子伴侶多肽活性的多肽變異體。所述變異體包括根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的一般原則所選取的缺失、插入、倒置、重復和取代，這些突變對多肽活性幾乎沒有影響。有兩種主要的方法用于研究要改變的氨基酸序列的耐受性。參見，Bowie等人，5We"^，247:1306-1310,1994。第一種方法依靠進化過程，其中通過自然選擇而接受或者拒絕突變。第二種方法利用基因工程，在克隆化基因的特定位點引入氨基酸改變，然后利用選擇或篩選來識別保持功能的序列。這些研究已經(jīng)揭示，蛋白質(zhì)對氨基酸取代有驚人的耐受性。一般被視為保守性取代的有脂肪族氨基酸殘基Ala、Val、Leu和Phe的一對一取代；羥基氨基酸殘基Ser和Thr的互換，酸性氨基酸殘基Asp和Ghi的交換，酰胺氨基酸殘基Asn和Gin之間的取代，堿性氨基酸殘基Lys和Arg的交換，以及芳香族氨基酸殘基Phe和Tyr的取代。因此，本發(fā)明的多肽可以是，例如(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選為保守性氨基酸殘基)所取代的多肽，所述被取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基含有取代基的多肽；或(iii)其中的PEDF-R多肽與另一化合物融合的多肽，所述另一化合物如增加多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇；或(iv)其中另外的氨基酸與上述類型多肽相融合的多肽，如IgGFc融合區(qū)肽或先導序列或分泌序列或用來純化上述類型多肽的序列或前蛋白序列。因此，本發(fā)明的多肽可以包括通過天然突變或人工處理所獲得的一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加。如所指明的，變化優(yōu)選是較小的，如那些不顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守性氨基酸取代。下述幾組氨基酸表示等價交換(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;(4)Lys、Arg、His;(5)Phe、Tyr、Trp、His。另外，本發(fā)明多肽可以包括一個或多個模擬修飾氨基酸的氨基酸取代。這類取代的例子包括使用荷負電的氨基酸(如門冬氨酸或谷氨酸)來取代那些能夠被磷酸化的氨基酸(如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)，所述荷負電的氨基酸類似于磷酸化氨基酸的負電荷。本發(fā)明還可以包括使用帶有大量疏水性側(cè)鏈的氨基酸(如色氨酸或苯丙氨酸)來取代那些能夠被疏水基團修飾的氨基酸(如精氨酸)。因此，本發(fā)明的具體實施方案包括分子伴侶多肽，所述分子伴侶多肽含有一個或多個模擬修飾氨基酸的氨基酸取代，取代發(fā)生在多肽中能夠被修^飾的氨基酸正常所處的位點。本發(fā)明還包括其中可修飾氨基酸的任何亞型被取代的分子伴侶多肽。例如，含有3個絲氨酸殘基的分子伴侶多肽可以在任意一個、兩個或全部三個所述絲氨酸上被取代。而且，任何能夠被修飾的分子伴侶多肽氨基酸可以不被模擬修飾的氨基酸所取代。本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的片斷。更具體地，本發(fā)明包括經(jīng)純化、分離及重組的多肽，含有至少長度為6-504(或者如果多肽氨基酸殘基的長度小于1000時，多肽氨基酸殘基長度減去1)之間任意整數(shù)的連續(xù)氨基酸殘基片斷。優(yōu)選地，片斷長度至少為6，優(yōu)選為至少8-10,更優(yōu)選為12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、360或者本發(fā)明多肽的更多的連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還排除了根據(jù)5'和3'位點來確定的任何種類的本發(fā)明多肽片斷或者如上所述的根據(jù)氨基酸數(shù)目來確定的多肽亞類。如上所述，任何通過5'和3'位點或氨基酸數(shù)目來確定的片斷數(shù)目都可以被排除。另外，應該理解，在某些實施方案中，本發(fā)明的Intellipeptide包括兩種或更多種修飾，包括(但不限于)本文所述的那些修飾?？紤]到上市的或正處于研發(fā)中的肽類藥物的特點，顯然，大部分成功穩(wěn)定防止蛋白質(zhì)水解的肽包括上述幾種修飾類型的混合形式。這一結(jié)論是可以理解的，因為肽的降解涉及許多不同的酶。本發(fā)明包括Intellip印tide文庫。所述文庫包括肽文庫以及能夠表達Intellipeptide的核酸構(gòu)建文庫。在一個實施方案中，本發(fā)明的文庫由下述相關(guān)序列組成i)EKDRFSVNLDVKHFS;ii)DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ;iii)LTITSSLSDGVLTVNGPRK;iv)STSLSPFYLRPPSFLRAP;v)SLSPFYLRPPSFLRAPS;vi)GPERTIPITREEK;vii)PERTIPITREEK;viii)HGKHEERQDE;ix)HGFISREFHRKYR;或者它們的功能性衍生物或29模擬物。在一個具體實施方案中，本發(fā)明文庫由兩種或更多種Intellipeptide或其編碼序列組成，包括例如圖6、7、8、9、10及11以及表4中提供的序列。肽、肽變異體和擬肽本發(fā)明提供了分離或重組的多肽，或由本發(fā)明核酸編碼的多肽，其中所述分離或重組的多肽含有的氨基酸序列與(xB晶狀體蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域、a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域或C末端結(jié)構(gòu)域的多肽片斷在至少約10、50、100、150或200或更多的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域范圍內(nèi)具有至少95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同源性，。本發(fā)明的一個方面中，所述多肽含有(xB晶狀體蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域、a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域或C末端結(jié)構(gòu)域的多肽片斷所具有的序列。本發(fā)明提供了通過施用aB晶狀體蛋白的多肽片斷例如本發(fā)明的多肽來抑制哺乳動物受治療者蛋白質(zhì)聚集的方法。本發(fā)明還提供了通過篩選aB晶狀體蛋白的多肽片斷例如本發(fā)明的多肽來篩選具有分子伴侶活性或抑制蛋白聚集的組合物的方法。本發(fā)明的一個方面中，提供了aB晶狀體蛋白的多肽片斷(以及編碼這些多肽片斷的核酸)，其中aB晶狀體蛋白的多肽片斷中的一個、一些或全部氨基酸含有取代氨基酸的取代。在本發(fā)明的一個方面中，提供了用來提高具有分子伴侶活性的aB晶狀體蛋白的多肽片斷與未折疊蛋白、變性蛋白或天然構(gòu)象蛋白之間相互作用的方法。本發(fā)明的肽和多肽可以在施用上述核酸之后在體內(nèi)重組表達，或者例如作為藥物組合物被直接施用。它們可以被體外或體內(nèi)表達，來篩選具有分子伴侶活性的aB晶狀體蛋白的多肽片斷以及能改善疾病(如蛋白質(zhì)聚集疾病、年齡相關(guān)肌病或心臟局部缺血)的因子。本發(fā)明多肽和肽可以從天然來源的、合成的或重組生成的多肽中分離。肽和蛋白質(zhì)可以在體外或體內(nèi)被重組表達?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法來制備和分離本發(fā)明的肽和多肽。還可以使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的化學方法來全部或部分合成本發(fā)明多肽和肽。參見，例如，Caruthers,NucleicAcidsRes.Symp.Ser.215-223,1980;Horn,NucleicAcidsRes,Symp.Ser.225-232，1980;Banga,TherapeuticPeptidesandProteins,Formulation,ProcessingandDeliverySystemsTechnomicPublishingCo.,Lancaster,PA,1995。例如，可以使用各種固相法來進行肽合成(參見，例如，Roberge,Science269:202，1995;Merrifield,MethodsEnzymol.289:3-13，1997),并可以例如按照生產(chǎn)商提供的說明書使用ABI431A肽合成儀(PerkinElmer)實現(xiàn)自動化合成。如上所述的本發(fā)明肽和多肽包括全部的"模擬物"和"擬肽"形式。術(shù)語，莫擬物"和"擬肽"指合成的化合物，其具有與本發(fā)明多肽基本相同的結(jié)構(gòu)和/或功能特性。模擬物可以完全由合成的非天然的氨基酸類似物所構(gòu)成，或者是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。模擬物中還可以摻入任何量的天然氨基酸保守取代，只要這些取代沒有實質(zhì)上改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性。當使用那些為保守性變異體的本發(fā)明多肽時，常規(guī)實驗會確定模擬物是否在本發(fā)明范圍之內(nèi)，即其結(jié)構(gòu)和/或功能沒有實質(zhì)上的改變。因此，當模擬組合物被施用于細胞或在細胞中表達時，則該模擬組合物包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)，如具有分子伴倡活性的oiB晶狀體蛋白的多肽片斷。如果模擬組合物在細胞或患有蛋白質(zhì)聚集疾病的哺乳動物受治療者中激發(fā)了分子伴侶活性，則該模擬組合物也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。圖4顯示了阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)中的淀粉樣變性以及使用Intellipeptide的可能介入的示意圖。淀粉樣蛋白原纖維和斑塊是AD神經(jīng)病理學的標志，而Lewy小體是PD的神經(jīng)病理學特征。在AD中，淀粉樣蛋白源性A-P肽聚集而形成A-P斑。Intellipeptide結(jié)合(3淀粉樣蛋白、防止細胞毒性淀粉樣蛋白斑的聚集和形成而防止AD。在PD中，a-核突觸蛋白聚集形成Lewy小體。Intellipeptide結(jié)合a-核突觸蛋白、防止Lewy小體的聚集和形成而防止PD。圖5顯示了一種設計多肽模擬物的方法，所述方法利用靜電表面分子模型來設計具有多肽特征的合成分子。利用分子建模可以構(gòu)建目標肽的氨基酸圖譜。根據(jù)氨基酸圖譜可計算肽周圍的靜電表面。從靜電表面圖譜上移除氨基酸圖譜，可以利用靜電表面來設計與多肽具有相同形狀、大小和電荷特征的合成分子。抑制異常蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)未折疊、蛋白質(zhì)錯折疊或蛋白質(zhì)聚集的Intellipeptide或肽包括(-f旦不限于)Intellipeptide序列SLSPFYLRPPSFLRAPS、EKDRFSVNLDVKHFS、HGFISREFHRKYR、DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ和PERTIPITREEK。圖6總結(jié)了Intellipeptide序歹'JSLSPFYLRPPSFLRAPS、EKDRFSVNLDVKHFS、HGFISREFHRKYR、DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ和PERTIPITREEK的功能性變異體和擬肽。圖7顯示了乂人Intellipeptide序列SLSPFYLRPPSFLRAPS衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖8顯示了從Intellipeptide序列EKDRFSVNLDVKHFS衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖9顯示了從Intellipeptide序列HGFISREFHRKYR衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖lO顯示了從Intellipeptide序列DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ衍生的一系列肽的氨基酸序列。圖11顯示了從Intellipeptide序列PERTIPITREEK衍生的一系列肽的氨基酸序列。模擬多肽組合物可以包括任意組合的非天然結(jié)構(gòu)組分，一般來自三組結(jié)構(gòu)a)除天然的酰胺鍵(肽鍵)連接以外的殘基連接基團；b)非天然的氨基酸殘基取代天然存在的氨基酸殘基；或c)誘導二級結(jié)構(gòu)模擬物即誘導或穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)如(3轉(zhuǎn)角、y轉(zhuǎn)角、(3折疊、a螺旋構(gòu)象等的殘基。例如，當多肽的全部或一些殘基以化學手段而非天然肽鍵連接時，則它具有模擬物的特征。單個的擬肽殘基可以通過肽鍵、其他化學鍵或聯(lián)結(jié)方式相連接，如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、N,N'-二環(huán)己基石友二亞胺(DCC)或N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)?？梢蕴娲鷤鹘y(tǒng)酰胺鍵(肽鍵)的連接基團包括，例如南五味子酮(如-C(K))-CH2-取代-C(O)-NH-)、氨基曱烯基(CH2-NH)、乙烯、烯烴(CHK:H)、醚(CHz-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CNr)、三唑、反酰胺(retroamide)、石危酰胺或酯(參見，例如Spatola(1983)inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357,"PeptideBackboneModifications,"MarcellDekker,NY)。多肽還可以通過含有全部或一些取代天然存在的氨基酸殘基的非天然氨基酸殘基而具有模擬物的特征。非天然氨基酸殘基在科學和專利文獻中有適當?shù)拿枋?，下文描述了作為天然氨基酸殘基模擬物的幾個示例性非天然組合物以及一些指導原則。芳香族氨基酸的模擬物可以通過被下述基團所取代而產(chǎn)生例如，D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯甘氨酸；D-或L-2噻吩丙氨酸；D-或L-1、-2,3-、或4-芘丙氨酸；D-或L-3噻吩丙氨酸；D-或L-(2-吡咬)-丙氨酸；D-或L-(3-吡咬)-丙氨酸；D-或L-(2-吡溱)-丙氨酸；D-或L-(4-異丙基)-苯甘氨S吏；D-(三氟曱基)-苯甘氨酸；D-(三氟曱基)-苯丙氨酸；D-對-氟-苯丙氨酸；D-或L-對-聯(lián)苯苯丙氨酸；K-或L-對-曱氧基-聯(lián)苯苯丙氨酸；D-或L-2-巧l哚(烷基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的曱基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、仲異基(sec-isotyl)、異戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香環(huán)包括噻唑、p塞吩、吡唑、苯并咪唑、萘、呋喃、吡咯和吡啶。氨基酸模擬物的生成可以通過被下述基團所取代例如，保持負電荷的非羧化氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化的蘇氨酸。羧基側(cè)鏈基團(如天冬氨?；蚬劝滨；?也可以通過與碳化二亞胺(R'-N-C-N-R')的反應而被選擇性修飾，所述碳化二亞胺如1-環(huán)己基-3(2-嗎啉-基-(4-乙基)碳化二亞胺或l-乙基-3(4-氮-4,4-二甲醇戊基)碳化二亞胺。天冬氨?；蚬劝滨；€可以通過與銨離子的反應而被插入天冬酰胺和谷氨酰氨殘基中。除了賴氨酸和精氨酸外，還可以使用鳥氨酸、瓜氨酸或(、adioimmu)-乙酸或(、adioimmu)烷基乙S交取代來生成堿性氨基酸模擬物，其中所述烷基如上文所定義。腈衍生物(如CN-基團取代COOH)能夠被取代為'adioimmimo或谷氨酰胺。天冬酰胺殘基和谷氨酰胺殘基可以被脫氨生成相應的天冬氨酰或谷氨酰殘基。精氨酸殘基模擬物的生成可以通過將精氨?；c一種或多種常規(guī)試劑反應，包括，例如苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環(huán)己烷二酮或茚三酮，優(yōu)選在堿性條件下反應。酪氨酸殘基模擬物的生成可以通過將酪氨?；c芳香族重氮化合物或四硝基曱烷反應。N-乙酰咪唑(N-acetylimidizol)和四硝基甲烷可以分別用來形成O-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。半胱氨酸殘基模擬物的生成可以通過將半胱氨酸殘基與例如a-卣代乙S吏(如2_氯乙酸)或氯乙酰胺以及相應的胺類反應，來生成羧曱基或羧氨甲基衍生物。半胱氨酸殘基模擬物的生成還可以通過將半胱氨酸殘基與下述物質(zhì)反應例如，溴-三氟丙酮、a-溴-p-(5-咪唑)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物；曱基2-吡啶二硫化物；對-氯汞苯甲酸；2-氯汞基4硝基酚；或氯-7-硝基苯并-氧雜-l，3-二唑。賴氨酸模擬物的生成(以及氨基末端殘基的改變)可以通過將賴氨酸殘基與例如琥珀酸或其他羧酸酸酐反應。賴氨酸和其他含有a-氨基的殘基模擬物還可以通過與亞氨酸酯的反應以及與乙醛酸的轉(zhuǎn)酰胺基酶催化反應來生成，所述亞氨酸酯如甲基吡啶亞氨酸(methylpicolinimidate)、磷酸吡噴醛、吡噴醛、氯代硼氳化物、三硝基苯磺酸、鄰-曱基異脲、2，4-戊二酮。蛋氨酸模擬物可以通過與蛋氨酸亞砜的反應來生成。、adioim模擬物包括，例如六氳哌咬羧酸、噻唑烷羧酸、3-或4-羥基、adioim、脫氬脯氨酸、3-或4-曱基脯氨酸或3,3-二曱基脯氨酸。組氨酸殘基模擬物的生成可以通過將組氨?；c二乙基焦碳酸酯或?qū)?溴代苯甲酰甲基溴反應。其他模擬物包括由下述途徑生成的模擬物例如，、adioim和賴氨酸的羥基化；絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基的磷酸化；賴氨酸、精氨酸和組氨酸的a-氨基的曱基化；N末端氨基的乙?；?；主鏈酰胺殘基的曱基化或者被N甲基氨基酸所取代；或C末端羧基的酰胺化。本發(fā)明多肽的組分還可以被氨基酸(或擬肽殘基)的手性對映體所:f又代。因此，任何天然存在的L構(gòu)型氨基酸(還可以稱為R或S構(gòu)型，這取決于化學個體的結(jié)構(gòu))可以被手性對映體的化學結(jié)構(gòu)相同的或擬肽的氨基酸(被稱為D型氨基酸，但也可以被稱為R或S型)所取代。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明示例性多肽"實質(zhì)上相同，，的多肽。"實質(zhì)上相同"的氨基酸序列與參照序列之間的區(qū)別在于一個或多個保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入，特別是發(fā)生在分子的非活性位點的取代，條件是多肽基本上保持其功能特性。保守性氨基酸取代，例如用一個氨基酸取代另一個同類氨基酸(例如，用一個疏水性氨基酸(如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一個疏水性氨基酸；或者用一個極性氨基酸取代另一個極性氨基酸，如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代門冬氨酸，或谷氨酰胺取代、adioimmuno)。一個或多個氨基酸可以缺失，例如，從本發(fā)明的具有分子伴侶活性的ocB晶狀體蛋白多肽中缺失，形成多肽的結(jié)構(gòu)34》務飾，而沒有顯著改變其生物學活性。例如，可以缺失對(XB晶狀體蛋白的分子伴侶活性而言不需要的氨基或羧基末端或中間的氨基酸。本領域技術(shù)人員會認可，可以使用多種操作和方法來合成摻入這些模擬物的各合成的殘基和多肽，而這些操作和方法在科學和專利文獻中有詳纟田i兌明(嗩口,OrganicSynthesesCollectiveVolumes,Gilman,等人.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NY.)。還可以使用組合方法來合成本發(fā)明的肽和擬肽。用來生成肽和擬肽文庫的各種才支術(shù)是已知的，包括，例如多中心(multipin)、茶葉袋(teabag)和裂解-偶聯(lián)-混合(split-couple-mix)技術(shù)(參見，例如al-Obeidi,Mol.Biotechnol.9:205-223，1998;Hruby，Curr.Opin.Chem.Biol.1:114-119,1997;Ostergaard，Mol.Divers.3:17-27，1997;Ostresh,MethodsEnzymol.267:220-234,1996)。