專利名稱：用于識(shí)別具有結(jié)合配體能力的異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識(shí)別具有結(jié)合配體能力的異源多聚體泛素的方法。此外，本發(fā)明提供編碼所述異源多聚體泛素蛋白群的DNA庫(kù)和由所述DNA庫(kù)的表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)庫(kù)、包含所述DNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞和噬菌體、編碼所述融合蛋白的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的載體。進(jìn)一步提供能夠以高親和力特異性地結(jié)合到所選擇的配體上的以異源多聚體泛素為基礎(chǔ)的新的結(jié)合蛋白質(zhì)(binding protein)。
背景技術(shù)：
對(duì)于由氨基酸組成的，但不是免疫球蛋白的結(jié)合分子的需求日益增加。迄今為止，雖然抗體代表確定的最好的結(jié)合分子，但是因?yàn)槊庖咔虻鞍追肿泳哂休^大的缺陷，為了以高親和力和高特異性靶向配體，仍然需要新的結(jié)合分子。盡管它們能很容易地制造且它們 可指向幾乎任何一個(gè)靶，它們?nèi)匀痪哂邢喈?dāng)復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。仍然需要能夠易于操作的更小的分子取代抗體。這些可替換的結(jié)合劑能有利地用于，例如診斷、預(yù)防和疾病的治療的醫(yī)療領(lǐng)域。蛋白具有相對(duì)確定的通常被稱為蛋白質(zhì)骨架的三維結(jié)構(gòu)，且可作為用于設(shè)計(jì)所述可替換的結(jié)合劑的起始材料。這些骨架通常包含一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，這些區(qū)域受特異的或隨機(jī)的序列變化作用，且經(jīng)常發(fā)生這種序列隨機(jī)化，以制造蛋白質(zhì)文庫(kù)，從蛋白質(zhì)文庫(kù)中可選出特異的結(jié)合分子。預(yù)期具有比抗體更小的尺寸，且對(duì)靶抗原具有相當(dāng)、甚者更好的親和力的分子在藥物動(dòng)力學(xué)性能和免疫原性方面超過抗體。先前的許多方法確實(shí)使用蛋白質(zhì)骨架作為結(jié)合蛋白的起始材料。例如，在WO99/16873中，開發(fā)對(duì)某種配體表現(xiàn)出結(jié)合活性的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Iipocalin)家族(所謂的Anticalin (一種抗體類似物))的修飾蛋白。利用遺傳工程的方法，通過在其天然配體結(jié)合口袋(pocket)進(jìn)行氨基酸置換，對(duì)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。類似免疫球蛋白，Anticalin可用于確定或結(jié)合分子結(jié)構(gòu)。在某種意義上類似于抗體，柔性環(huán)形結(jié)構(gòu)被修飾；這些修飾能夠確定與天然配體不同的配體。WO 01/04144描述在蛋白本身缺少結(jié)合位置P片結(jié)構(gòu)中的蛋白表面上人工產(chǎn)生的結(jié)合域。通過這種方法重新產(chǎn)生人工的結(jié)合域，例如能夠獲得、-晶狀體球蛋白-一種眼睛晶體結(jié)構(gòu)蛋白-的變體，其對(duì)配體具有高親和力和特異性。和已經(jīng)出現(xiàn)且由上述提及的擬抗體的柔性環(huán)形結(jié)構(gòu)形成的結(jié)合位置的修飾相比，這些結(jié)合域重新在P片的表面上產(chǎn)生。然而，W001/04144只描述用于產(chǎn)生新的結(jié)合性能的相對(duì)大的蛋白的變化。由于它們的尺寸，根據(jù)WO 01/04144蛋白僅能在遺傳工程水平上通過需要某些努力的方法來(lái)修飾。此夕卜，為了維持蛋白的整體結(jié)構(gòu)，迄今為止公開的蛋白中只有總氨基酸相對(duì)小的百分?jǐn)?shù)部分被修飾。因此，只有相對(duì)小的蛋白表面的區(qū)域是可用的，其能用于產(chǎn)生以前不存在的結(jié)合性能。而且，W001/04144只公開對(duì)Y-晶狀體球蛋白產(chǎn)生的結(jié)合性能。WO 04/106368描述以泛素蛋白為基礎(chǔ)的人工結(jié)合蛋白的產(chǎn)生。泛素是小的、單體的、和細(xì)胞溶質(zhì)的蛋白，其序列高度保守且出現(xiàn)在所有已知的從原生動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的真核細(xì)胞中。