本發(fā)明的修飾肽還可以通過化學修飾法來生成(例如參見Belousov,NucleicAcidsRes.25:3440-3444,1997;Frenkel，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.19:373-380,1995;Blommers,Biochemistry33:7886-7896,1994)。本發(fā)明的肽和多肽還可以被合成并表達為連接有一個或多個其他結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，例如形成一種免疫原性較強的肽，目的是更容易分離重組合成的肽、識別并分離抗體和表達抗體的B細胞等。有助于4企測和純化的結(jié)構(gòu)域包括例如金屬鰲合肽，如多組氨酸束和組氨酸-色氨酸組件，其允許于固定化的金屬上的純化；蛋白A結(jié)構(gòu)域，其允許于固定化的免疫球蛋白上的純化；FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(AmgenCorp,Seattle,WA)中使用的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu)域和包含基序的肽或多肽之間加入可切割的連接序列如凝血因子Xa或腸激酶(Invitrogen,SanDiego,CA)來促進純化。例如，表達載體可以包括編碼表位的核酸序列，與6個組氨酸殘基相連，隨后有硫氧還蛋白和腸激酶切割位點(參見，例如Williams,Biochemistry34:1787-1797,1995;Dobeli,ProteinExpr.Purif.12:404-14,1998)。組氨酸殘基有助于檢測和純化，而腸激酶切割位點提供了從融合蛋白的其余部位純化表位的方法。有關(guān)載體編碼的融合蛋白及其應用的技術(shù)在科學和專利文獻中有很好的描述(參見，例如Kroll,D濕Ce〃.脂，12:441-53,1993)。本文使用的術(shù)語"分離的"指從物質(zhì)從其初始環(huán)境(例如，如果是天然存在的則為天然環(huán)境)中被分離出來。例如，活體動物體內(nèi)天然存在的多核苷酸或多肽不是"分離的"，而從天然體系中的一些或全部共存物質(zhì)中分離出來的同樣的多核苷酸或多肽是"分離的"。這些多核苷酸可以是載體的部分和/或這些多核苷酸或多肽可以是組合物的部分，但它們依然是"分離的"，因為這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的部分。本文使用的分離的物質(zhì)或組合物也可以是"純化的"組合物，即，它并不要求絕對純，而是一個相對的定義。從文庫中獲得的各核苷酸能夠被常規(guī)純化到電泳純。另一方面，本發(fā)明提供了從基因組DNA或者從文庫或其他環(huán)境中的其他序列中純化的核酸，數(shù)量級至少為1、2、3、4、5或更高。具有分子伴侶活性的Intellipeptide類似物、aB晶狀體蛋白的多肽片斷一般通過先導肽的化學修飾來設計和生成，先導肽例如本文描述的任意具體肽，如下述任意序列i)EKDRFSVNLDVKHFS;ii)DPLTITSSLSSDGVLTVNGPRKQ;iii)LTITSSLSDGVLTVNGPRK;iv)STSLSPFYLRPPSFLRAP;v)SLSPFYLRPPSFLRAPS;vi)GPERTIPITREEK;vii)PERTIPITREEK;viii)HGKHEERQDE;ix)HGFISREFHRKYR;或者這些序列的功能性變異體或擬肽。提供了具有分子伴侶活性的aB晶狀體蛋白的示例性多肽片斷，如N-末端結(jié)構(gòu)域多肽片斷為9WIRRPFFPFHSP2o或43SLSPFYLRPPSFLRAP58，a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域多肽片斷為75FSVNLDVK82((33)、113FISREFHR120、13ILTITSSLS138(卩8)、141GVLTVNGP148(卩9)、73DRFSVNLDVKHFSs5或131LTITSSLSDGV14i,C末端結(jié)構(gòu)域多肽片斷為157RTIPITRE164,或者是它們的功能性變異體。術(shù)語"相同的"或"同一性"百分比在兩個或多個核酸或多肽序列的上下文中，是指兩個或多個序列或亞序列相同或者具有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同(即，在比對窗口或指定區(qū)域內(nèi)比較和比對最大一致性時，在特定區(qū)域(如編碼本文所述抗體的核苷酸序列或本文所述抗體的氨基酸序列)約有60%的同一性，優(yōu)選為65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)，檢測使用了BLAST或BLAST2.0序列比對算法，缺省參數(shù)下文有述，或者使用手工比對和目測。這些序列被稱為"實質(zhì)上相同的"。這一術(shù)語還指(或者能被應用于)測試序列的依從性。該術(shù)語還包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下文所述，優(yōu)選的算法可以算入缺口等。優(yōu)選地，同一性存在于長度至少約為25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)，或者更優(yōu)選地存在于長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域內(nèi)。在序列比較中，通常一個序列作為參照序列，測試序列與之比較。當使用序列比對算法時，測試序列和參照序列被輸入計算機，并指定序列運算程序參數(shù)，如果需要則要指定序列坐標。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)，或者可以指定其他參數(shù)。然后，在程序參數(shù)的基礎上，序列比對算法計算測試序列相對于參照序列的序列同一性百分比。本文使用的"比對窗口"指下述任一連續(xù)位點的區(qū)段20-60、通常約為50至約200、更通常約為100至約150,區(qū)段中的序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位點的參照序列先經(jīng)過最佳比對，然后進行比較。用于比較的序列比對方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的?？梢酝ㄟ^下述方法進行最佳序列比對，如局部同一性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981);同一性比對算法(Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443，1970);尋求相似性方法(Pearson&Lipman，Proc.Nafl.Acad.Sci.USA85:2444,1988);這些算法的計算機實現(xiàn)(GAP,BESTFIT,FASTA,andTFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI);或者人工比對和目測(參見，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人.,eds.1995supplement)。尋求比對的程序是現(xiàn)有技術(shù)已知的，如BLAST等。例如，如果目標序列是人的，則這種氨基^列或基因序列(種系或重排的抗體序列)可以在任何合適的標準數(shù)據(jù)庫中找到，如Genbank，美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:〃ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/);VBASE,人類j元體基因凄t才居庫(http:〃www.mrc畫cpe.cam.ac.uk/imt-doc);Kabat,免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫Qittp:〃www.immuno.bme.n濯.edu);或者它們的翻譯產(chǎn)物。如果比對是基于核苷酸序列來進行的，那么應該分析所選擇的基因來確定那些亞類基因中哪些基因具有與原始抗體最接近的氨基酸同一性。本發(fā)明考他序列相比達到較高程度同一性的氨基酸序列或基因序列能夠根據(jù)本文描述的程序而被利用或者操作。另外，當根據(jù)本文描述的程序進行操作或篩選時，如果那些具有較低同一性的氨基酸序列或基因編碼的產(chǎn)物對預定耙抗原具有特異性，那么它們能夠被利用。在某些實施方案中，可接受的同一性范圍高于約50%。應該理解，目標種系可以不是人類。適合用來測定序列同一性或相似性百分比的優(yōu)選的算法實例為BLAST和BLAST2.0算法，分別在下述文獻中有所描述Altschul等人,Jc油L25:3389-3402，1977和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990。采用本文描述的參數(shù)，使用BLAST和BLAST2.0來測定本發(fā)明的核苦酸和蛋白質(zhì)的序列同一性百分比。進行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。這種算法涉及首先通過在查詢序列中識別長度W的短代碼來識別高得分序列對(HSP),當所述短代碼與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的代碼比對時，符合或滿足一些取正值的閾值分數(shù)T。T指相鄰代碼的分數(shù)閾值。這些初始的鄰近代碼采樣數(shù)作為種子來啟動^^索，以發(fā)現(xiàn)較長的含有這些代碼的HSP。代碼采樣數(shù)沿每個序列向兩個方向延伸，至累積的比對分數(shù)被增加。對于核苷酸序列，累積分數(shù)的計算使用參數(shù)M(對每對匹配殘基的加分，始終>0)和N(對錯配殘基的罰分，始終<0)。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累積分數(shù)。在下述情況下，代碼采樣數(shù)在每個方向的延伸被停止累積比對分數(shù)從達到的最大值下降了X;由于一個或多個負得分殘基比對的累積，累積分數(shù)達到0或以下；或到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。對于核苷酸序列，BLASTN程序使用的缺省參數(shù)值代碼長度(W)為11,期望值(E)為10，M=5,N=_4,雙鏈比對。對于氨基酸序列，BLASTN程序使用的缺省參數(shù)值代碼長度(W)為3,預期(E)為10;BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,1989)比對(B)為50,期望值(E)為10,M=5,N=-4，雙鏈比對。在本文可互換使用的"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"指氨基酸殘基的聚合體。這些術(shù)語應用于氨基酸聚合體，其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，這些術(shù)語還應用于天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。"多肽"和"蛋白質(zhì)"還指通過肽鍵或修飾的肽鍵(即肽同電子排列體)相互連接的氨基酸，可以含有除20個基因編碼氨基酸以外的經(jīng)修飾的氨基酸。術(shù)語"多肽"還包括肽和多肽片斷、基序等。該術(shù)語還包括糖基化的多肽。本發(fā)明的肽和多肽還包括如下文進一步詳述的所有"模擬物"和"擬肽"形式。"氨基酸"或多肽的"功能性變異體或模擬物"指天然存在的及合成的氨基酸，以及以類似天然存在的氨基酸的方式行使功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼所編碼的氨基酸以及經(jīng)過后修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基g吏類似物指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學結(jié)構(gòu)(即與氳相連的a碳原子、羧基、氨基和R基團)的化合物，如高絲氨酸、原亮氨酸、蛋氨酸亞砜、锍曱基蛋氨酸。這些類似物具有修飾的R基團(如原亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)上不同于氨基酸的一般化學結(jié)構(gòu)的化合物，但行使功能的方式與天然存在的氨基酸類似。本文中，氨基酸可以通過公知的三字母符號或者通過IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可以通過普遍接受的單字母符號來表示。"保守修飾的變異體"或"變異體"既指氨基酸序列也指核苷酸序列。就特定核S拼列而言，保守修飾的變異體指那些編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核芬酸，或者當核酸沒有編碼氨基酸序列時，指基本相同的核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能上相同的核酸編碼某一給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在每一編碼丙氨酸的密碼子的位置，都可以改變?yōu)樗鋈魏蜗鄳拿艽a子，而不改變所編碼的多肽。這種核苷酸變異是"沉默變異"，是一種保守修飾的變異。本文描述的編碼多肽的每一個核苷酸序列還描述了每一個可能的核苷酸沉默變異。本領域技術(shù)人員會理解，核酸中的每個密碼子(除了AUG和TGG,常規(guī)上，AUG是蛋氨酸的唯一密碼子，TGG是色氨酸的唯一密碼子)都能^皮修飾而生成一種功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默變異隱含在表達產(chǎn)物來的每個所述序列中，但未隱含在實際的探針序列中。對于氨基酸序列，本領域技術(shù)人員能理解，對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的各取代、缺失或添加(即在所編碼的序列中改變、添加或缺失了單個氨基酸或少量氨基酸)是"保守修飾的變異體"，其中，這些變化使氨基酸被化學上類似的氨基酸所取代。提供了功能相似氨基酸的保守性取代表是現(xiàn)有技術(shù)已知的。這類保守修飾的變異體不排除本發(fā)明的多態(tài)變異體、種間類似物和等位基因。下述8組氨基酸，每組內(nèi)的氨基酸相互間可以保守性取代l)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)門冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)門冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M),纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W);7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);8)半胱氨酸(C),蛋氨酸(M)(參見，例如Creighton，Proteins,1984)。如多肽結(jié)構(gòu)的大分子結(jié)構(gòu)可以根據(jù)各種組織層次來進行描述。有關(guān)該組織的一般論述，參見，例如Alberts等人,MolecularBiologyoftheCell(3rded.，1994);Cantor和Schimmel,BiophysicalChemistryPartI:TheConformationofBiologicalMacromolecules，1980。"一級結(jié)構(gòu)"指特定肽的氨基酸序列。"二級結(jié)構(gòu)"指多肽內(nèi)的局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)已知為結(jié)構(gòu)域，如酶結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、膜孔結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是形成緊密單元多肽的組成部分，一般有15-350個氨基酸。示例性結(jié)構(gòu)域包括具有酶活性的結(jié)構(gòu)域，如激酶結(jié)構(gòu)域。典型的結(jié)構(gòu)域由較少組織的部分構(gòu)成，如p-折疊和a-螺旋的伸展。"三級結(jié)構(gòu)，，指多肽單體的完整三維結(jié)構(gòu)。"四級結(jié)構(gòu)，，指獨立的三級結(jié)構(gòu)單元以非共價結(jié)合的方式形成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性已知為能量術(shù)語。具體的核酸序列還隱含"剪接變異體"。同樣，由一種核苷酸編碼的具體蛋白質(zhì)隱含由該核酸的剪接變異體所編碼的任何蛋白質(zhì)。"剪接變異體"如名字所示，是指基因的可選剪接產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，初始核酸轉(zhuǎn)錄子可以被剪接，致使不同的(替換的)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。剪接變異體的生成機制有所不同，但都包括外顯子的可選剪接。"剪接變異體"還包括從同一核酸通讀轉(zhuǎn)錄衍生而來的可選多肽。該術(shù)語包括剪接反應的任何產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn)物的重組形式。這些基因的多肽以及基因產(chǎn)物的功能性變異體在本發(fā)明中是有用的。"功能性變異體"分別指具有核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)，和參照序列是"相同的"、"基本相同的"、"實質(zhì)相同的"、"同源的"或"相似的"(如下所述)，通過非限制性舉例，所述參照序列可以是分離的核酸或蛋白質(zhì)序列，或者通過比對兩個或多個相關(guān)核酸或蛋白質(zhì)或者給定的核酸或蛋白質(zhì)的一組亞型而得到的共有序列。亞型的非限制性舉例包括來自例如可選的RNA剪接或溶蛋白性裂解的分子量不同的亞型；具有不同翻譯后修飾(如糖基化)的亞型；等等。經(jīng)過比對，如果兩個序列完全相同，沒有缺口、取代、插入或缺失等，則這兩個序列被稱為是"相同的"。如果符合下述標準，則兩個序列被稱為是"基本相同的"經(jīng)過比對，兩個序列之間精確相同，沒有缺口、插入或缺失，而只有保守性氨基酸取代。保守性的氨基酸取代如表3所示。表3:保守性氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>如果兩個核苷酸序列編碼相同的或基本相同的氨基酸序列，則這兩個核苷酸序列是"基本相同的"?，F(xiàn)有技術(shù)已知，由于遺傳密碼的性質(zhì)，一些氨基酸由幾個不同的密碼子編碼，因此，這些密碼子可以相互替換而不改變氨基酸序列中相應位置的氨基酸。在遺傳密碼中，TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG編碼Leu;AGA、AGG、CGT、CGC、CGA和CGG編碼Arg;GCT、GCC、GCA和GCG編碼Ala;GGT、GGC、GGA和GGG編碼Gly;ACT、ACC、ACA和ACG編碼Thr;GTT、GTC、GTA和GTG編碼Val;TCT、TCC、TCA和TCG編碼Ser;CCT、CCC、CCA和CCG編碼Pro;ATA、ATC和ATA編碼lie;GAA和GAG編碼Glu;CAA和CAG編碼Gin;GAT和GAC編碼Asp;AAT和AAC編碼Asn;AGT和AGC編碼Ser;TAT和TAC編碼Tyr;TGT和TGC編碼Cys;AAA和AAG編碼Lys;CAT和CAC編碼His;TTT和TTC編碼Phe;TGG編碼Trp;ATG編碼Met;TGA、TAA和TAG是翻譯終止密碼子。經(jīng)過比對，如果兩個序列為下述情況，則這兩個序列是"實質(zhì)上相同的"(i)兩個序列之間的氨基酸殘基同一性小于30%,優(yōu)選<20%,更優(yōu)選<15%，最優(yōu)選<10%;(ii)長度最短的比對序列中發(fā)生缺口、插入、缺失和/或取代的氨基酸殘基數(shù)目<10%，更優(yōu)選<5%，更優(yōu)選<3%,最優(yōu)選<1%。符合下述任一標準的兩個序列被稱為"同源的"。術(shù)語"同源"包括(不限于)直系同源(ortholog,因共有相同的祖先而具有遺傳相似性，其編碼的蛋白質(zhì)在不同種系中具有相同的功能)和旁系同源(paralog,類似于直系同源，但其基因和蛋白質(zhì)相似性是基因復制的結(jié)果)。核苷酸序列同源的一個指標為兩個核酸分子能否在嚴緊條件下雜交。嚴緊條件具有序列依賴性，并隨不同情況而有所不同。通常，選擇的嚴緊條件大約比特定序列在規(guī)定的離子強度和pH下的熱熔點(Tm)低5°C。L是(在規(guī)定離子強度和pH下)50%的耙序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。典型的嚴緊條件為鹽濃度約0.02M，pH7，溫度至少約為60°C。能夠確定兩個序列是否同源的另外一個途徑是使用適當?shù)乃惴▉泶_定是否符合上述對"實質(zhì)上相同的序列"的標準。兩個或多個多聚核苷酸或多肽的序列比較一般使用下述算法進行，如局部同源性算法(Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981);同源性比對算法(Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443，1970);尋求相似性方法(Pearson&Lipman，Proc.Nafl.Acad.Sci.USA85:2444,1988);這些算法的計算機實現(xiàn)(GAP，BESTFIT,FASTA，andTFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackage,version10.2GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison，Wis.);BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990);或者通過目觀寸。使用局部同一性算法(Sm池&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-4891981)，通過插入缺口來使配對數(shù)目最大化，而發(fā)現(xiàn)最佳比對。"缺口"使用Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970的算法來找到增加配對數(shù)并減少缺口數(shù)目的兩個完整序列的比對。在這類算法中，對于每個缺口使用約3.0至約20的罰分，對于終點缺口不使用罰分。同源性蛋白質(zhì)還包括蛋白質(zhì)的直系同源簇(COGs)，它們產(chǎn)生于全基因組所編碼的蛋白質(zhì)的種系發(fā)生分類。至今，通過比較43個全基因組(代表了30個主要的種系發(fā)生譜系)所編碼的蛋白序列，已經(jīng)繪出了COGs。每個COG由各蛋白質(zhì)或來自至少3個語系的旁系同源簇組成，因此對應于一個祖先的保守結(jié)構(gòu)域(參見Tatusov等人，Science,278:631-637,1997;Tatusov等人,NucleicAcidsRes.29:22-28,2001;Chervitz等人，Science282:2022-2028，1998;http:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。兩個序列整體上可以是相互相同的、基本相同的、實質(zhì)上相同的或者同源的；或者這些序列的部分與其他序列類似長度的序列可以是相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的。不論哪種情況，這些序列之間都是相似的。典型地，相似序列內(nèi)的相同或基本相同的序列長度>12個殘基，優(yōu)選>24個殘基，更優(yōu)選>48個殘基，最優(yōu)選>96個殘基。多肽及其功能性變異體"多肽，，包括蛋白質(zhì)、融合蛋白、寡肽和多肽衍生物，除了擬肽在本文被認為是小分子。盡管抗體及其衍生物也是多肽，但將在單獨的章節(jié)進行描述。雖然抗體及抗體衍生物在單獨的章節(jié)進行描述，但根據(jù)本發(fā)明目的，抗體和抗體衍生物被視為多肽及書t生物的亞類。"蛋白質(zhì)，，是具有氨基酸序列的分子，其中氨基酸以肽鍵彼此連接成線性分子。術(shù)語"蛋白質(zhì)"指從天然來源物分離的多肽，或者是利用重組DNA技術(shù)由分離的cDNA生成的多肽，具有的氨基酸序列長度至少為約200個氨基酸。"融合蛋白"是一種重組蛋白質(zhì)，其氨基S菱序列來源于兩種或更多種常規(guī)分離的多肽的氨基酸序列。"蛋白質(zhì)片斷"指較大的多肽的蛋白質(zhì)水解片斷，所述較大的多肽可以是蛋白質(zhì)或融合蛋白。蛋白質(zhì)水解片斷可以通過較大多肽在體內(nèi)或體外的蛋白質(zhì)水解性裂解而制備，一般很大而難以通過化學合成來制備。蛋白質(zhì)水解片斷的氨基酸序列長度為約200至約1000個氨基酸。"寡肽"是具有短氨基酸序列(即，為2至約200個氨基酸)的多肽。寡肽一般通過化學合成來制備。雖然寡肽和蛋白質(zhì)片斷的制備可以采用其他方式，但可以使用重組DNA技術(shù)和/或體外生化處理。例如，可以制備編碼氨基酸序列的核酸，然后以其作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應。在這一反應中，將編碼預選多肽的外源性核酸引入混合物中，混合物基本不含其他外源性核酸，而含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的全部細胞組分。在加入外源性DNA之前或與之一起加入一種或多種放射性標記的氨基酸，然后進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。因為反應混合物中唯一的核酸是^皮加入反應的外源性核酸，所以只生成其編碼的多肽，且其中摻入了放射性標記的氨基酸。在該方法中，由預選外源性核酸編碼的多肽具有放射性標記。盡管反應混合物中含有其他蛋白質(zhì)，但預選的多肽是唯一的在存在放射性氨基酸條件下生成的多肽，因此是唯一被標記的多肽。如下文詳細解釋的，"多肽衍射物"包括(但不限于)多肽變異體、化學修飾的多肽和擬肽。本發(fā)明的多肽，包括類似物和其他修飾變體，通?？梢酝ㄟ^已知技術(shù)來制備。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的合成可以根據(jù)固相合成法。例如，固相合成法及其許多改良方法都4艮好理解，并且是用于多肽制備的常用方法。(參見Merrifield，J.Am.Chem.Soc,85:2149，1964;Stewart和Young,SolidPhasepolypeptideSynthesis,PierceChemicalCompany,Rockford,111.，1984;Bodansky和Bodanszky,ThePracticeofpolypeptideSynthesis,Springer-Verlag,NewYork,1984;Atherton和Sheppard,SolidPhasepolypeptideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress,NewYork,1989)。還可以參考下述實施例1中描述的具體方法?；蛘?，可以使用編碼多肽的多核苷酸序列在重組系統(tǒng)中制備本發(fā)明的多肽。例如，一般使用重組DNA技術(shù)制備融合蛋白?！栋l(fā)^/炎^#。根據(jù)定義，多肽的"變異體"或"功能性變異體"為不是多肽的化合物，即它含有至少一個非肽鍵的化學連接鍵。因此，多肽衍生物包括(但不限于)經(jīng)過天然的翻譯后修飾(如糖基化)的蛋白質(zhì)?？梢岳斫?，本發(fā)明多肽可以在同一多肽中含有多個下述修飾。優(yōu)選的多肽衍生物保留所需的性質(zhì)，所述性質(zhì)可以是生物學活性；更優(yōu)選地，多肽衍生物在一個或多個所需性質(zhì)上有所提高，或者具有親本多肽不具備的一個或多個所需性質(zhì)。盡管本部分描述了擬肽，但擬肽在本文中被視為小分子。所含有的氨基酸序列與天然來源的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列相同的多肽是"野生型"多肽。多肽的功能性變異體可以通過化學合成來制備，包括(但不限于)組合合成。通過改變編碼多肽的核苷酸序列，可以使用DNA重組技術(shù)來制備比寡肽大的多肽的功能性變異體。盡管有些核普酸序列的變化不會改變所編碼的多肽的氨基S臾序列(沉默突變)，但有許多核苷酸序列的變化會導致多肽的氨基酸序列相對于親本序列有所改變。這種改變的氨基酸序列可以包括氨基酸的取代、缺失和添加，條件是這些氨基酸是天然存在的氨基酸。因此，對編碼多肽的核苷酸進行誘變的技術(shù)可以用來制備多肽的功能性變異體，特別是制備具有氨基S臾取代但沒有缺失或插入的多肽的功能性變異體。已知有多種誘變技術(shù)能夠在體外或體內(nèi)使用，包括(但不限于)化學誘變和PCR介導的誘變作用。這類誘變作用的目標可以是隨機的(即，突變可以發(fā)生在核酸中的任意位點)或者是定向于核酸中編碼特定氨基酸序列的一個部分。利用這類技術(shù)，可以制備隨機的、組合的或集中的化合物文庫、庫池及其混合物。含有天然存在的氨基酸缺失或插入的多肽可以是通過氨基酸序列的化學合成所產(chǎn)生的合成寡肽，所述氨基酸序列基于親本多肽的氨基酸序列，但與之相比，具有一個或多個插入或缺失的氨基酸。具有較長氨基酸序列的多肽中的氨基酸殘基的插入和缺失可以通過定向誘變來實現(xiàn)。經(jīng)記夢發(fā),^,凝。本發(fā)明所關(guān)注的"多肽"包括那些相對于另一多肽具有一個或多個化學修飾的多肽，即經(jīng)化學修飾的多肽。化學修飾之前的多肽可以是野生型蛋白質(zhì)、功能性變異體蛋白或功能性變異體多肽、或者它們的多肽片斷；本發(fā)明的抗體或其他多肽配體，包括(但不限于)單鏈抗體、晶狀體蛋白和它們的多肽衍生物；或根據(jù)本文公開內(nèi)容制備的多肽配體。優(yōu)選地，化學修飾作用賦予或改善了多肽的所需性質(zhì)，但沒有實質(zhì)上改變或損害多肽的生物學活性。所需性質(zhì)包括(但不限于)延長的貯存期限；提高的血漿或其他體內(nèi)穩(wěn)定性；對蛋白酶的抵抗性等。這類修飾包括(但不限于)N末端乙酰化、糖基化和生物素?；?。夢^"iV^端成C末媒必，差思^/戚。賦予對作用于多肽的N末端或C末端殘基的肽酶的抵抗性的有效方法是在多肽末端加入化學基團以使修飾后的多肽不再是肽酶的底物。一種這樣的化學修飾為在多肽的一個或兩個末端進行糖基化。某些化學修飾，特別是N末端糖基化，已經(jīng)表現(xiàn)出能提高人血漿中多肽的穩(wěn)定性(Powdl等，Pharma.Res.10:1268-1273，1993)。提高血漿穩(wěn)定性的其他化學修飾包括(但不限于)加入N末端烷基，包括碳原子數(shù)為l-20的低烷基，如乙?；缓?或加入C末端酰胺或取代的酰胺基。夢^^t媒Z)f虞差^^,農(nóng)。N末端D型氨基酸的存在提高了含有L型氨基酸的多肽的血漿穩(wěn)定性，因為作用于N末端殘基的肽鏈端解酶不能利用D型氨基酸作為底物。同樣，C末端D型氨基酸的存在也穩(wěn)定了多肽，因為作用于C末端殘基的肽鏈端解酶不能利用D型氨基酸作為底物。除了這些末端修飾以外，帶有N末端和/或C末端D型氨基酸的多肽的氨基酸序列通常與含有L型氨基酸的親本多肽的氨基酸序列相同。天,辨虞差凝被^義,辨瘋差凝承/t'的,成。多肽序列中的天然氨基酸被非天然氨基酸所取代能夠賦予或提高包括生物學活性在內(nèi)的一些所需性質(zhì)。這種取代能夠例如賦予針對作用于N末端的肽鏈端解酶的蛋白質(zhì)水解作用的抵抗性。帶有非天然氨基酸的多肽的合成是常規(guī)的并且是現(xiàn)有技術(shù)已知的(參見，例如Coller，等人.1993，引用如上)。翻譯y^化夢滲謬。不同的宿主細胞會具有不同的翻譯后修飾機制，如果融合蛋白中存在需要這種修飾的氨基酸序列，這些機制可以提供特定類型的融合蛋白翻譯后修飾?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了多種(約100種)翻譯后修飾，其中幾種在本文有所討論。本領域技術(shù)人員將能夠選擇合適的宿主細胞，并設計編碼含有特定類型修飾所需的氨基酸序列的蛋白質(zhì)成員的嵌合基因。糖基化是一種發(fā)生在許多真核系統(tǒng)中的翻譯后化學修飾類型，可以影響蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、遺傳藥理、免疫原性和/或抗原性。但是，在糖基化位點必須存在特定的氨基酸來招募合適的糖基化結(jié)構(gòu)，并非所有的宿主細胞都具有合適的分子結(jié)構(gòu)。釀酒酵母(fecc/^ramycescweWs/加e)和畢赤巴斯德酵母(乃'c/2/'G/wtor^)提供了糖基化蛋白的生成，利用昆蟲細胞的表達系統(tǒng)也提供了糖基化蛋白的生成，但糖基化的模式可以隨著用來生成融合蛋白的宿主細月包而不同。另外一種翻譯后修飾是一個或多個Ser、Thr或Tyr殘基的側(cè)鏈自由羥基的磷酸化，這類反應由蛋白激酶催化。磷酸化常常因蛋白磷酸酶的作用而是可逆的，因為蛋白磷酸酶催化氨基酸殘基的脫磷酸作用。氨基末端殘基在化學結(jié)構(gòu)上的差異緣于不同的宿主細胞，每種宿主細胞具有不同化學模式的由起始密碼子編碼的蛋氨酸殘基，這將導致具有不同化學修飾的氨基末端。例如，許多或大多數(shù)細菌蛋白的合成中使用的氨基末端氨基酸是經(jīng)修飾的蛋氨酸，即N-曱?；?蛋氨酸(fMet)。盡管經(jīng)常說所有的細菌蛋白的合成使用fMet起始氨基酸，盡管這可能對大腸桿菌(E.coli)來說是正確的，但近期的研究表明，這種說法在其他細菌(如綠膿假單胞菌，Pset^omowosaerag/wwa)中是不正確的(Newton等人，J.Biol.Chem.274:22143-22146,1999)。無論怎樣，在大腸桿菌中，fMet的曱?；ǔＴ诜g后被酶解去除，來生成氨基末端蛋氨酸殘基，但有時要去除整個fMet殘基(參見Hershey,Chapter40，"ProteinSynthesis"in:EscherichiaColiandSalmonellaTyphimurium:CellularandMolecularBiology,Neidhardt,FrederickC，EditorinChief,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.,1987，Volume1,pages613-647,andreferencescitedtherein.)。缺乏催化所述翻譯后修飾的酶(如曱?；?的大腸桿菌突變株將生成具有氨基末端fMet殘基的蛋白質(zhì)(Guillon等人，J.Bacteriol.174:4294-4301,1992)。在真核生物中，起始蛋氨酸殘基或次末端殘基(如果起始蛋氨酸已經(jīng)被去除)的乙?；话惆l(fā)生在翻譯的同時或之后。乙?；磻蒒末端乙酰轉(zhuǎn)移酶(NAT，a.k.a.N-a-乙酰轉(zhuǎn)移酶)催化，而起始蛋氨酸殘基的去除由蛋氨酸氨基肽酶催化(參見綜述Bradshaw等人，TrendsBiochem.Sci.23:263-267,1998;Driessen等人,CRCCrit.Rev.Biochem.18:281-325，1985)。氨基末端乙?；牡鞍踪|(zhì)被稱為"N乙?；?、"N-a乙?；?或簡單稱為"乙酰^ft的"。發(fā)生在真核生物中的另一個翻譯后修飾過程為羧基末端的a-酰胺化(參見綜述Eipper等人，Annu.Rev.Physiol.50:333-344,1988;Bradbury等人，LungCancer14:239-251，1996.)。約50%已知的內(nèi)分泌和神經(jīng)內(nèi)分泌的肽類激素是a-酰胺化的(Treston等人，CellGrowthDiffer.4:911-920，1993)。大多數(shù)情況下，需要羧基a-酰胺化來激活這些肽類激素。多肽模擬物通常，多肽模擬物(擬肽)是模擬多肽生物學活性的分子，但在化學本質(zhì)上不再是肽類。按照嚴格的定義，擬肽是不含肽鍵(即氨基酸之間的酰胺鍵)的分子。然而，術(shù)語"擬肽"有時也用來描述本質(zhì)上不再完全是肽類的分子，如假肽、半肽和類肽。一些廣義上的擬肽(此時，多肽的部分被缺乏肽鍵的結(jié)構(gòu)所取代)的例子如下文所述。不論是完全非肽還是部分非肽，本發(fā)明的擬肽提供了作為擬肽基礎的反應性化學基團的空間排列，這種排列接近類似于多肽中活性基團的三維組合。由于這種相似活性位點的幾何學特征，擬肽對生物系統(tǒng)的作用類似于多肽的生物學活性。使用給定多肽的模擬物比使用多肽本身具有幾個潛在的優(yōu)點。例如，多肽可能表現(xiàn)出非所需的性質(zhì)，即，低的生物利用度和短的作用持續(xù)時間。擬肽通常很小，足以口服有效并具有長的作用持續(xù)時間。多肽還存在與穩(wěn)定性、貯存和免疫反應性有關(guān)的問題，而擬肽則沒有這些問題。具有所需的生物學活性的候選多肽、主導多肽及其他多肽能夠被用于開發(fā)具有類似生物學活性的擬肽。從多肽開發(fā)擬肽的技術(shù)是已知的。肽鍵可以被非肽鍵取代，這種非肽鍵使擬肽具有與原始多肽類似的結(jié)構(gòu)，因此有類似的生物學活性。進一步的修飾還可以用結(jié)構(gòu)類似的其他化學基團來取代氨基酸的化學基團。可以通過NMR光譜、結(jié)晶和/或計算機輔助分子模擬測定原始多肽的自由的或與配體結(jié)合的三級結(jié)構(gòu)來輔助開發(fā)擬肽。這些技術(shù)幫助開發(fā)比原始多肽具有更高的效價和/或生物利用度和/或穩(wěn)定性的新型組合物(Dean,BioEssays，16:683-687,1994;Cohen和Shatzmiller,J.Mol.Graph"11:166-173，1993;Wiley和Rich,Med.Res.Rev"13:327-384，1993;Moore,TrendsPharmacol.ScL,15:124-129,1994;Hruby,Biopolymers,33:1073-1082,1993;Bugg等人，ScLAm.,269:92-98，1993,全部以引用方式并入本文)。因此，通過使用上述方法，本發(fā)明提供了與上述多肽相比具有提高的治療活性的化合物。本發(fā)明包括通過上述方法獲得的擬肽化合物，其具有上述多肽的生物學活性和類似的立體結(jié)構(gòu)。擬肽可以從之前章節(jié)描述的任意經(jīng)修飾的多肽生成，或者從具有之前章節(jié)描述的多種修飾的多肽生成，這對于本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明的擬肽除了作為治療性化合物的應用外，還可以用來開發(fā)更有效的非肽類化合物，這對本領域技術(shù)人員來說也是顯而易見的。從之前章節(jié)描述的多肽衍生而來的擬肽的具體實例在下文提供。這些實例是說明性的，而不是對其他或另外的修飾的限制。^有還^的冶子爭捧/度炎鍵的i。蛋白酶作用于肽鍵。因此，假肽鍵對肽鍵的取代賦予了對蛋白水解的抵抗性。許多一般不影響多肽結(jié)構(gòu)和生物學活性的假肽鍵已經(jīng)被公開。還原的電子等排假肽鍵是一種的合適的假肽鍵，該假肽鍵可提高對酶切的穩(wěn)定性，并沒有或有很少的生物學活性喪失(Couder等人，Int.J.PolypeptideProteinRes.41:181-184，1993,以引用方式并入本文)。因此，除了一個或多個肽鍵:被取代為電子等排假肽鍵外，這些化合物的氨基酸序列可以與它們的L型氨基酸親本多肽的序列相同。優(yōu)選地，大部分N末端肽鍵被取代，因為這種取代會賦予對作用于N末端的肽鏈端解酶的蛋白質(zhì)水解的抵抗性。夢才A/^^^ra-/m^rao,/度i鍵^農(nóng)。為賦予對蛋白質(zhì)水解的抵抗性，還可以使用反向假肽鍵來取代肽鍵(Dalpozzo等人，Int.J.Polyp印tideProteinRes.41:561-566，以引用方式并入本文)。才艮據(jù)這一1"奮飾，除了一個或多個肽鍵被取代為反向假肽鍵外，這些化合物的氨基酸序列可以與它們的L型氨基酸親本多肽序列相同。優(yōu)選地，大部分N末端肽鍵被取代，因為這種取代會賦予對作用于N末端的肽鏈端解酶的蛋白質(zhì)水解的抵抗性。類l/^4:參。多肽的類肽衍生物代表另一種形式的修飾多肽，其保留了對于生物學活性重要的結(jié)構(gòu)決定子，而清除了肽鍵，從而賦予對蛋白質(zhì)水解的抵抗性(Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:9367-9371,1992，以引用方式并入本文)。類肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已經(jīng)公開了許多N-烷基，每一個都對應于天然氨基酸的側(cè)鏈。組合蛋白質(zhì)設計變異體一般表現(xiàn)出同樣性質(zhì)的生物學活性，但是如果需要，分子伴侶活性可以與原始的候選變異體蛋白不同?；蛘?，可以設計變異體，以使候選變異體蛋白的生物學活性改變。例如，糖基化位點可以被改變或去除。同樣，生物學功能可以被改變。另外，在一些實施方案中，期望擁有分子伴侶活性改變的候選變異體蛋白，這種蛋白會結(jié)合靶蛋白。優(yōu)選地，期望擁有具有氧化穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。氧穩(wěn)定性的變化通過下述得到證明當暴露于多種氧化條件時，變異體蛋白的活性與野生型蛋白相比有至少約20%的增加，更優(yōu)選為至少約50%的增加。通過已知方法來檢測氧化穩(wěn)定性。堿穩(wěn)定性的變化通過下述得到證明當暴露于升高或降低的pH條件時，變異體蛋白的活性半衰期與野生型蛋白相比有至少約5%或更大的增加或減少(優(yōu)選為增加)。通常，使用已知方法來檢測堿穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性的變化通過下述得到證明當暴露于相對高的溫度和中性pH條件時，變異體蛋白的活性半衰期與野生型蛋白相比有至少約5%或更大的增加或減少(優(yōu)選為增加)。通常，使用已知方法來檢測熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的候選變異體蛋白和核酸可以通過許多方式制備。