其在生物體的細(xì)胞蛋白的可控降解的調(diào)節(jié)中充當(dāng)至關(guān)緊要的角色。為了這種目的，用于降解的蛋白在它們通往酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)期間共價(jià)地連接到泛素或多聚泛素鏈上，且由于這種標(biāo)簽選擇性地降解蛋白。根據(jù)最近的結(jié)果，泛素或泛素的蛋白標(biāo)簽，也分別在其他細(xì)胞程序中充當(dāng)重要的角色，例如幾種蛋白的輸入或其基因調(diào)節(jié)。除了它的生理機(jī)能的闡明之外， 由于它的結(jié)構(gòu)和蛋白化學(xué)性質(zhì)，泛素是主要的研究目標(biāo)。泛素的多肽鏈由76個(gè)在非常緊密的a/0結(jié)構(gòu)(Vijay-Kumar，1987)中折疊的氨基酸組成幾乎87%的多肽鏈涉及通過氫鍵的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的形成。主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是三個(gè)和半個(gè)a螺旋轉(zhuǎn)角和由四股組成的反平行P片。這些元件的特征排列通常被認(rèn)為是所謂的類泛素折疊基序(ubiquitin-like folding motif)-反平行0片暴露在后側(cè)上的蛋白表面，其中a螺旋垂直地堆積在頂上。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征是蛋白內(nèi)部a螺旋和P片之間標(biāo)記的疏水區(qū)域。因?yàn)樗男〉某叽纾芡ㄟ^化學(xué)合成和依靠生物科技的方法兩種途徑進(jìn)行泛素的人工制備。由于有利的折疊性能，能通過遺傳工程利用微生物例如埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)以相對(duì)大的數(shù)量在細(xì)胞溶質(zhì)或在外周胞質(zhì)空間制造泛素。因?yàn)橥庵馨|(zhì)中占優(yōu)勢(shì)的氧化條件，后面的方法通常專供分泌蛋白的制造之用。由于簡(jiǎn)易和有效的細(xì)菌制備，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侶，以制備難于生產(chǎn)的產(chǎn)品。依靠融合，能獲得溶解性改善的泛素并因此獲得提高的產(chǎn)量。與抗體或其他可替換的骨架相比，以泛素蛋白(也稱作載脂蛋白擬抗體_)為基礎(chǔ)的人工結(jié)合蛋白具有的優(yōu)勢(shì)是小尺寸和高穩(wěn)定性、高親和力、高特異性、有效的微生物制造成本、和血清半衰期的調(diào)整。然而，按照免疫原潛在、快速和預(yù)兆的潛伏期發(fā)展軌跡和新的治療途徑，仍然需要進(jìn)一步地開發(fā)這些蛋白質(zhì)。為了獲得人造的結(jié)合蛋白，WO 05/05730總體描述了泛素骨架蛋白的用途，為了獲得結(jié)合配體如半抗原和抗原更高的和更特定的親和力，例如，蛋白質(zhì)和肽和它的抗原決定基，沒有提供如何修飾和如何有效地選擇這種修飾的泛素蛋白質(zhì)的解決辦法。WO 05/05730中描述的方法涉及修飾的泛素蛋白的單體或涉及修飾的泛素的結(jié)合蛋白(偶聯(lián)蛋白)。結(jié)合(偶聯(lián))形式是通過篩選和選擇一個(gè)、兩個(gè)或更多的修飾的泛素蛋白產(chǎn)生的，且然后通過遺傳的或化學(xué)的方法連接它們，以便獲得結(jié)合(偶聯(lián))的形式，例如結(jié)合(偶聯(lián))形式能夠通過一個(gè)結(jié)合(偶聯(lián))泛素分子多特異性的結(jié)合不同類型的配體。一個(gè)實(shí)施例中，與單獨(dú)修飾的泛素分子相比，為了增加結(jié)合親和力，描述了兩種同樣的基于泛素的蛋白質(zhì)(同型二聚體)的位置定向的結(jié)合(偶聯(lián))。本發(fā)明的目標(biāo)是提供如何識(shí)別具有配體高結(jié)合能力的多聚體泛素蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供識(shí)別新的以修飾的泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白質(zhì)的方法且能夠具有高親和力特異性地結(jié)合選擇的配體的方法。通過隨附的獨(dú)立權(quán)利要求的主旨解決上述描述的目標(biāo)。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例包括在從屬權(quán)利要求中和具體實(shí)施方式
、實(shí)施例和圖形中。

發(fā)明內(nèi)容