各核酸和蛋白質(zhì)可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的及下文所列的方法制備?；蛘?，可以制備候選變異體蛋白文庫，用于檢測。在一個優(yōu)選實施方案中，候選變異體蛋白文庫產(chǎn)生于概率分布表。如本文所列出的，有多種生成概率分布表的方法，包括使用PDATM技術(shù)、序列比對、力場計算(如自洽平均場(SCMF)計算)。另外，概率分布可以用來為每個位置生成信息熵值，作為文庫中觀察到的突變頻率的一個量度。在該實施方案中，確定了每個氨基酸殘基在表中每個可變位置的頻率?？梢詾轭l率設定閾值，其中，任何低于界值的變異體頻率被設定為零。該界值優(yōu)選為約1%、2%、5%、10%或20%,特別優(yōu)選為約10%。然后，將這些頻率建成候選變異體蛋白的文庫。即，如上文所述，收集這些可變位置并生成所有可能的組合，但根據(jù)頻率來利用那些"填充"候選變異體蛋白文庫的氨基酸殘基。因此，在一個不基于頻率的候選變異體蛋白文庫中，有5種可能殘基的可變位置上將有20%的蛋白質(zhì)包含具有第一種可能的殘基的可變位置，20%的蛋白質(zhì)包含具有第二種可能的殘基的可變位置，依次類推。然而，在一個基于頻率的候選可變蛋白文庫中，有5個可能殘基的可變位置上5個可能殘基的頻率分別為10%、15%、25%、30%和20%，則該位置將有10%的蛋白質(zhì)包含具有第一種可能的殘基的可變位置，15%的蛋白質(zhì)包含具有第二種可能的殘基的可變位置，25%的蛋白質(zhì)包含具有第三種可能的殘基的可變位置，依次類推。本領域技術(shù)人員會理解，實際頻率可能取決于用來實際生成蛋白質(zhì)的方法；例如，實際頻率可能是蛋白質(zhì)合成時的頻率。但是，當使用下文所述的基于頻率的引物系統(tǒng)時，每個位置的實際頻率將會改變，如下文所述。本領域技術(shù)人員會理解，本文所列的概率分布表能夠以多種方式生成。除了本文所列的方法外，可以使用自洽平均場(SCMF)方法來直接生成概率分布表。SCMF是一種確定性計算方法，利用旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體相互作用的平均場描述來計算能量。以這種方式生成的概率表能夠用來構(gòu)建本文公開的候選變異體蛋白文庫?？梢匀N方式使用SCMF:在每個位置上為每個氨基酸列出氨基酸和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的頻率；從SCMF直接確定概率(參見Delarue等人，Pac.Symp.Biocomput.109-21，1997,以引用方式并入本文)。另外，可以確定高度可變位置和不可變位置?；蛘撸褂昧硗庖环N方法來確定在檢索序列空間過程中哪個序列躍遷；使用SCMF來獲得該序列的準確能量；然后用該能量對該序列評級并產(chǎn)生一個序列等級列表(類似于MonteCarlo序列列表)。然后，可以根據(jù)該列表計算顯示每個位置上氨基酸頻率的概率表(Koehl等人，J.Mol.Biol.239:249,1994;Koehl等人,Nat.Struc.Biol.2:163,1995;Koehl等人，Curr.Opin.Struct.Biol.6:222,1996;Koehl等人,J.Mol.Bio.293:1183，1999;Koehl等人，J.Mol.Biol.293:1161,1999;Lee,J.Mol.Biol.236:918,1994;VasquezBiopolymers36:53-70,1995;全部以引用方式并入本文)。類似方法包括(但不限于)OPLS-AA(Jorgensen等人，J.Am.Chem.Soc,118:11225-11236,1996;Jorgensen,W.L.;BOSS,Version4.1;YaleUniversity:NewHaven,Conn.，1999)、OPLS(Jorgensen等人，J.Am.Chem.Soc,110:1657ff,1988;Jorgensen等人，JAm.Chem.Soc.112:4768ff,1990)、UNRES(聯(lián)合殘基力場；Liwo等人，ProteinScience,2:1697-1714,1993;Liwo等人，ProteinScience,2:1715-1731,1993;Liwo等人，J.Comp.Chem.18:849-873,1997;Liwo等人，J.Comp.Chem.,18:874-884,1997;Liwo等人，J.Comp.Chem.19:259-276,1998)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的力場(Liwo等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA,96:5482-5485,1999)、ECEPP/3(Liwo等人,JProteinChem13(4):375-80,1994)、AMBER1.1力場(Weiner等人,J.Am.Chem.Soc.106:765-784,1994)、AMBER3.0力場(U.C.Singh等人，Proc.Natl.Acad.ScLUSA.82:755-759,1994)、CHARMM和CHARMM22(Brooks等人，J.Comp.Chem.4:187-217)、cvffi.O(Dauber-Osguthorpe等人,Proteins:Structure,FunctionandGenetics,4:31-47，1988);cff91(Maple等人，J.Comp.Chem.15:162-182，1988)、DISCOVER(cvff和cffPl)、AMBER力場用于INSIGHT分子模擬包(Biosym/MSI，SanDiegoCalif.),HARMM用于QUANTA分子模擬包(Biosym/MSI，SanDiegoCalif.),全部參考文獻以引用方式整體并入本文。另外，生成概率分布表的方法是通過使用序列比對程序。此外，概率分布表的獲得可以通過序列比對和計算方法的結(jié)合。例如，可以將在同源序列比對中發(fā)現(xiàn)的氨基酸加入到計算結(jié)果中。優(yōu)選的，如果在計算中沒有發(fā)現(xiàn)野生型氨基酸，可以將它加入概率表。可以理解，通過組合可變的位置和/或可變位置上的殘基所生成的候選變異體蛋白文庫可以不在等級列表中。在一些實施方案中，可以制作并測試完整的列表?；蛘?，在一個優(yōu)選實施方案中，二級文庫也可以是等級列表的形式，其可行的原因有幾個，包括二級文庫的大小依然太大而難以通過實驗生成，或者是為了預測目的。這可以通過幾種方式來進行。在一個實施方案中，使用PDATM的評分功能對二級文庫進行評級或過濾，來評級或過濾文庫成員?；蛘?，可以使用統(tǒng)計方法。例如，可以通過頻率分數(shù)來評級或過濾二級文庫；即，含有最多高頻率殘基的蛋白質(zhì)的評級較高，等等?？梢酝ㄟ^將每個可變位置的頻率相加或相乘來生成數(shù)字分數(shù)。同樣，可以對二級文庫不同位置進行加權(quán)，然后對蛋白質(zhì)打分；例如，含有某些殘基的蛋白質(zhì)可以被任意評級或過濾。在一個實施方案中，候選變異體文庫的不同蛋白質(zhì)成員可以被化學合成。盡管現(xiàn)有技術(shù)已知較長的蛋白質(zhì)能夠通過化學方法或酶來合成，但當所設計的蛋白質(zhì)長度較短時，化學合成特別有用，較短蛋白質(zhì)的優(yōu)選長度為少于150個氨基酸，優(yōu)選少于100氨基酸，特別優(yōu)選少于50個氨基酸(參見Wilken等人，Curr.Opin.BiotechnoL9:412-26,1998,以引用方式并入本文)。在另一實施方案中，特別對于較長的蛋白質(zhì)或者期望大樣本的蛋白質(zhì)，候選變異體序列被用來生成核苷酸，如編碼成員序列的DNA,如果需要，這類DNA能夠被克隆入宿主細胞，被表達并檢測。因此，能夠制備編碼每個成員蛋白質(zhì)序列的核酸，特別是DNA。這可以使用公知方法來進行。密碼子的選擇、合適的表達載體以及合適的宿主細胞將取決于大量因素，能夠根據(jù)需要而輕易優(yōu)化。另一實施方案中，使用庫池的寡聚核苷酸進行了多重PCR反應。在該實施方案中，根據(jù)全長基因合成了重疊的寡聚核苷酸。此外，這些寡聚核苷酸可以代表每個變異位置的所有不同氨基酸或亞基。這些寡聚核苷酸可以等比例集合，進行多重PCR反應來生成全長序列，這些序列含有二級文庫所定義的突變組合。另外，也可以使用易錯PCR方法。被加入的不同寡聚核苷酸的相對含量可以對應于概率分布表。從而使多重PCR反應形成的全長序列具有期望比例的期望突變組合。所需要的寡聚核苷酸總數(shù)是突變位置數(shù)目和這些位點可能的突變數(shù)目的函數(shù)恒定位置的寡聚核苷酸數(shù)+]^11+]^2+]^3+...Mi^所需要的寡聚核苷酸總數(shù)，其中Mn是序列中位置n處的可能突變數(shù)目。另一個方面，每個重疊寡聚核苷酸只含有一個突變位置；其他實施方案中，突變位置相距太近以至于不能允許這種突變，而每個寡聚核苷酸的多重變異體被用來進行所有可能的全面重組。即，每個寡聚核苷酸可以含有單個突變位置的密碼子，或者多個突變位置的密碼子。多個突變位置在序列中必須接近，以避免寡聚核苦酸的長度沒有實用性。對于寡聚核苷酸上的多個突變位置，通過包括或排除編碼這一組合的寡聚核苷酸，文庫中可以包括或排除特定的突變組合。例如，如本文所述，可變區(qū)域間可以存在關(guān)聯(lián)；即，當位置X是某一殘基時，位置Y必須是(或必須不是)某特定殘基。在本文，這些可變位置的集合有時指"蔟"。當簇由鄰近殘基共同組成并因此可以存在于一個寡聚核苷酸引物上時，該簇被定為"良好"關(guān)聯(lián)，并清除那些可能降低文庫有效性的不良組合。然而，如果簇的殘基在序列中相隔很遠并因此位于用于合成的不同寡聚核苷酸上，可以期望將這些殘基定為"良好"關(guān)聯(lián)，或?qū)⑺鼈冏鳛榭勺儦埢耆宄Ｔ诳蛇x實施方案中，文庫的生成有幾個步驟，以便簇的突變只能一起發(fā)生。識別突變簇并將它們置于同一寡聚核苷酸或?qū)⑺鼈儚奈膸熘星宄姆椒ǎ蛘咄ㄟ^幾個步驟生成文庫并保留簇的方法，能夠為實驗文庫大大豐富正確折疊的蛋白質(zhì)。簇的識別可以通過許多方式，例如，使用已知的模式識別方法，比較突變發(fā)生頻率，或者對實驗生成的序列進行能量分析(例如，如果相互作用的能量高，則這些位置是關(guān)聯(lián)的)。這些關(guān)聯(lián)可以是位置關(guān)聯(lián)(例如，可變位置l和2總是同時變化或從不同時變化)或序列關(guān)聯(lián)(例如，如果位置1是殘基A,則位置2始終是殘基B)。參見PatterndiscoveryinBiomolecularData:Tools,Techniques,andApplications;editedbyJasonT.L.Wang,BruceA.Shapiro,DennisShasha.NewYork:OxfordUniversity,1999;Andrews,HarryC.Introductiontomathematicaltechniquesinpatterrecognition;NewYork,Wiley-Interscience,1972;ApplicationsofPatternRecognition;Editor,K.S.Fu.BocaRaton,Fla.CRCPress,1982;GeneticAlgorithmsforPatternRecognition;editedbySankarK.Pal,PaulP.Wang,BocaRaton:CRCPress,cl996;Pandya，AbhijitS.,PatternrecognitionwithNeuralnetworksinC++/AbhijitS.Pandya,RobertB.Macy.BocaRaton,Fla.:CRCPress,1996;Handbookofpatternrecognitionandcomputervision/editedbyC.H.Chen,LF.Pau，P.S.P.Wang.2nded.Signapore;RiverEdge,NJ.:WorldScientific,c1999;Friedman,IntroductiontoPatternRecognition:Statistical,Structural,Neural,andFuzzyLogicApproaches;RiverEdge,N.J.:WorldScientific,cl999，Seriestitle:Serienamachineperceptionandartificialintelligence;vol.32;這些文獻全部以引用方式并入本文。另外，可以使用檢索共有基序的其他程序。另外，通過改變寡聚核苷酸的設計可以修正或優(yōu)化關(guān)聯(lián)和洗牌；即，通過決定寡聚核苷酸(引物)的起始位點和終止位點(例如，序列的"截斷"位點)?？梢栽O置寡聚核苷酸的起始和終止位點來使單個寡聚核苷酸中出現(xiàn)的簇的數(shù)目最大化，從而豐富文庫的高得分序列。可以對不同寡聚核苷酸的起始和終止位點選項進行計算機模擬，并根據(jù)單個寡聚核苷酸上展示的簇的數(shù)目或者符合預測序列文庫的結(jié)果序列百分比進行評級或過濾。當單個寡聚核苷酸編碼多個可變位置時，所需寡聚核苷酸的總數(shù)增加。退火區(qū)域是保持恒定的區(qū)域，即含有參照序列的區(qū)域。帶有密碼子插入或缺失的寡聚核苷酸可以用來構(gòu)建表達不同長度蛋白質(zhì)的文庫。篩選插入或缺失的特定的計算機序列篩選可以生成限定不同長度蛋白質(zhì)的二級文庫，其中不同長度的蛋白質(zhì)可以由匯集的不同長度寡聚核苷酸文庫表達。另一個方面，二級文庫的構(gòu)建是通過家族(例如，一組變異體)洗牌；即，某組上部序列(如果使用了評級列表)可以被洗牌，使用或不使用易錯PCR。這里的"洗牌"意思是相關(guān)序列的重新組合，一般以隨機的方式。這可以包括下述專利文獻中定義和舉例說明的"洗牌，，美國專利No.5,830,721、5,811,238、5,605,793、5,837,458和PCTUS/19256,全部以引用方式整體并入本文。該組序列還可以是人工組；例如，來自概率表的組(如使用SCMF產(chǎn)生的組)或MonteCarlo組。同樣，"家族"可以是上部IO個序列和下部IO個序列，上部100個序列，等等。還可以使用易錯PCR來冗成。因此，另外一個方面，使用其中描述的計算方法來進行計算機洗牌。即，從兩個文庫或兩個序列開始，可以生成并評價序列的隨機組合?？梢赃M行易錯PCR來生成二級文庫(參見美國專利No.5,605,793、5,811,238和5,830,721,全部以引用方式并入本文)。其進行可以針對最佳序列或文庫的上部成員，或者一些其他人工組或家族。在該實施方案中，初級文庫的計算篩選中發(fā)現(xiàn)的最佳序列的基因可以被合成。然后在含有編碼二級文庫可變位置的突變的寡聚核苷酸(偏移寡聚核苷酸)條件下，對最佳序列基因進行易錯PCR。寡聚核香酸的加入將產(chǎn)生偏移，有助于在二級文庫中4參入突變?；蛘?，只有負責某些突變的寡聚核苷酸可以用來偏移文庫。在偏移寡聚核苷酸存在下，可以將易錯PCR基因洗牌應用于最佳序列基因，來生成反映二級文庫中突變比例的DNA序列文庫。偏移寡聚核苷酸的選擇可以通過多種方式；可以根據(jù)頻率來選擇，即，可以使用編碼高突變頻率位置的寡聚核苦酸；或者，可以使用含有最多可變位置的寡聚核香酸，以增加多樣性；如果二級文庫經(jīng)過評級或過濾，可以使用一些高得分位置來生成偏移寡聚核苷酸；可以選擇隨機位置；可以選擇幾個高得分和低得分位置；等等。重要的是根據(jù)優(yōu)選的可變位置和序列來生成新序列。利用野生型基因或多肽序列的PCR可以被使用。在該實施方案中，使用了起始基因；雖然沒有要求，但通常該基因是野生型基因。一些情況下，可以是編碼全面優(yōu)化序列或者列表中任意其他序列的基因。在該實施方案中，使用的寡聚核苷酸對應于可變位置并含有二級文庫的不同氨基酸。如現(xiàn)有技術(shù)已知的，進行PCR時在末端使用了PCR引物。該方案提供了兩點好處首先是需要較少的寡聚核苷酸并產(chǎn)生較少的錯誤；另外是具有實驗上的優(yōu)勢，因為如果使用野生型氨基酸，則它不需要進行合成?？梢赃M行PCR產(chǎn)物的連接?？梢詫σ粋€或多個候選變異體二級文庫進行多個附加步驟；例如，可以進行其他計算處理，可以重新組合候選變異體二級文庫，或者重新組合不同候選變異體二級文庫的界值。在一個優(yōu)選實施方案中，候選變異體二級文庫被重新計算處理，來形成另一個二級文庫(在本文有時被稱為"三級文庫")。例如，可以通過凍結(jié)或固定首4侖二級文庫中的一些或所有^皮改變的位置，選擇任意候選變異體二級文庫序列來進行第二輪PDATM?；蛘?，只允許那些在最終概率分布表中可見的改變?；蛘?，可以通過提高或降低界值范圍來改變概率表的嚴緊性。同樣，候選變異體二級文庫可以在首輪之后被實驗重新組合；例如，首輪篩選的最佳基因可以被用來重新組合(例如使用下述技術(shù)多重PCR、易錯PCR或洗牌)?；蛘撸褂靡粋€或多個良好基因片斷來改變一些位置的概率。這使檢索偏移到第一輪計算和實驗篩選中發(fā)現(xiàn)的序列空間范圍。小分子化學組合物"小分子"包括能影響生物學過程的任何化學或其他基團。小分子可以包括目前已知并使用的任何多種治療劑，或者可以是在用于篩選生物學功能的分子文庫中合成的小分子。小分子在大小上不同于大分子。本發(fā)明的小分子一般具有的分子量小于約5000道爾頓(Da),優(yōu)選為小于約2500Da,更優(yōu)選為小于1000Da，最優(yōu)選為小于約500Da。小分子包括(但不限于)有機化合物、擬肽和它們的軛合物。本文使用的術(shù)語"有機化合物"指任何基于碳原子的化合物，而不是如核苷酸和多肽之類的大分子。除了碳原子，有機化合物可以含有鈣、氯、氟、銅、氫、鐵、鉀、氮、氧、硫及其他元素。有機化合物可以是芳香族或脂肪族形式。有機化合物的非限制性例子包括丙酮、乙醇、苯胺、碳水化合物、單糖、寡糖、多糖、氨基酸、核苷、核苷酸、類脂、類視黃醇、類固醇、蛋白聚糖、酮、醛、飽和脂肪、不飽和脂肪、多飽和脂肪、油脂和蠟、烯烴、酯類、醚、硫醇、硫化物、環(huán)狀化合物、雜環(huán)化合物、咪唑和苯酚。本文使用的有機化合物還包括硝化的有機化合物和卣代的(如氯代)有機化合物。下文描述了制備擬肽的方法。使用如加速質(zhì)譜測定法(AMS)的技術(shù)對本發(fā)明定義的小分子集合及小分子進行表征(參見Turteltaub等人.，CurrPharmDes6(10):991-1007，2000,Bioanalyticalapplicationsofacceleratormassspectrometryforpharmaceuticalresearch;Enjalbal等人,MassSpectromRev19(3):139-61,2000,Massspectrometryincombinatorialchemistry)。優(yōu)選的小分子是那些在生產(chǎn)、配制或制備上相對容易、成本較低的小分子。優(yōu)選的小分子在多種貯存條件下是穩(wěn)定的。優(yōu)選的小分子可以與大分子緊密結(jié)合而形成具有生物學活性且藥學特征得到改善的分子。改善的藥學特征包括在循環(huán)周期、擴散、代謝、修飾、排泄、分泌、消除和穩(wěn)定性方面有利于想要的生物學活性的變化。改善的藥學特征包括化學物質(zhì)在毒理和效力特征方面的變化。應用方法本發(fā)明的Intellipeptide可以用于多種應用，包括(但不限于)治療用途，如治療與蛋白質(zhì)聚集或錯折疊相關(guān)的疾病或病癥，還可以用于多肽的生產(chǎn)和純化，所述多肽包括重組生成的多肽。候選治療性化合物在體外防止蛋白質(zhì)未折疊和聚集的能力可能與該化合物在體內(nèi)抑制未折疊和聚集的能力有關(guān)。另外，認為候選治療化合物在體外穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能性結(jié)構(gòu)的能力可能與該化合物在體內(nèi)輔助蛋白質(zhì)行使功能的能力有關(guān)。本文公開的多肽提供了一組多用途的藥物分子，其能夠作為治療性肽專門用來防止疾病中涉及的蛋白質(zhì)聚集或蛋白質(zhì)錯折疊。與蛋白質(zhì)聚集或58蛋白質(zhì)錯折疊有關(guān)的疾病包括(但不限于)阿爾茨海默疾病(卩淀粉樣蛋白)、白內(nèi)障((3晶狀體蛋白及纖維)、帕金森病(a-核突觸蛋白)、亨廷頓病(亨廷頓病蛋白)、色素性視網(wǎng)膜炎(視紫質(zhì))、朊病毒病、瘋牛病及其他疾病。導致蛋白序列中單個氨基酸改變的錯義突變與人類疾病相關(guān)聯(lián)。大約160000個已確認的錯義突變中大部分影響蛋白質(zhì)的折疊或運輸，而不是特別影響蛋白質(zhì)功能。疾病相關(guān)的膜內(nèi)蛋白錯義突變導致膜蛋白的不正確裝配，例如，腓骨肌萎縮病中的PMP-22、尿崩癥中的水通道蛋白、尿崩癥中的血管加壓素受體、色素性視網(wǎng)膜炎中的視紫質(zhì)、腓骨肌萎縮病中的連接蛋白32、嚢性纖維病中的CFTR。其他肽可以用來穩(wěn)定治療性蛋白，如疫苗、胰島素、生長因子、單克隆抗體。Intellipeptide可以用于蛋白質(zhì)的純化，來輔助蛋白質(zhì)折疊成功能性立體結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明描述了多種與Intellipeptide應用有關(guān)的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過為含有所述蛋白質(zhì)的細胞或溶液中提供Intellipeptide而抑制蛋白質(zhì)未折疊或減少蛋白質(zhì)聚集的方法。在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明包括通過向含有所述蛋白質(zhì)的細胞或溶液中提供Intellipeptide而恢復正確或適當?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊的方法。另外，本發(fā)明還才是供了通過為含有所述多肽的細胞或溶液中提供Intellipeptide而提高重組生成的多肽的生產(chǎn)和/或分離的方法。可以通過現(xiàn)有技術(shù)中可利用的多種方法為細胞或溶液4是供Intellipeptide。例如，可以將合成的Intellipeptide直接4是供給溶液或細胞。另外，還可以通過向細胞或溶液中導入含有編碼Intellipeptide的多聚核苷酸序列的表達載體，所述表達載體帶有調(diào)控所述Intellipeptide在細胞內(nèi)表達的調(diào)控元件。多聚核苷S臾序列可以進一步含有其他編碼區(qū)，包括，例如分泌信號，以便Intellipeptide乂人細胞中分泌出來；和/或調(diào)節(jié)編碼的Intellipeptide表達的其他元件，大多數(shù)是現(xiàn)有技術(shù)已知并可用的，包括那些用于誘導表達肽和多肽的元件。因此，本發(fā)明還包括編碼Intellipeptide的多聚核苷酸序列以及含有該序列的表達載體，例如包括病毒載體。Intellipeptide可以用于治療(但不限于)蛋白質(zhì)聚集疾病，例如包括阿爾茨海默疾病、白內(nèi)障、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(LouGehrig's病)、牛海綿樣腦病(瘋牛病)、朊病毒病、黃斑變性和色素性視網(wǎng)膜炎。另外，Intellipeptide能夠穩(wěn)定治療用途的蛋白質(zhì)和/或肽，包括(但不限于)疫苗、胰島素、生長因子和單克隆抗體。Intellipeptide在蛋白質(zhì)純化過程中輔助蛋白質(zhì)折疊并穩(wěn)定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明提供了治療疾病或病癥的方法，包括為有相應需要的患者施用Intellipeptide。圖1提供了Intellipeptide的有關(guān)治療的應用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過為阿爾茨海默病患者提供Intellipeptide而治療阿爾茨海默疾病的方法。阿爾茨海默疾病(AD)是一種破壞性神經(jīng)變性狀態(tài)，特征為短期記憶喪失、定向力障礙、判斷和推理能力損害。AD是老年人口中最普遍的癡呆癥，估計在世界范圍內(nèi)，它以一定程度影響著2500萬以上的人。AD的標志為不溶性蛋白質(zhì)聚集物(已知為淀粉樣蛋白)在大腦軟組織細胞和血管壁的沉積。淀粉樣蛋白的主要組分為4.3KDa的疏水性肽，命名為(3淀粉樣蛋白肽((3淀粉樣蛋白)，由21號染色體編碼，作為更長的前體蛋白(APP)的部分(Selkoe,5Wewce275:630-631,1997)。在過去IO年中積累的遺傳學、生物化學和神經(jīng)病理學證據(jù)充分表明，淀粉樣蛋白在AD的早期發(fā)病機理中起重要作用，可能是疾病的觸發(fā)因素(Selkoe,1997)。在阿爾茨海默病例中，(3淀粉樣蛋白和?；撬岬牡鞍踪|(zhì)聚集與神經(jīng)細胞和神經(jīng)突起的病變密切相關(guān)。(3淀粉樣蛋白的聚集導致毒斑的形成，毒斑可引起神經(jīng)細胞的死亡。另一方面，?；撬嵩谏窠?jīng)突起的結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用。?；撬崤c被稱為微管蛋白的細胞骨架細絲相結(jié)合而形成神經(jīng)突起的核心-微管。牛磺酸的翻譯后修飾，特別是高度磷酸化，形成?；撬?微管蛋白的相互作用。微管的去穩(wěn)定作用導致神經(jīng)突起的病變。最后，?；撬?微管蛋白相互作用非常不穩(wěn)定，以致于?；撬崤c微管蛋白分離而成為自由體。未結(jié)合的?；撬醿A向于形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)有神經(jīng)毒性而導致神經(jīng)病變。p淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)是阿爾茨海默疾病的標志。另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過為患有糖尿病的患者提供Intellipeptide而治療糖尿病的方法。在一個具體實施方案中，將Intellipeptide作為用于治療糖尿病的胰島素的經(jīng)口和/或鼻給藥的穩(wěn)定分子而提供給患者。因此，本發(fā)明包括治療糖尿病的方法，包括為有相應需要的患者聯(lián)合施用胰島素和Intellipeptide。盡管經(jīng)口和鼻的胰島素給藥方法是方便及無痛的方法，并且已經(jīng)在近期獲得FDA批準用于人類，但目前對l型糖尿病來說，使用最廣泛的胰島素給藥方法是注射。許多糖尿病患者在一天內(nèi)需要多次注射，既疼痛又不方便。胰島素是肽類藥物，室溫下不穩(wěn)定，不能通過胃腸吸收，易于被胃腸道酶水解。穩(wěn)定胰島素的分子保護胰島素免受刺激性環(huán)境(包括溫度、pH和蛋白質(zhì)水解酶)的破壞，將實現(xiàn)胰島素經(jīng)口或鼻途徑的給藥。盡管現(xiàn)有的小分子和聚合物能保護胰島素免受pH和蛋白質(zhì)水解酶的破壞，但沒有一個現(xiàn)有的聚合物或小分子能夠長時間保持胰島素的結(jié)構(gòu)完整。Intellipeptide能夠與胰島素結(jié)合并穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，保持其功能并保護其免受溫度、pH和蛋白質(zhì)水解酶的破壞。含有一種或多種Intellipeptide的胰島素制劑將實現(xiàn)胰島素經(jīng)下述途徑的給藥，包括(但不限于)口、鼻、裝置和貼片方法。在另一實施方案中，本發(fā)明包括通過向含有所述肽或蛋白質(zhì)的細胞或溶液S1入Intellipeptide而生成和/或純化肽或蛋白質(zhì)的方法?，F(xiàn)代藥物開發(fā)過程日益集中于研發(fā)特異性分子靶點藥物并大大提高了生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的工業(yè)要求。高質(zhì)量蛋白質(zhì)的表達對于藥物開發(fā)和藥物治療來說是基本要求。隨著潛在藥物靶點數(shù)目以及蛋白質(zhì)和肽類藥物數(shù)目的增加，對重組蛋白的要求也可能增加。研發(fā)大量生產(chǎn)可溶性靶蛋白的有效方法對于現(xiàn)代藥物開發(fā)來說是基本的要求。Intellipeptide能夠作為折疊助劑來折疊那些使用生物技術(shù)方法(如細菌或哺乳動物表達系統(tǒng))合成的蛋白質(zhì)。Intellipeptide是一組多用途的分子，作用靶點是蛋白質(zhì)錯折疊和聚集致病^各徑中的一個或多個中間體。在一個實施方案中，Intellipeptide一皮i殳計來結(jié)合并穩(wěn)定構(gòu)象缺陷蛋白質(zhì)的中間體，例如，Intellipeptide結(jié)合并穩(wěn)定卩淀粉樣蛋白并防止其聚集。具體實施例實施例1與卩淀粉樣蛋白結(jié)合的aB晶體蛋白的肽的識別與靶蛋白(3淀粉樣蛋白結(jié)合的aB晶體蛋白的肽的識別是通過篩選aB晶體蛋白針腳陣列，它提供了一種系統(tǒng)評價方法，以一種平行同步的方式來評價對應于人類aB晶體蛋白的1-175殘基的肽與選定的靶蛋白之間的相互作用。在微孔板中排列的衍生聚乙烯針腳上合成肽。每個肽的長度為8個氨基酸，相鄰的肽偏移2個氨基酸。所有的肽都與塑料表面針腳共價連接。對于人類aB晶體蛋白，第一個固定化的肽是iMDIAIHHP8，最后一個肽是168PAVTAAPK175。在合成之后，使用含有2。/。牛血清蛋白(BSA)、0.1%吐溫-20和0.1%疊氮化鈉的10mMpH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在室溫下預包被針腳1小時。然后用10mMPBS洗滌3次，每次10分種。為篩選與肽結(jié)合的耙蛋白，將固定濃度的靶蛋白卩淀粉樣蛋白溶于含有0.05%吐溫-20的10mMPBS中，然后將其加入每個板孔中，室溫溫育1小時。針腳陣列用含有0.05%吐溫-20的10mMPBS洗滌3次，每次10分種。針對耙蛋白卩淀粉樣蛋白的單克隆或多克隆初級抗體在PBS緩沖液中稀釋后加入每個板孔，室溫溫育1小時。隨后，針腳陣列用含有0.05%吐溫-20的10mMPBS洗滌3次，每次IO分種?？辜彝美备^氧化物酶結(jié)合的二級抗體在PBS緩沖液中稀釋后加入每個板孔，室溫溫育1小時。針腳陣列用含有0.05%吐溫-20的1OmMPBS洗滌3次，每次10分種。加入無色的辣根過氧化物酶顯色底物3,3，，5，5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)(Pharmingen,SanDiego，CA)，反應45分種。表現(xiàn)陽性反應的針腳變成藍色。加入6N硫酸終止反應，顏色從藍色變?yōu)辄S色。使用酶標儀(BioTek，Winooski,VT)檢測450nm處的吸收度。對對應于人類aB晶狀體蛋白完整基本序列的總計84個肽篩選與靶蛋白(3淀粉樣蛋白的結(jié)合(表2)。有36個肽結(jié)合了靶蛋白p淀粉樣蛋白。針腳的再生是通過于6(TC下10分種的水槽(VWRAquasonic,WestChester,PA)聲裂法，水槽中裝有100mMPBS，其中含有1°/。十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1。/。2-巰基乙醇。接下來，針腳陣列用預熱到6(TC的去離子水沖洗三次，每次30分種，然后在預熱到60。C的去離子水中振蕩30分種。然后用6(TC甲醇洗滌15秒，空氣干燥后于-20。C保存待用。每個靶蛋白在人類aB晶狀體蛋白針腳陣列肽上檢測2-5次，來驗證結(jié)果的重復性。表2中編號為5、7、8、9、13、19、22、23、24、27、35、38、45、51、52、56、57、61、66、71、72、和79的肽在蛋白質(zhì)針腳陣列檢測中重復實驗呈陽性。表2:在蛋白質(zhì)針腳陣列中合成的人(xB晶狀體蛋白的連續(xù)8-mer的肽列表。第2列和第6列是肽序列。第3列和第7列是生產(chǎn)商提供的疏水性。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>28LRAPSWFD0.62973.1170SDGVLTVN0.37785.8529APSWFDTG0.56861.9271GVLTVNGP0.57737.8530SWFDTGLS0.64893.9672LTVNGPRK0.16866.0331FDTGESEM0.44880.9973VNGPRKQV0.04879.0232TGLSEMRL0.4888.0774GPRKQVSG-0.04809.9233LSEMRLEK0.16987.275RKQVSGPE-0.12881.9934EMRLEKDR-0.271058.2476QVSGPERT0.04854.9335RLEKDRFS-0.121032.1877SGPERTIP0.23837.9536EKDRFSVN-0.13976.0678PERTIPIT0.49■0937DRFSVNLD0.19947.0279RTIPITRE0.27967.1638FSVNLDVK0.44903.0480IPITREEK0.16967.1539VNLDVKHF0.46953.181ITREEKPA-0.02925.0740LDVKHFSP0.47924.0782REEKPAVT-0.1911.0441VKHFSPEE0.19954.0683EKPAVTAA0.19767.8942HFSPEELK0.25968.0984PAVTAAPK0.36735.89實施例2Intellipeptide在體外對pH誘導的[3淀粉樣蛋白聚集的影響對實施例1中所識別的aB晶體蛋白衍生的肽進行體外實驗來檢測其抑制pH誘導的(3淀粉樣蛋白(1-42)聚集的能力。卩淀粉樣蛋白(1-42)是與阿爾茨海默疾病有關(guān)的肽，在酸性條件(pH5.2)下聚集。在含有或不含實施例1中所識別的合成的肽以及pH5.2的酸性pH條件下使用常規(guī)方法進行聚集實驗。波長360nm下分光光度計檢測聚集的光散射。不含其他肽的聚集的(3淀粉樣蛋白被指定為100%的聚集，作為含有合成肽的聚集的標準。含有蛋白質(zhì)針腳陣列識別序列并被檢測其防止pH誘導的(3淀粉樣蛋白聚集的效力的三個肽能夠在體外重現(xiàn)性地防止P淀粉樣蛋白的聚集。這三個肽的序列分另'J為DRFSVNLDVKHFS、LTITSSLSDGV或HGKHEERQDE。圖2描述了每個肽對pH誘導的p淀粉樣蛋白聚集的影響。DRFSVNLDVKHFS(4%聚集)在pH5.2防止pH誘導的|3淀粉樣蛋白的聚集方面是最有效的。LTITSSLSDGV(15%聚集)(第4個條形柱)和HGKHEERQDE(30%聚集)(第5個條形柱)防止了pH(pH5.2)誘導的[3淀粉樣蛋白的聚集。這些數(shù)據(jù)表明，篩選aB晶狀體蛋白針腳陣列所識別的肽有能力減少卩淀粉樣蛋白的聚集。圖2顯示了Intellipeptide在體外對pH誘導的p淀粉樣蛋白聚集的影響。聚集被描繪成條形圖，算入了兩次實驗的標準偏差。第一個條形柱是可溶性卩淀粉樣蛋白在pH5.2下檢測到的光散射。第2個條形柱代表在不含任何其他肽或蛋白質(zhì)時，pH5.2下聚集的卩淀粉樣蛋白(100%聚集)。第3-5條形柱代表在分別含有DRFSVNLDVKHFS或LTITSSLSDGV或HGKHEERQDE時，pH5.2下的卩淀4分樣蛋白。DRFSVNLDVKHFS(4%聚集)在pH5.2防止pH誘導的p淀粉樣蛋白的聚集方面是最有效的。LTITSSLSDGV(15%聚集)(第4個條形柱)和HGKHEERQDE(30%聚集)(第5個條形柱)可在pH5.2抑制pH誘導的卩淀粉樣蛋白的聚集。實施例3Intdlipeptide在體外對Cu+++誘導的p淀粉樣蛋白聚集的影響對實施例1中所識別的aB晶體蛋白衍生的肽也進行了體外實驗來檢測其抑制01+++誘導的卩淀粉樣蛋白(1-42)聚集的能力。在含有或不含實施例1中所識別的合成的肽并含有100mMCiT+條件下使用常規(guī)方法進行聚集實驗。波長360nm下分光光度計檢測聚集的光散射。聚集的(3淀粉樣蛋白被指定為100%的聚集，作為含有合成肽的聚集的標準。含有蛋白質(zhì)針腳陣列識別序列并被檢測其防止01+++誘導的(3淀粉樣蛋白聚集的效力的三個肽能夠在體外重現(xiàn)性地防止P淀粉樣蛋白的聚集，如圖3所示。(3淀粉樣蛋白與野生型otB晶狀體蛋白或其肽的摩爾比為1:1-1:10時，DRFSVNLDVKHFS、LTITSSLSDGV和HGKHEERQDE在防止Cu化誘導的卩淀粉樣蛋白聚集方面的效果相當。當卩淀粉樣蛋白與野生型ctB晶狀體蛋白或其肽的摩爾比為10:1時，合成肽DRFSVNLDVKHFS、LTITSSLSDGV和HGKHEERQDE在防止01+++誘導的(3淀粉樣蛋白聚集方面效果較差。這些數(shù)據(jù)表明，篩選aB晶狀體蛋白針腳陣列所識別的肽有能力減少P淀4分樣蛋白的聚集，有力支持了這些肽在阿爾茨海默疾病治療中的應用。圖3顯示了Intellipeptide在體外對Cu+w誘導的卩淀粉樣蛋白聚集的影響。波長360nm下分光光度計檢測聚集的光散射。聚集的P淀粉樣蛋白被指定為100%的聚集，作為含有合成肽的聚集的標準。聚集被描繪成柱形圖，算入了兩次實驗的標準偏差。第l個條形柱是在含有100111^/@室溫)代表該肽與預熱Ph晶狀體蛋白的之間相互作用相對于未加熱pH晶狀體蛋白的增加或減少(繪制右側(cè)的黑色實心柱)?？傮w上，aB晶狀體蛋白肽與預熱(3h晶狀體蛋白之間的相互作用大于它與未加熱(3H晶狀體蛋白之間的相互作用。當yD晶狀體蛋白(晶狀體細胞質(zhì)的一種天然蛋白組成，來自與p晶狀體蛋白相同的基因家族)取代pH晶狀體蛋白作為針腳陣列的配體時，有12個活性序列被識別(圖14:條紋柱)。與未加熱的yD晶狀體蛋白在入=450nm處有最大吸光度的12個肽為JAIHHPWI,9WIRRPFFP16、21PFFPFHSP28、25DQFFGEHL32、43SLSPFYLR50、47FYLRPPSF54、52SFLRAPSW59、75FSVNLDVK82、"HGFISREFm、117EFHRKYRI124、l3,LTITSSLSb8和141GVLTVNGP148。檢測了aB晶狀體蛋白中相似的肽序列與預熱yD晶狀體蛋白在45。c相互作用15分鐘的最大吸光度(圖14:無填充的柱)。使用預熱YD晶狀體蛋白時，在84個aB晶狀體蛋白肽中，56個肽具有較高的吸光度(圖14:黑色實心柱)，16個肽具有較低的吸光度。剩余12個肽與未加熱和預熱的yD晶狀體蛋白之間相互作用的吸光度類似。與未加熱或預熱yD晶狀體蛋白之間具有最大吸光度的aB晶狀體蛋白肽的一側(cè)被一個或兩個具有較低吸光度的重疊肽所攻擊，生成了表觀峰。重疊的攻擊肽從最大吸光度的肽上向N末端活C末端移動兩個氨基酸。每個峰位吸光度差異((A45()nm@45°C-八45()鵬@231:)最大的肽列于表4:第3列。遠紫外圓二色譜表明，45。C加熱15分鐘所導致的yD晶狀體蛋白二級結(jié)構(gòu)損失<10%。在預熱的YD晶狀體蛋白的近紫外圓二色譜中，主要吸收峰的橢圓率的減小<25%(圖15b和16b)。圖14顯示了固定在針腳上的人類aB晶狀體蛋白的8-mer肽在23°c下與未加熱的yD晶狀體蛋白之間以及在45°c下與預熱的yD晶狀體蛋白之間人類aB晶狀體蛋白的8-mer肽的氨基酸序列。X軸列出了使用基于ELISA的比色法在450nm處測定的aB晶狀體蛋白肽與未加熱的晶狀體蛋白(條紋柱)或預熱的YD晶狀體蛋白(無填充的柱)之間相互作用的吸光度。柱的長度與上述相互作用的強度成正比，柱越長，相互作用越強。并非每個肽都有相互作用，并且與未加熱和預熱YD晶狀體蛋白之間相互作用的方式也不同。與預熱晶狀體蛋白之間相互作用的吸光度值<0.348時，被認為是非特異性相互作用的基線。大部分肽(56/84)與預熱yD晶狀體蛋白之間的相互作用大于與未加熱yD晶狀體蛋白之間的相互作用。檢測的每個肽的吸光度之間的差異(A45(^⑥45。c-八45。肺@室溫)代表該肽與預熱yD晶狀體蛋白的之間相互作用相對于未加熱晶狀體蛋白的增加或減少(繪制成黑色實心柱)?？傮w上，aB晶狀體蛋白肽與預熱丫D晶狀體蛋白之間的相互作用大于它與未加熱yD晶狀體蛋白之間的相互作用。實施例8aB晶狀體蛋白中針對乙醇脫氫酶(ADH)和檸檬酸合成酶(CS)的伴侶活性位點除了與P/Y晶狀體蛋白家族中生理學靶蛋白相互作用外，aB晶狀體蛋白肽與未加熱和預熱的分子伴倡耙蛋白-乙醇脫氬酶(ADH)和檸檬s吏合成酶(CS)之間的相互作用得到檢測。在應用于針腳陣列檢測之前，使用遠紫外圓二色譜測定了Ph晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、ADH和CS的二級結(jié)構(gòu)，測定條件分別為在23。c、在45。c加熱15分鐘之后和在50。c加熱60分鐘之后(圖15)。對于(3H晶狀體蛋白，全部3個溫度下的最大橢圓率(0max)出現(xiàn)在X=214nm處，而最大橢圓率(€)皿)的值從23。C的-5576deg.cm2.decimole"降低至45°C加熱15分鐘之后的-5043deg.cm2.decimole"，再降低至50。C加熱60分鐘之后的-4501deg.cm2.decimole"(圖15a)。類似的，對于YD晶狀體蛋白，全部3個溫度下的最大橢圓率(0mJ出現(xiàn)在X=217nm處，而最大橢圓率(max)的值從23°C的-5571deg.cm2.decimole"降低至45°C加熱15分鐘之后的-5150deg.cm2.decimole-1，再降低至50。C加熱60分鐘之后的-4719deg.cm2.decimole"(圖15b)。ADH的最大橢圓率(0皿)出現(xiàn)在X=215nm處，最大橢圓率(0,)的值從23。C的-51卯deg.cmldecimole-1降低至45。C加熱15分鐘之后的-5139deg.cm2.decimole",表明基于45^加熱的二級結(jié)構(gòu)損失<1%(圖15c)。ADH的最大橢圓率(On^)進一步降低至50。C加熱60分鐘之后的-2523deg.cm2.decimole",表明基于50卩加熱的二級結(jié)構(gòu)損失>50%(圖15c)。CS的最大橢圓率(G^ax)出現(xiàn)在X=215nm處，最大橢圓率(G)max)的值從23。C的-13076deg.cmldecimole"降低至45。C加熱15分鐘之后的畫l1070deg.cm2.decimole",表明基于45匸加熱的二級結(jié)構(gòu)損失<15%(圖15d)。CS的最大橢圓率(G)max)進一步降低至5(TC加熱60分鐘之后的-648deg.cm2.decimole"，表明基于50匸加熱的二級結(jié)構(gòu)損失>95%(圖15d)。圖15顯示了(3h晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、乙醇脫氫酶(ADH)和檸檬酸合成酶(CS)的遠紫外圓二色譜。匯集了pH晶狀體蛋白(A:左上)、yD晶狀體蛋白(B:右上)、ADH(C:左下)和CS(右下)在23°C、45。c和5(tc的圖譜。(3H晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白在23。c-50。c溫度范圍內(nèi)的紫外圓二色譜沒有大的變化。ADH在23。C和45t:下的紫外圓二色譜相似，而在50。C下，在215nm處的橢圓率明顯下降。CS在215nm處的橢圓率隨溫度升高(23-50°C)而降低。遠紫外圓二色語表明，pH晶狀體蛋白和YD晶狀體蛋白是熱穩(wěn)定性的并在50。C以下保持折疊，ADH在45°C以下保持折疊而在50。C則是未折疊的。CS是這四個分子伴侶靶蛋白中最不耐熱的，在45。C是未折疊的。因溫度升高而未折疊的量如下CS>>>ADH>|3H晶狀體蛋白iD晶狀體蛋白。在應用于針腳陣列檢測前，使用近紫外圓二色謙測定了卩h晶狀體蛋白、xD晶狀體蛋白、ADH和CS的三級結(jié)構(gòu)，測定條件分別為在23°C、在45。C加熱15分鐘之后和在50。C加熱60分鐘之后(圖16)。對于卩h晶狀體蛋白，23°(:下的最大吸收峰位于人=267nm處，267nm處的吸收峰值從23。C的30.71deg,cmldecimole"降低至45。C加熱15分鐘之后的24.22deg.cm2.decimole",表明在45。C下有部分未折疊，再降低至50。C加熱60分鐘之后的15.78deg.cm2.decimole",表明在50。C下有大量未折疊(圖16a)。對于丫D晶狀體蛋白，23"c下的最大吸收峰位于X-269nm處，269nm處的吸收峰值從23。C的17.26deg.cmldecimole-1降低至45。C加熱15分鐘之后的12.74deg.cm2.decimole"，表明在45。c下有部分未折疊，再降低至5(tc加熱60分鐘之后的6.75deg.cm2.decimole",表明在50。C下有大量未折疊(圖16b)。對于ADH,23。C下的最大吸收峰位于X-270nm處，270nm處的吸收峰值從23。C的44.27deg.cm2.decimole"降低至45。C加熱15分鐘之后的14.23deg.cm2.decimole",表明在45。C下有部分未折疊，再降低至50°C加熱60分鐘之后的-2.37deg.cm2.decimole",表明在50。C下有大量未折疊(圖16c)。對于CS,23。C下的最大吸收峰位于X二257nm處，257nm處的吸收峰值從23。c的42.54deg.cm2.decimole"降低至45。c加熱15分鐘之后的25.20deg.cm2.decimole",表明在45。C下有部分未折疊，再降低至50°c加熱60分鐘之后的20.95deg.cm2.decimole"，表明在50。C下有大量未折疊(圖16d)。圖16顯示了(3H晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、乙醇脫氫酶(ADH)和檸檬酸合成酶(CS)的近紫外圓二色譜。匯集了PH晶狀體蛋白(A:左上)、fD晶狀體蛋白(B:右上)、ADH(C:左下)和CS(右下)在23°C、45。c和50°c的圖譜。在pH晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、乙醇脫氫酶(ADH)和檸檬酸合成酶(CS)的近紫外圓二色語中，吸收峰的橢圓率在45。C加熱15分鐘后降低了20-60%。aB晶狀體蛋白與未加熱和預熱的ADH在人=450nm處檢測的吸光度圖式類似于aB晶狀體蛋白與未加熱和預熱的pH/yD晶狀體蛋白測得的吸光度圖式(圖17)。當ADH作為針腳陣列檢測中的配體時，測定了下述aB晶狀體蛋白肽序列的最大吸光度9WIRRPFFP16、13PFFPFHSP20、27FFGEHLLE34、37LFPTSTSL44、43SLSPFYLR50、48LRPPSFLR55、69RLEKDRFS76、75FSVKLDVK82、115SREFHRKY122、131LTITSSLS138、^GVLTVNGP,48和157RTIPITRE164。當ADH在45。c預熱15分鐘后，在7884個aB晶狀體蛋白肽中，有34個肽的吸光度升高(八450畫@45°。-A450nm@23°C>0)，而其他50個肽與預熱和未加熱的ADH之間相互作用的吸光度類似(A45(Mm⑨45。C-A45。nm@23°C~0)?；钚噪男蛄信c預熱和未加熱ADH的吸光值差異(A45o腦⑥45。C-A4in^23。C)是一個量度，指示了該肽大吸光值差異(A450nm⑥45。C-A450nm@23°C;^OlB晶狀體蛋白肽的一側(cè)接受一個或兩個具有較低吸光度差異的重疊肽的攻擊，生成了表觀峰。重疊的攻擊肽在最大吸光度的肽上從高峰肽向N末端活C末端移動兩個氨基酸。每個峰位吸光度差異((A45。nm@45°C-A45。nm(^"r)最大的肽列于表4:第4列。結(jié)果證實，人類aB晶狀體蛋白與預熱的ADH之間的相互作用要大于與未加熱的天然ADH之間的相互作用。圖17顯示了人類aB晶狀體蛋白肽與ADH之間相互作用的圖式。Y軸列出了順序固定在96孔板的8-mer肽的氨基酸序列。每個肽與預熱的、部分變性的ADH和與未加熱的天然ADH的吸光度之間的差異(A45。nm@45°C-八45(^@室溫)代表該肽與預熱部分變性的ADH之間的相互上的水平柱。84個肽中，有34個肽與預熱的部分變性ADH之間的相互作用大于與天然ADH之間的相互作用，而剩余50個肽與變性ADH或天然ADH之間的相互作用類似。(xB晶狀體蛋白肽與預熱的未折疊ADH之間的相互作用大于與未加熱的天然ADH之間的相互作用。吸光度差異(A45。nm@45°C-八450腦@室溫)小于0.05'被視為基線。ctB晶狀體蛋白與未加熱和預熱的CS在X=450nm處檢測的吸光度圖式類似于aB晶狀體蛋白與未加熱和預熱的Ph"D晶狀體蛋白測得的吸光度圖式(圖18)。當CS作為針腳陣列檢測中的靶蛋白時，測定了下述IO個人類aB晶狀體蛋白肽序列的最大吸光度9WIRRPFFP16、23FPFHSPSR30、43SLSPFYLR50、47FYLRPPSF54、55LRAPSWFD62、75FSVNLDVK82、113FISREFHRI20、131LTITSSLS138、wLTVNGPRK，和57RHPITRE164。與預熱和未加熱CS的吸光值之間差異(A45。nm⑥45。C-A45o腦⑥23。C)最大的aB晶狀體蛋白肽的一側(cè)接受一個或兩個具有較低吸光值差異的重疊肽的攻擊，生成了表觀峰。重疊的攻擊肽在最大吸光度的肽上從高峰肽向N末端活C末端移動兩個氨基酸。每個肽與部分未折疊CS和與天然CS的吸光度之間的差異(A450nm⑨45。C_A45()^⑥23。C)代表該肽與預熱的未折疊CS之間的相互作用相對于該肽與未加熱的天然cs之間相互作用的增加。當cs在45。C下預熱15分鐘后，在84個aB晶狀體蛋白肽中，有72個肽與預熱部分變性CS之間的相互作用有所增加(A4，n^45。C-A450nm@23°C〉0),而剩余12個肽與天然CS或部分未折疊CS之間的相互作用類似(八45()11111@45°C-A45。nm@23°C~0)。每個峰位吸光度差異((A45。nm@45。C-A45tom@23°C)最大的肽列于表4:第5列。肽與預熱的CS的吸光值的增加表明，人類aB晶狀體蛋白與預熱的部分未折疊CS之間的相互作用要大于與未加熱的天然CS之間的相互作用。圖18顯示了人類aB晶狀體蛋白肽與CS之間相互作用的圖式。Y軸列出了順序固定在96孔板的8-mer肽的氨基酸序列。每個肽與預熱的、部分變性的CS和與未加熱的天然CS的吸光度之間的差異(A4，m⑨45。C-八450腦@室溫)代表該肽與預熱的部分變性CS之間的相互作用相對于該肽與未加熱的天然CS之間相互作用的增加或減少，被繪制為X軸上的水平柱。84個肽中，有72個肽與部分變性的CS之間的相互作用強于與天然作用類似、。aB晶狀體蛋:白肽與預熱的未折疊CS之l'曰;的相互作用大于與未加熱的天然CS之間的相互作用。吸光度差異(A45()nm@45°C-A45。,)m(g室溫)小于0.11被^L為基線。表4:在含有未加熱的和預熱的|3h晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白、ADH和cs時，具有最大吸收的aB晶狀體蛋白肽<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>第1列列出了aB晶狀體蛋白中的分子伴侶序列所屬結(jié)構(gòu)域。第2列列出了aB晶狀體蛋白中針對人類pH晶狀體蛋白的活性序列。第3列列出了aB晶狀體蛋白中針對人類YD晶狀體蛋白的活性序列。第4列列出了aB晶狀體蛋白中針對ADH的活性序列。第5列列出了aB晶狀體蛋白中針對CS的晶狀體蛋白肽分子伴倡序列。第6列列出了與3個或更多預熱的分子伴侶靶蛋白相互作用的7個共有分子伴侶序列。aB晶狀體蛋白中負責分子伴侶功能的7個活性序列9WIRRPFFPFHSP20、43SLSPFYLRPPSFLRAP58、75FSVNLDVK82、113FISREFHR12()、131LTITSSLS138、^GVLTVNGPw8和15710^1丁11￡164被鑒定為與經(jīng)過45。C預熱15分鐘的分子伴估輩巴蛋白ADH和CS以及生理蛋白卩h/VD晶狀體蛋白之間相互作用最強的序列(表4:第6列)。2個伴侶活性序列位于N末端結(jié)構(gòu)域，4個活性序列是保守的a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域中的非重疊分子伴倡序列，1個非重疊分子伴侶序列位于aB晶狀體蛋白中的C末端延伸結(jié)構(gòu)域。實施例9活性序列的分子伴倡活性檢測位于a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的2個aB晶狀體蛋白序列73DRFSVNLDVKHFS84p131LTITSSLSDGV141在針腳陣列中發(fā)現(xiàn)與預熱的靶蛋白之間具有陽性相互作用，合成這兩個序列來測定它們的體外分子伴侶活性。肽的分子伴倡活性是檢測它們防止卩h晶狀體蛋白、ADH和CS這三個分子伴侶靶蛋白熱聚集的能力，分子侶活性檢測在50。C下進行(圖19)。非活性aB晶狀體蛋白序列川HGKHEERQDE，作為分子伴侶測定中的陰性對照(圖19)?；诮瓦h紫外圓二色譜，當Ph晶狀體蛋白、ADH和CS在50。C下預熱60分鐘后，這3個靶蛋白未折疊排序為CS〉》ADH》Ph晶狀體蛋白(圖15和16)。在含有和不含每個肽時，卩h晶狀體蛋白、ADH和CS的熱聚集被測定為X=340nm處的光散射。每個肽的伴侶活性被計算為保護百分比，其中不含任何肽的每個靶蛋白的聚集被設為0%保護(圖19)。活性肽序列73DRFSVNLDVKHFS85和^LTITSSLSDGV^是全部3個分子伴侶靶蛋白的有效聚集抑制劑。發(fā)現(xiàn)對靶蛋白CS有最大的保護，CS在50。C下加熱后的未折疊最多。發(fā)現(xiàn)部分未折疊的靶蛋白(3h晶狀體蛋白和adh有較少的保護。肽j3h晶狀體蛋白/ADH的摩爾比為50:1時，對(3h晶狀體蛋白和ADH產(chǎn)生保護均為約30%;而肽CS的摩爾比為10:1時，能防止70%以上的CS熱聚集。即使以50:1的摩爾比，對照肽川HGKHEERQDE，也沒有防止聚集。圖19顯示了兩個陽性活性序列73DRFSVNLDVKHFS85和131LTITSSLSDGV141以及一個來自人類aB晶狀體蛋白的a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的非活性序列mHGKHEERQDE12D(對照)的分子伴侶活性檢測。A(左上)不含肽的分子伴侶靶蛋白Ph晶狀體蛋白、ADH和CS的熱聚集被測定為X=340nm下的光散射。每個耙蛋白在不含或含有一個肽時在50。C下加熱60分鐘。通過近和遠紫外圓二色譜發(fā)現(xiàn)，聚集量與未折疊的量有關(guān)。三個靶蛋白中最耐熱的Ph晶狀體蛋白聚集最少，60分鐘內(nèi)的最大吸光度為0.05AU,然后是ADH和CS，最大吸光度分別為0.23AU和0.72AU(未折疊量/聚集量CS〉ADH〉Ph晶狀體蛋白)。每個肽的分子伴侶活性被計算為保護百分比，其中每個革巴蛋白在不含任何肽時的聚集被設為0%保護。在體外檢測了73DRFSVNLDVKHFS85、131LTITSSLSDGV141和川HGKHEERQDE，防止卩h晶狀體蛋白(B:右上)、ADH(C:左下)和CS(D:右下)熱聚集的能力。肽靶蛋白摩爾比為50:1的兩個陽性肽產(chǎn)生了對Ph晶狀體蛋白和ADH的中度保護，而對照肽沒有保護能力。肽靶蛋白摩爾比為10:1的73DRFSVNLDVKHFS85和131LTITSSLSDGV141足以顯著防止CS的聚集。對照肽川HGKHEERQDE，具有部分防止CS聚集的作用。實施例10為人類aB晶狀體蛋白的立體結(jié)構(gòu)描繪分子伴侶的位置根據(jù)電子自旋共振(ESR)和同一性模擬數(shù)據(jù)(圖20)，推測出蛋白質(zhì)針腳陣列所識別的在人類aB晶狀體蛋白中負責分子伴侶功能的活性結(jié)構(gòu)域的7個序列的二級結(jié)構(gòu)。N末端結(jié)構(gòu)域中的9WIRRPFFPFHSP2o、a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的環(huán)部的113FISREFHR12()和C末端結(jié)構(gòu)域中的!57RTIPITREi64是非結(jié)構(gòu)化基序，而43SLSPFYLR50(a3)和47FYLRPPSF54(a4)形成了N末端結(jié)構(gòu)域中的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序。其他肽75FSVNLDVK82(|33)、131LTITSSLS138(卩8)和141GVLTVNGP148(卩9)形成了a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域中的3個p折疊股基序(圖20)。圖20顯示了使用人aB晶狀體蛋白針腳陣列檢測所識別的肽與之前報道的aB晶狀體蛋白活性序列之間的比較。盒內(nèi)的序列是利用蛋白質(zhì)針腳陣列所確定的對伴侶活性重要的活性結(jié)構(gòu)域?；疑幱皡^(qū)是通過蛋白質(zhì)針腳陣列所確定的亞基-亞基相互作用的位置。改變了人aB晶狀體蛋白的分子伴侶功能的位點特異性突變顯示在被取代或刪除的殘基下方(A)。圖中顯示了通過ESR和同一性模擬所預測的aB晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu)，~代表單環(huán)，-代表卩折疊股(Ghosh和Clark,ProteinSci14:684-95，2005;GuruprasadandKumari,IntJBiolMacromol33:107-12,2003;Koteiche等人，Biochemistry37:12681-8,1998)。所有報道的對aB晶狀體蛋白的伴侶活性有影響的點突變與針腳陣列檢測所識別的負責分子伴侶功能的共有序列相重疊。所述序列顯示為斜體(Sreelakshmi等人，Biochemistry43:15785-95,2004)將所發(fā)現(xiàn)的活性結(jié)構(gòu)域繪制成aB晶狀體蛋白的計算機立體同源模型，來識別活性分子伴估序列的立體結(jié)構(gòu)(圖21a)。生成經(jīng)過空間填充的人類aB晶狀體蛋白模型來觀察并分析aB晶狀體蛋白中負責分子伴侶功能的活性結(jié)構(gòu)域(圖21b)。(33、p8和(39這三個活性序列似乎形成了a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的外表面，a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域是一個類似免疫球蛋白樣折疊的(3夾心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是小熱激蛋白的特征。內(nèi)部導向的B折疊股殘基穩(wěn)定了卩夾心的結(jié)構(gòu)。外部導向的側(cè)鏈促成了與分子伴侶靶蛋白之間的相互作用。N末端和C末端中的殘基似乎沒有直接參與a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)。核心結(jié)構(gòu)域序列U3FISREFHR，形成了環(huán)部的一部分，該所述環(huán)部連接核心結(jié)構(gòu)域的兩個(3折疊且有助于其結(jié)構(gòu)的完整性。N末端活性序列的暴露殘基的可及表面區(qū)域被計算為有71%的疏水性，C末端延伸結(jié)構(gòu)域有69%是疏水性的，a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域有64%是疏水性的?；钚孕蛄惺杷员砻娴谋壤蟂HSP分子伴侶對未折疊蛋白識別過程中疏水性相互作用的重要性(Sharma等人,JBiolChem275:3767-71,2000;Sharma等人,BiochemBiophysResCommun239:217-22,1997;Sharma等人,JBiolChem273:15474-8，1998;Sharma等人，JBiolChem273:8965-70:1998;Singh和RaoCh,FEBSLett527:234-8,2002;Srinivas等人，MolVis7:114-9,2001;Rajaraman等人，F(xiàn)EBSLett497:118-23,2001)。圖21顯示了aB晶狀體蛋白活性結(jié)構(gòu)域的立體圖。針腳陣列所識別的人類(xB晶狀體蛋白的活性結(jié)構(gòu)域為紅色，而非活性結(jié)構(gòu)域為藍色。A(左)人類aB晶狀體蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的帶狀圖。序列9WIRRPFFPFHSP20、113FISREFHR120和157RTIPITRE164不具有二級結(jié)構(gòu)。序歹'J43SLSPFYLRPPSFLRAP58形成了a3-轉(zhuǎn)角-a4基序，而序列75FSVNLDVK82、131LTITSSLS138、^GVLTVNGP,48分別形成了卩折疊股基序卩3、(38和|39。B(右)人類aB晶狀體蛋白立體結(jié)構(gòu)的實體模型。活性結(jié)構(gòu)域9WIRRPFFPFHSP2。、43SLSPFYLRPPSFLRAP58、75FSVNLDVK82、113FISREFHR120、131LTITSSLS138、141GVLTVNGP148*157RTIPITRE164中的溶劑可及性殘基表面為^^分色。aB晶狀體蛋白非活性結(jié)構(gòu)域中的殘基表面為灰色。N末端序列9WIRRPFFPFHSP2o和43SLSPFYLRPPSFLRAPs8的全部可及性表面的72%是疏水性的。A晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域序列75FSVNIX)VK82(卩3)、131mTSSLS138(卩8)和14IGVLTVNGP148(卩9)的全部可及性表面的67%是疏水性的。環(huán)部序列U3FISREFHR42。有61%是疏水性的，C末端延伸序列^RTIPITRE,64有59%是疏水性的。實施例11具有分子伴侶活性的人類aB晶狀體蛋白的活性多肽序列小熱激蛋白(sHSP)是一個彈性蛋白家族，是分子量為43kDa以下的分子伴侶，含有長度和基本序列可變的N末端結(jié)構(gòu)域、保守的a晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域和C末端延伸結(jié)構(gòu)域，C末端延伸結(jié)構(gòu)域含有高度保守的I-X-I/V氨基酸基序。在本研究中，蛋白質(zhì)針腳陣列使用內(nèi)源性靶蛋白pH/yD晶狀體蛋白和非生理性靶蛋白ADH和CS,識別了對人類aB晶狀體蛋白的分子伴侶活性重要的7個活性序列9WIRRPFFPFHSP20、43SLSPFYLRPPSFLRAP58、75FSVNLDVK82、113FISREFHR120、131LTITSSLS138、^GVLTVNGPw8和157RTIPITRE164。盡管，aB晶狀體蛋白與天然(3h晶狀體蛋白和YD晶狀體蛋白之間相互作用(需要二級結(jié)構(gòu))可能逃避蛋白質(zhì)針腳陣列的檢測，但是針腳陣列識別了在(xB晶狀體蛋白與天然Ph晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白之間相互作用中涉及的大多數(shù)序列。針腳陣列所識別的活性序列不是人類aB晶狀體蛋白針腳陣列中最具疏水性的肽。根據(jù)生產(chǎn)商提供的疏水性值，活性肽9WIRRPFFPFHSP20、43SLSPFYLRPPSFLRAP58和131LTITSSLS138的疏水性很強。人類aB晶狀體蛋白針腳陣列中的14個非活性肽比其余的活性肽75FSVNLDVK82、113FISREFHR12G、141GVLTVNGP148和157RTIPITRE164疏水性更強(Ghosh和Clark,ProteinSci14:684-95，2005)。遠紫外圓二色譜分析表明，Ph晶狀體蛋白和YD晶狀體蛋白在45。C加熱15分鐘后二級結(jié)構(gòu)損失<10%。但是，(3h晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白在遠紫外圓二色譜圖中的吸收峰值下降20-25%，這表明了這些蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象變化。當遠紫外圓二色譜測定Ph晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白不存在明顯未折疊和二級結(jié)構(gòu)損失時，活性aB晶狀體蛋白肽與預熱的(3h晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白之間的相互作用增加，這表明aB晶狀體蛋白活性結(jié)構(gòu)域;險測到了三級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象變化，這種變化產(chǎn)生于預熱的Ph晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白。針腳陣列在檢測未折疊蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中的擾動方面與近紫外圓二色譜一樣靈敏。在7個伴倡序列中，2個位于N末端，4個位于保守的a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域，1個位于含有高度保守的I-X-I/V氨基酸基序的C末端延伸結(jié)構(gòu)域。針腳陣列結(jié)果表明，活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的點突變預期會改變aB晶狀體蛋白的伴侶活性，而活性結(jié)構(gòu)域外的點突變預期對伴侶活性影響很小或沒有影響。雖然目前還沒有報道關(guān)于使用針腳陣列所識別的序列基序的系統(tǒng)性研究，但文獻結(jié)果表明，針腳陣列所識別的序列對于人類aB晶狀體蛋白的分子伴侶樣活性而言是重要的(Muchowski等人.，JMolBiol289:397-411，1999;Gupta和Srivastava,InvestOphthalmolVisSci45:206-14,2004;Liao等人，BiochemBiophysResCommun297:309-16，2002;Kumar等人，JBiolChem274:24137-41,1999;Horwitz等人,IntJBiolMacromol22:263-9，1998;Plater等人,JBiolChem271:28558-66,1996;Derham等人,EurJBiochem268:713-21，2001)。與完整長度的aB晶狀體蛋白相比，aB晶狀體蛋白的突變(其中，C末端延伸結(jié)構(gòu)域的缺失包括精氨酸157)導致了體外伴侶活性的降低(Thampi和Abraham,Biochemistry42:11857-63,2003)。精氨酸157存在于針腳陣列所識別的,57RTIPITRE,64分子伴侶序列中。對aB晶狀體蛋白截斷變異體(aB晶狀體蛋白57-157)的X射線溶液散射表明，在不含N末端和C末端延伸結(jié)構(gòu)域時，a晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域形成了二聚體，在體外的分子伴侶樣活性比完整aB晶狀體蛋白相比有所降低(Feil等人，JBiolChem276:12024-9,2001)。當合成a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的兩個共有分子伴侶序歹'J73DRFSVNLDVKHFS85和131LTITSSLSDGV141，并在體外測試其防止伴侶靶蛋白(3H晶狀體蛋白、ADH和CS的未折疊和熱聚集的能力時，發(fā)現(xiàn)有實質(zhì)上的保護作用。分子伴侶活性檢測證實，針腳陣列所識別的序列對于aB晶狀體蛋白的分子伴侶活性是重要的并與早期的研究相一致，在早期研究中，疏水性探針和伴侶活性;險測將aB晶狀體蛋白73DRFSVNLDVK82識別為分子伴侶活性序列(Sharma等人.，JBiolChem279:6027-34,2004)。在aB晶狀體蛋白的活性序列中選擇的點突變或組合突變預期會提高或降低伴侶活性。與防止CS聚集所需濃度相比較，這兩個肽需要有更高的濃度來防止Ph晶狀體蛋白和ADH的聚集。圓二色譜分析表明，50。C下，PH晶狀體蛋白部分未折疊，而ADH和CS都幾乎是完全未折疊。總而言之，伴侶活性檢測和圓二色譜數(shù)據(jù)表明，肽在防止完全未折疊的蛋白質(zhì)聚集中比防止部分折疊或天然蛋白質(zhì)聚集更加有效。使用針腳陣列所識別的活性序列被繪成aB晶狀體蛋白的立體模型，來分析分子伴侶界面的局部結(jié)構(gòu)(Ghosh和Clark,ProteinSci14:684-95,2005)。在缺乏X射線晶體或NMR結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)計算的aB晶狀體蛋白同源模型與MjsHSP16.5和小麥sHSP16.9的晶體結(jié)構(gòu)有顯著的重疊，a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的Ca標準差為2.06A(Kim等人，Nature394:595-9,1998;vanMontfort等人.,NatStructBiol8:1025-30,2001)。根據(jù)電子順磁共振數(shù)據(jù)(EPR)以及人類aB晶狀體蛋白與小麥sHSP16.9和MjsHSP16.5晶體結(jié)構(gòu)之間的多重序列比對，推測出針腳陣列所識別的活性序列的二級結(jié)構(gòu)(Kim等人,Nature394:595-9，1998;vanMontfort等人,NatStructBiol8:1025-30,2001;Koteiche和McHaourab,JMolBiol294:561-77，1999;Koteiche等人，Biochemistry37:12681-8,1998)。N末端分子伴倡序列9WIRRPFFPFHSP2o是非結(jié)構(gòu)化的并形成一個具有70%疏水性的表面，而序列43SLSPFYLRPPSFs4形成了螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序，其外表面具有72%的疏水性并有利于結(jié)合未折疊蛋白的暴露的小塊疏水性表面。a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的4個序列中的3個序列一75FSVNLDVK82((53)、mLTITSSLSi38(p8)和,4,GVLTVNGPw8((39)是p折疊股，形成了具有67%疏水性的表面。含有高度保守的I-X-I/V基序的C末端分子伴侶序列i57RTIPITREw是非結(jié)構(gòu)化的并形成了具有59%疏水性的表面。該報道中確定的分子伴侶序列43SLSPFYLRPPSF54、75FSVNLDVK82、131LTITSSLS138、^GVLTVNGP,48和，57RTIPITRE^與之前使用蛋白質(zhì)針腳陣列確定為aB晶狀體蛋白中亞基-亞基相互作用位點的序列顯著重疊(圖20:陰影殘基)(Ghosh和Clark,ProteinSci14:684-95,2005)。針腳陣列所識別的序列43SLSPFYLRPPSFs4是序列42TSLSPFYLRPPSFLRA57的亞基，之前被報道為aB晶狀體蛋白中與人類(xA晶狀體蛋白相互作用的活性結(jié)構(gòu)域(Sreelakshmi等人.，Biochemistry43:15785-95,2004;Lentze和Narberhaus,BiochemBiophysResCommun325:401-7,2004)。防止|3H晶狀體蛋白、ADH和CS聚集的兩個合成肽73DRFSVNLDVKHFS85和t3山TITSSLSDGV^之前都被識別為負責aB晶狀體蛋白中亞基-亞基相互作用的活性序列(Ghosh和Clark,ProteinSci14:684-95,2005)。這些結(jié)果表明，aB晶狀體蛋白中的活性序列在亞基組裝和伴侶功能中具有雙重作用，這與之前的突變數(shù)據(jù)一致，其中伴侶功能的損失伴隨著組裝大小的減少(Saha和Das,Proteins57:610-7，2004;Fdl和Augustin,BiochemBiophysResCommun247:38-45,1998)。通過針腳陣列對aB晶狀體蛋白中負責亞基-亞基相互作用和伴侶活性的共有序列的識別表明，那些能結(jié)合未折疊伴侶靶蛋白的分子伴倡序列的暴露可能需要aB晶狀體蛋白復合物的分解。這種假設符合之前關(guān)于寡聚平衡在調(diào)節(jié)HSP27和aB晶狀體蛋白分子伴侶活性中的作用的研究(Shashidharamurthy等人，JBiolChem280:5281-9,2005;Srinivas等人,MolVis11:249-55，2005)。Shashidhammurthy等人報道，與去穩(wěn)定的T4溶菌酶突變抹之間的相互作用需要HSP27寡聚物的分解(Shashidharamurthy等人，JBiolChem280:5281-9,2005)。Srinivas等人報道，鹽酸精氨酸通過增加亞基-亞基動力而提高了aB晶狀體蛋白的分子伴估活性(Srinivas等人，MolVis11:249-55,2005)。C.e/egam的小熱激蛋白(sHSP12.2、sHSP12.3和sHSP12.6)中缺乏類似于aB晶狀體蛋白N末端和C末端分子伴倡序列9WIRRPFFPFHSP20、43SLSPFYLRPPSFLRAP58和157RTIPITRE164的活性序列，這可以解釋C.e/eg"m的小熱激蛋白在體外缺乏分子伴侶樣活性的原因(Kokke等人，F(xiàn)EBSLett433:228-32,1998)。由a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的肽75FSVNLDVK82(P3)、I31LTITSSLS138(P8)、U1GVLTVNGP14S((39)形成的界面之前被針腳陣列識別為負責人類aB晶狀體蛋白亞基組裝的界面，所述肽與全部四種分子伴侶靶蛋白相互作用并一起形成了具有67%疏水性的外表面(Ghosh和Clark,ProteinScil4:684-95,2005)。該界面為疏水性和親水性的相互作用都提供了天然蛋白質(zhì)((xA和aB晶狀體蛋白)以及未折疊的分子伴侶靶蛋白①H晶狀體蛋白、yD晶狀體蛋白)。a晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)在小熱激蛋白家族中是高度保守的，其他小熱激蛋白中與aB晶狀體蛋白伴侶序列75FSVNLDVKS2、113FISREFHR120、131LTITSSLS138、141GVLTVNGP148同源的序列預期會參與其他小熱激蛋白的伴侶功能?？傊?，針腳陣列、體外分子伴倡活性檢測和靶蛋白的圓二色i普識別了在完整aB晶狀體蛋白中負責與廣泛耙蛋白相互作用的序列，所述靶蛋白包括那些幾乎完全未折疊的蛋白(ADH和CS)和那些部分未折疊的蛋白(PH晶狀體蛋白和yD晶狀體蛋白)。蛋白質(zhì)針腳陣列有效識別了人類aB晶狀體蛋白中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域，它們在寡聚物組裝以及與未折疊的分子伴侶靶蛋白相互作用中是重要的。對包括人類sHSP27和結(jié)核分支桿菌(M少cok^fen'wmft^e/rw/a^)sHSP16.3在內(nèi)的生理學相關(guān)的小熱激蛋白中活性結(jié)構(gòu)域的特定序列和立體結(jié)構(gòu)的進一步研究，將提供新的關(guān)于sHSP和分子伴侶在疾病中功能的信息。目前的結(jié)果表明，sHSP對蛋白質(zhì)未折疊的共同反應涉及幾個活性結(jié)構(gòu)域，sHSP對蛋白質(zhì)未折疊是相當敏感的。這88些結(jié)果可以說明小熱激蛋白的選擇性和靈敏性以及它們對特定細胞需求的適應性和對應激的反應。實施例12aB晶狀體蛋白和5個aB晶狀體蛋白衍生的肽對A(3或YD晶狀體蛋白纖維化的影響。^磁碌,r,i。在含有和不含aB晶狀體蛋白和肽情況中，在類似于之前描述的含有aB晶狀體蛋白時的條件下培養(yǎng)Ap原纖維(Bakthisaran等人,BiochemJ,2005)。肽在三氟乙醇(TFE)中溶解至9.1mM，然后在50mMPBS(lOOmMNaCl,pH7.4)中稀釋為0.91mM的分子伴估肽貯存液。將3.5mg硫磺素T溶于lOO(al的50mM甘氨酸溶液(pH8.5)中。制備lmg/ml(0.22mM)的A(3貯存液。將20|ilA卩貯存液、50pl分子伴侶肽貯存液、2pl硫磺素T溶液與28(il的50mMPBS(100mMNaCl，pH7.4)混合。使用BeckmanCouWerDTX880多方式檢測器讀取熒光。樣品在50°C下加熱72小時后再次進行熒光檢測。yD^炎沐蛋^磁湊#r^^￡。采用與y晶狀體蛋白相同的方式形成yd晶狀體蛋白原纖維(Meehan等人,JBiolChem279:3413-3419,2004)。于TFE中將肽溶解成9.1mM,并在10%TFE(pH2.0)中稀釋成0.91mM的分子伴侶肽貯存液。將3.5mg錄i/黃素T溶于100^1的50mM甘氨酸溶液(pH8.5)中。制備lmg/ml(0.22mM)的A(3貯存液。將20WAp貯存液、5(1l分子伴倡肽貯存液、2(1l硫磺素T溶液與73)il的10%TFE(pH2.0)混合制成。使用BeckmanCoultierDTX880多方式檢測器讀取熒光。樣品在5(TC下加熱72小時后再次進行熒光一企測。為、子伴估;^^^W。使用之前建立的方法(有小的調(diào)整)對5個肽進行分子伴侶活性檢測(Muchowski等人，JMolBiol289:397-411，1999)。分子伴侶靶蛋白的1:1的單體摩爾比被確定為最佳比例，所有隨后的卩3變異體的分子伴侶活性檢測都以該比例在96孔ELISA微孔板中重復3次。0.1摩爾的分子伴侶和(^晶狀體蛋白在總體積為20(^l的緩沖液(5mMPBS,pH7.0)中混合。加熱前(時間=0),使用MCC/340讀板器測定A^340nm處的光散射。第一次讀板后，孔板在50。C下加熱1小時，期間每隔15分鐘讀板一次。表5顯示了在不含或含有野生型(xB晶狀體蛋白和5個(xB晶狀體蛋白衍生肽時，A(3或yD晶狀體蛋白的熒光。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>圖22顯示了aB晶狀體蛋白和5個aB晶狀體蛋白衍生肽對A卩纖維化的影響。A卩纖維化被檢測為溶液中熒光染料硫磺素T的熒光，所述溶液中含有的a(3:肽的單體摩爾比為1:10。當不含a(3原纖維時，硫磺素t很少或沒有熒光。在不含任何其他分子時，與A卩原纖維結(jié)合72小時后的硫磺素t的萸光被設定為100%。dr肽對a(3纖維化的影響最強，hg肽對Ap纖維化的影響最弱。纖維形成=△^A(3(含分子伴侶)*100/△nA卩(不含分子伴侶)。圖23顯示了aB晶狀體蛋白和5個aB晶狀體蛋白衍生肽對yD晶狀體蛋白纖維化的影響。YD晶狀體蛋白纖維化被檢測為溶液中熒光染料硫磺素t的熒光，所述溶液中含有的yD晶狀體蛋白肽的單體摩爾比為1:10。當不含原纖維時，硫磺素很少或沒有熒光。在不含任何其他分子時，與yD晶狀體蛋白原纖維結(jié)合72小時后的硫>璜素T的熒光被設定為100%。ST肽對yD晶狀體蛋白纖維化的影響最強，野生型(xB晶狀體蛋白對yD晶狀體蛋白纖維化的影響最弱。纖維形成=△晶狀體蛋白(含分子伴侶)"00/A狄yD晶狀體蛋白(不含分子伴侶)。圖24顯示了5個aB晶狀體蛋白衍生肽的分子伴侶活性檢測。這些肽抑制(3L晶狀體蛋白熱聚集的能力被分光光度測定為溶液在？^340nm處的光散射，溶液中含有的靶蛋白肽的單體摩爾比為1:10。在不含(3l晶狀體蛋白時，肽的光散射與單獨的緩沖液相類似，這表明肽在加熱后沒有聚集。HG肽對^晶狀體蛋白聚集的影響最強，ST肽對(3l晶狀體蛋白聚集的影響最弱。DR肽、LT肽和ER肽的分子伴倡活性與HG相同或稍微低一些。本發(fā)明說明書使本領域技術(shù)人員能夠在不背離本發(fā)明的精神和范圍和無本文所述的預期實驗結(jié)果的情況下于寬范圍的等效參數(shù)、濃度和條件下實施本發(fā)明。雖然本發(fā)明的描述中結(jié)合了一些特定實施方案，但可以理解，這些實施方案還能夠進一步改進。本申請意在覆蓋根據(jù)本發(fā)明的原則對本發(fā)明進行的任何改變、應用或改進，包括利用本發(fā)明所屬領域內(nèi)已知或慣用的手段并可應用于下文所述權(quán)利要求范圍內(nèi)的必要技術(shù)特征而對本發(fā)明公開內(nèi)容估支出的偏離。本文引用的所有參考文獻，包括雜志文章或摘要、公開的或相應的美國或外國專利申請、授權(quán)的美國或外國專利或任何其他參考文獻，都以引用的方式整體并入文本，包括所引用文獻中全部的數(shù)據(jù)、表格、附圖和文字。另外，本文引用的參考文獻中所引用的參考文獻的全部內(nèi)容也以引用方式整體并入本文。權(quán)利要求1.一種多肽，其為X1-WIRRPFFPFHSP-X2、X1-WIRRPFFP-X2、X1-PFFPFHSP-X2、X1-FPFHSPSR-X2、X1-DQFFGEHL-X2、X1-FFGEHLLE-X2或X1-IAIHHPWI-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中，X1和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50，并且X1和X2中的n可以相同或不同。2.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述功能性變異體或模擬物為保守性氨基酸取代或擬肽取代。3.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序歹'j與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-乂2、X廣FPFHSPSH-X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廠FFGEHLLE-X2或X廣IAIHHPWI-X2相同。4.一種多肽，其為X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYL尺-乂2、5d-FYLRPPSF-乂2、}d-IJlPPSFIJl-X2、X廣PPSFLRAP-X2、X廣SFLRAPSW-X2、X廣LRAPSWFD-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中，X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50，并且X,和X2中的n可以相同或不同。5.權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述功能性變異體或模擬物為保守性氨基酸取代或擬肽取代。6.權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氛基酸序歹'J與X廣SLSPFYLRPPSFIJIAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X!-SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF-X2、X廣LRPPSFLR-X2、X廣PPSFLRAP-X2、X,-SFLRAPSW-X2、X廣LRAPSWFD-X2相同。7.—種多肽，其為X廣RLEKDRFS-X2、X廣FSVNLDVK-X2、X廣LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR-X2、X-HGFISREF-X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS畫X2、X廣GVLTVNGP-X2或X廣LTVNGPRK-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中，&和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50，并且^和X2中的n可以相同或不同。8.權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。9.權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序歹'J與X廣RLEKDRFS-X2、X廣FSVNLDVK-X2、X廣LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR-X2、X廣HGFISREF-X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP隱X2或X廣LTVNGPRK-X2相同。10.—種多肽，其為X廣RTIPITRE-X2或者它的功能性變異體或模擬物，其中，X,和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S菱序列，其中n為0-50，并且Xi和X2中的n可以相同或不同。11.權(quán)利要求IO所述的多肽，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。12.權(quán)利要求IO所述的多肽，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣RTIPITRE-X2相同。13.權(quán)利要求12所述的多肽，其中所述功能性變異體含有I-X-I/V氨基酸基序。14.一種用于治療哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，其包括給有相應需要的受治療者施用一種多肽，其中所述多肽是X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSR陽X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP陽X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣SLSPFYLR-X2、X廣FYLRPPSF-X2、X廣LRPPSFLR-X2、X廣PPSFLRAP-X2、X!-SFLRAPSW-X2、X)-LRAPSWFD-X2、X廣RLEKDRFS-X、X'-FSVNLDVK-X、X,-LKVKVLGD-X2、X廣FISREFHR-乂2、X廣HGFISREF國乂2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X^RTIPITRE-X或者它們的功能性變異體或模擬物，其中Xi和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50,Xt和X2中的n可以相同或不同。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氛基酉吏序歹'J與XrWIRRPFFPFHSP-X2、XrWIRRPFFP-X2、乂廣PFFPFHSP-乂2、X廣FPFHSPSH-乂2、乂廣DQFFGEHL-乂2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP誦X2、X,-SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD畫X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2X廣SLSPFYLR-X2X,畫PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X,-FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI畫X2XrGVLTVNGP-X2X-FYLRPPSF-X2X!-SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X,-HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2相同。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述多肽X廣RTIPITRE-X2的功能性變異體含有I-X-I/V氨基酸基序。18.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述疾病是亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。19.權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述疾病是年齡相關(guān)性肌病。20.權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述疾病是心臟局部缺血。21.—種用于治療哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，其包括施用編碼一種多肽的核苷酸，其中所述多肽是X廣WIRRPFFPFHSP-X2、乂廣WIRRPFFP-乂2、乂廣PFFPFHSP-乂2、乂畫FPFHSPSH-乂2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP國X2、X廣SPFYLRPP-X2XrFYLRPPSF-X2X!畫SFLRAPSW-X2X廠FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPS曹D-X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2X廣IAIHHPWI-X2X廣SLSPFYLR-X2X!誦PPSFLRAP扁X2XrRLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2X'-GVLTVNGP-X2、X廣LTITSSLS-X2、X,-LTVNGPRK-X2或XrRTIPITRE-X2,或者它們的功能性變異體或才莫擬物，其中Xi和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基Si序列，其中n為0-50,并且X,和X2中的n可以相同或不同。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。23.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSH曙X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI陽X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2XrKYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2、X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP隱X2X-RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2X,-GVLTVNGP-X2X廣FYLRPPSF-X2X-SFLRAPSW-X2XrFSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK誦X2或X廣RTIPITRE-X2相同。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多肽XrRTIPITRE-X2的功能性變異體含有I-X-I/V氨基酸基序。25.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述疾病是亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。26.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述疾病是年齡相關(guān)性肌病。27.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述疾病是心臟局部缺血。28.—種用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法，其包括使所述蛋白質(zhì)與一種多肽接觸，所述多肽是X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X,-PFFPFHSP-X2X廣FFGEHLLE-X2、X廣SPFYLRPP-X2X廠LRPPSFLR-X2X,-LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2X廠LTITSSLS-X2XrFPFHSPSR-X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X,-FYERPPSF-X2X「SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廠HGFISREF-X2X「SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK-X2X廣SLSPFYLR-X2、X廠PPSFLRAP-X2、X廣RLEKDRFS-X2、、X廣FISREF服-X2XrEFHRKYRI-X2、X廣GVLTVNGP-X2、XrLTVNGPRK-X2或XrRTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X!和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基S吏序列，其中n為0-50,并且X，和X2中的n可以相同或不同。29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述治療性蛋白質(zhì)是疫苗、胰島素、生長因子或抗體。31.權(quán)利要求29所述的方法，其進一步包括提高所述治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以治療哺乳動物受治療者的病狀。32.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是重組生成的蛋白質(zhì)。33.權(quán)利要求28所述的方法，其進一步包括抑制蛋白質(zhì)錯折疊或減少蛋白質(zhì)聚集。34.權(quán)利要求28所述的方法，其進一步包括恢復所述蛋白質(zhì)正確或天然的折疊。35.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸耳又代或擬肽取代。36.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述功能性變異體有約70°/?；蚋弑壤陌被嵝蛄信cX廣WIRRPFFPFHSP隱X2、X-WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2X廣FFGEHLLE曙X2、X廣SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPS曹D-X2X廣LKVKVLGD-X2X,-KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2、X廣FPFHSPSR-X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP曙X2X!-RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2XrGVLTVNGP-X2X廣FYLRPPSF-X2X,-SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X,-LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2相同。37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述多肽X,-RTIPITRE-X2含有I-X-I/V氨基酸基序。38.—種用于診斷哺乳動物受治療者的蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病的方法，其包括使所述哺乳動物受治療者的組織樣品與一種多肽相接觸，所述多肽是X!-WIRRPFFPFMSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSR-X2、X廣DQFFGEHL-X2、X,-FFGEHLLE-X2、X廠IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X-SPFYLRPP-X2、X,-SLSPFYLR-X2XrPPSFLRAP-X2X)-RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2X廣GVLTVNGP-X:XrFYLRPPSF-X2X廣SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X,-LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2XrKYRIPADV-X2X,-LTITSSLS-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X,-RTIPITRE-X2，或者它們的功能性變異體或模擬物，其中X!和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50,并且X,和X2中的n可以相同或不同；檢測錯折疊蛋白、未折疊蛋白或聚集蛋白與所述多肽的結(jié)合；以及確定所述哺乳動物受治療者中是否存在所述疾病。39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述是否存在所述疾病是通過所述蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或聚集的P介段來進行檢測。40.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病是亞歷山大病、阿爾茨海默病、克-雅病、帕金森病、亨廷頓病、白內(nèi)障、色素性視網(wǎng)膜炎、朊病毒病或瘋牛病。41.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疾病是年齡相關(guān)性肌病。42.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疾病是心臟局部缺血。43.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。44.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X,-WIRRPFFPFHSP-X2、XrWIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP曙X2、乂廣FPFHSPSH糧X2、X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2Xt丄TITSSLS-X2、X廣SLSPFYLR-X2X!-PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR國X2X廣EFHRKYRI-X2X,-GVLTVNGP-X2XrFYLRPPSF-X2X廣SFLRAPSW-X2X,-FSVNLDVK-X2X,-HGFISREF-X2X廣SREFHRKY-X2X,-LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2相同。45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述多肽X廣RTIPITRE-X2含有I-X-I/V氨基酸基序。46.—種體外篩選蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或聚集的調(diào)節(jié)因子的方法，其包括使靶蛋白與一種多肽相接觸；檢測蛋白質(zhì)聚集量的減少；從而確定所述多肽作為蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或聚集的調(diào)節(jié)因子，其中，所述多肽是X廣WIRRPFFPFHSP醒X2、XrWIRRPFFP-X2、XrPFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSR畫X2X廣IAIHHPWI-X2、X-SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2.X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2X廣SLSPFYL證SFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣FYLRPPSF-X2、乂廣LRPPSFUl-X2,X「SFLRAPSW-X2、X,-LRAPSWFD-X2、X廣FSVNLDVK-X2、Xi-LKVKVLGD-X2X廣FISREFHR曙X2、X廣HGFISREF-X2、X廣KYRIPADV-X2、X廣EFHRKYRI-X2、X廣SREFHRKY-X2、X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X^RTIPITRE-X或者它們的功能性變異體或模擬物，其中Xi和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50,并且Xt和X2中的n可以相同或不同。47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述靶蛋白是卩淀粉樣蛋白、卩/y晶狀體蛋白、肌動蛋白、索蛋白、波形蛋白、胰島素、檸檬酸合成酶、乙醇脫氳酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、a乳清蛋白、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、P轉(zhuǎn)化生長因子、(3神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、卩連環(huán)蛋白、a腫瘤壞死因子、Bcl-2、Bcl-Xl或胱門蛋白酶。48.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。49.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X,-WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、乂廣PFFPFHSP-X2、X廣FPFHSPSHO(2、乂廣DOFFGEHL-乂2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X-SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD-X2X廣LKVKVLGD-X2X廠KYRIPADV-X2X廣LTITSSLS-X2X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廣RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2XrGVLTVNGP-X2X廣FYLRPPSF誦X2X!-SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X,-SREFHRKY-X2X,-LTVNGPRK-X2或X)-RTIPITRE-X2相同。50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述多肽X廣RTIPITRE-X2含有I-X-I/V氨基酸基序。51.—種體內(nèi)篩選蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或聚集的調(diào)節(jié)因子的方法，其包括使表達靶蛋白的細胞或細胞系與編碼一種多肽的測試化合物相接觸；檢測所述細胞系中蛋白質(zhì)聚集量的減少；從而確定所述多肽作為蛋白質(zhì)錯折疊、未折疊或蛋白質(zhì)聚集行為的調(diào)節(jié)因子，其中，所述多肽是X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP匪X2、X廣PFFPFHSP-X2、X!-FPFHSPSR-X2X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X廠RLEKDRFS隱X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2XrGVLTVNGP-X2>X廣DQFFGEHL-X2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X廣SPFYLRPP-X2、X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPSWFD-X2X'-LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV-X2X廠LTITSSLS-X2,X廣FYLRPPSF-X2、Xi-SFLRAPSW-X2、X,-FSVNLDVK-X2、X-HGFISREF-X2、、X廣SREFHRKY-X2X廣LTVNGPRK-X2或X^RTIPITRE-X"或者它們的功能性變異體或模擬物，其中Xi和X2各自相互獨立地代表具有n個氨基酸的任意氨基酸序列，其中n為0-50,并且X,和X2中的n可以相同或不同。52.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述靶蛋白是(3淀粉樣蛋白、(3/y晶狀體蛋白、肌動蛋白、索蛋白、波形蛋白、胰島素、檸檬酸合成酶、乙醇脫氬酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、(X乳清蛋白、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、p轉(zhuǎn)化生長因子、p神經(jīng)生長因子、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、(3連環(huán)蛋白、a腫瘤壞死因子、Bcl-2、Bcl-Xl或胱門蛋白酶。53.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述功能性變異體或模擬物包括保守性氨基酸取代或擬肽取代。54.權(quán)利要求51所述的方法，其中所述功能性變異體有約70%或更高比例的氨基酸序列與X廣WIRRPFFPFHSP-X2、X廣WIRRPFFP-X2、X廣PFFPFHSP-乂2、乂廣FPFHSPSIl-乂2、乂廣DQFFGEHL-乂2、X廣FFGEHLLE-X2、X廣IAIHHPWI-X2、X廣SLSPFYLRPPSFLRAP-X2、X,-SPFYLRPP-X2X廣LRPPSFLR-X2X廣LRAPS曹D-X2X廠LKVKVLGD-X2X廣KYRIPADV陽X2X廣SLSPFYLR-X2X廣PPSFLRAP-X2X,-RLEKDRFS-X2X廣FISREFHR-X2X廣EFHRKYRI-X2XrFYLRPPSF-X2X,-SFLRAPSW-X2X廣FSVNLDVK-X2X廣HGFISREF-X2X廠SREFHRKY-X2X廣LTITSSLS-X2、X廣GVLTVNGP-X2、X廣LTVNGPRK-X2或X廣RTIPITRE-X2相同。55.權(quán)利要求54所述的方法，其中所述多肽X廣RTIPITRE-X2含有I隱X-I/V氨基酸基序。全文摘要本發(fā)明提供了小分子量的分子，其包括(但不限于)穩(wěn)定并防止異常折疊及缺陷的蛋白質(zhì)聚集的肽、肽類似物和擬肽。本發(fā)明提供了利用所述肽、肽類似物或擬肽或者利用編碼所述肽的核酸來治療疾病的方法。文檔編號C07K1/00GK101263154SQ200580037391公開日2008年9月10日申請日期2005年11月4日優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日發(fā)明者喬伊·G·高斯,約翰·I·克拉克申請人:華盛頓大學