更具體地，本發(fā)明提供識(shí)別具有結(jié)合配體能力的異源多聚體修飾的泛素的方法，其包括下列步驟a)提供來(lái)源于單體修飾的泛素蛋白質(zhì)的異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的群，所述群包括異源多聚體蛋白質(zhì)，其包括以頭尾排列連接在一起的兩種或更多不同地修飾的泛素單體或至少一種修飾的泛素單體，其中至少通過位于SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個(gè)氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而對(duì)每一個(gè)所述異源多聚體蛋白質(zhì)的所述單體的至少兩個(gè)進(jìn)行不同地修飾，所述修飾的單體蛋白與未修飾的泛素蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列同一性為至少80%或至少90%或至少95% ；b)為所述不同修飾的蛋白質(zhì)的群提供潛在的配體；c)使所述不同地修飾的蛋白質(zhì)的群與所述配體接觸；d)通過篩選方法識(shí)別修飾的異源多聚體蛋白質(zhì)，其中所述修飾的多聚體蛋白以Kd的范圍是10_7-10_2M的特定的(特異性)結(jié)合親和力結(jié)合所述配體，且對(duì)于所述配體表現(xiàn)出單價(jià)的結(jié)合活性；和可選地 e)利用所述結(jié)合親和力分離所述異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)。用于該申請(qǐng)中重要的術(shù)語(yǔ)的定義術(shù)語(yǔ)“泛素蛋白質(zhì)”包括與SEQ ID NO: I—致的泛素和與下列定義一致的它的修飾。真核生物體中的泛素是高度保守的。例如，在所有迄今為止調(diào)查的哺乳動(dòng)物中泛素具有同樣的氨基酸序列。顯著首選的是來(lái)自人類、嚙齒動(dòng)物、豬和靈長(zhǎng)類的泛素分子。此外，能利用任何其他真核來(lái)源的泛素。例如酵母的泛素與SEQ ID NO: I的序列只有三個(gè)氨基酸的不同。通常，由所述術(shù)語(yǔ)“泛素蛋白質(zhì)”包括的泛素蛋白質(zhì)與SEQ ID NO: I顯示超過70%的氨基酸同一性，優(yōu)選地超過75%或超過80%的、超過85%、超過90%、超過95%、超過96%或達(dá)到97%的序列同一性。為了確定泛素衍生物與SEQ ID N0:1的氨基酸序列同一性的程度，例如，能利用 SIM Local 類似程序(Xiaoquin Huang and Webb Miller, " Advances in AppliedMathematics, vol. 12:337-357，1991)或者 Clustal, W. (Thompson et al. , Nucleic AcidsRes.，22(22) :4673-4680, 1994.)。優(yōu)選地，相對(duì)于SEQ ID NO: I的全部序列，修飾蛋白與SEQ ID NO: I序列同一性的程度是確定的。本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“配體”和“受體”和“結(jié)合伴侶”都是同義使用的且能互換。配體是具有此處定義的能夠利用親和力結(jié)合異源多聚體修飾的泛素蛋白的任何分子。本發(fā)明的“異源多聚體融合蛋白”或“異源多聚體蛋白”被認(rèn)為是包括一個(gè)或更多不同修飾的單體泛素蛋白的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的“異源多聚體”被認(rèn)為是具有兩個(gè)相互作用的結(jié)合域區(qū)域的至少兩個(gè)不同修飾的單體泛素蛋白的融合，其中兩個(gè)結(jié)合域區(qū)域?yàn)榫唧w的結(jié)合伴侶共同提供單價(jià)的結(jié)合性能。優(yōu)選的是異源二聚物或異源三聚物。依照本發(fā)明，至少兩個(gè)不同地修飾的結(jié)合到一個(gè)配體上的泛素單體利用例如遺傳方法通過首尾融合而彼此連接。不同地修飾的融合的泛素單體以單價(jià)的方式結(jié)合且如果兩個(gè)結(jié)合域區(qū)域(“BDR”)共同起作用，不同修飾的泛素單體才是有效的。形成異源多聚體蛋白的修飾的和連接的泛素單體通過單個(gè)臨近的結(jié)合區(qū)域結(jié)合到相同的抗原決定基上。這種異聚體的臨近區(qū)域是由至少兩個(gè)模塊的兩個(gè)結(jié)合決定區(qū)域形成的，其中兩個(gè)模塊是由至少兩個(gè)不同地修飾的泛素單體形成的?！笆孜踩诤稀睉?yīng)理解成通過依靠包含在多聚體中的大量單元以N-C-N-C-方向連接在一起的兩個(gè)或更多蛋白質(zhì)的融合。這種首尾融合中，泛素能夠沒有任何連接子而直接地連接。可替換地，能通過連接子完成泛素單體的融合，例如，具有至少氨基酸序列為GIG或具有至少氨基酸序列為SGGGG的連接子或任何其他連接子，例如GIG、SGGGG, SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG?，F(xiàn)有技術(shù)中也已知且能夠利用用于兩種泛素單體的遺傳融合的其他連接子。概括地，為了獲得修飾的泛素單體的融合蛋白，由兩個(gè)、三個(gè)或更多不同地修飾的單體泛素蛋白的融合提供異源多聚體修飾的泛素蛋白。進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少一個(gè)泛素單體是未修飾的，而其他泛素分子的至少一個(gè)是修飾的。術(shù)語(yǔ)“群”涉及由異源的核酸編碼的異源的多肽混合的庫(kù)。庫(kù)由成員組成，該成員具有由核酸序列編碼的單一多肽。庫(kù)成員之間的序列差異是形成庫(kù)中出現(xiàn)的多樣性的原因。庫(kù)可采取多肽或核酸的單一混合的形式，或可采取生物體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物或植物細(xì)胞等等，利用核酸的庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。優(yōu)選地，每一個(gè)單獨(dú)的生物體或細(xì)胞只 包含庫(kù)的一個(gè)成員。有利地，為了容許核酸編碼的多肽的制造，將核酸并入表達(dá)載體。因此，優(yōu)選的方面，庫(kù)可采取宿主生物體群的形式，每一個(gè)生物體包含一個(gè)或更多表達(dá)載體的拷貝，表達(dá)載體包含核酸形式的庫(kù)的單個(gè)成員，表達(dá)載體能表達(dá)以便制造它的相應(yīng)的多肽成員。因此，宿主生物體的群具有潛在地編碼遺傳上不同的多肽變體的大量全部?jī)?nèi)容。例如通過遺傳上地融合的各自編碼不同地修飾的單體蛋白的DNA庫(kù)，或以可替換的方式，提供所述的異源多聚體泛素蛋白質(zhì)的群，其中修飾至少一個(gè)所述單體泛素蛋白質(zhì)，將DNA翻譯成異源多聚體融合蛋白，展示所述蛋白質(zhì)并在修飾的異源多聚體泛素蛋白存在下篩選展示的蛋白質(zhì)，異源多聚體泛素蛋白包含以首尾排列連接在一起的單體泛素蛋白，其中所述修飾的異源多聚體泛素蛋白質(zhì)結(jié)合所述配體具有的特定的結(jié)合親和力Kd的范圍是10_7-10_2M，且對(duì)于所述配體表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性。為了獲得異源二聚體泛素蛋白質(zhì)，融合各自編碼或至少一個(gè)編碼不同地修飾的單體蛋白的兩個(gè)DNA庫(kù)，為了獲得異源三聚體泛素蛋白，融合各自編碼或至少一個(gè)編碼不同地修飾的單體蛋白的三個(gè)DNA庫(kù)，等等。進(jìn)一步可替換的方式可以用于提供用于篩選的庫(kù)。一個(gè)實(shí)例是蛋白質(zhì)的化學(xué)合成，例如，通過固態(tài)技術(shù)和在它們的氨基酸成分中引入變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮并且發(fā)現(xiàn)其他有用的的選項(xiàng)深思熟慮的。因此，本發(fā)明不能理解成是對(duì)此處描述的實(shí)例的限制。因此，本發(fā)明公開了一種方法，通過這種方法，依照由結(jié)合配體能力決定的功能性，提供多肽的所有組成成分，并且作為選擇結(jié)果獲得的多肽子集依照結(jié)合靶配體的能力用于進(jìn)一步多輪選擇，以便積聚和增加配體的結(jié)合親和力。本發(fā)明允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員從選擇的多肽的所有組成成分中，排除那些權(quán)利要求中指定的不能具有親和力的結(jié)合到靶配體上的多肽。本發(fā)明允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員為有用的且滿足親和力要求的多肽富集多肽的所選的所有組成成分。本發(fā)明的最重要的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于對(duì)靶分子具有單價(jià)的結(jié)合親和力的修飾的異源多聚體泛素蛋白質(zhì)的選擇和后來(lái)的為結(jié)合親和力負(fù)責(zé)的修飾的氨基酸的測(cè)定。多聚化、優(yōu)選二聚化的進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)在于氨基酸殘基數(shù)量的增加，氨基酸殘基能被修飾以便產(chǎn)生新的高親和力結(jié)合性能。優(yōu)勢(shì)是即使在更多氨基酸被修飾時(shí)，也維持蛋白質(zhì)化學(xué)的完整性，而不減少所述的新形成結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)的骨架的總體穩(wěn)定性。一方面，為了產(chǎn)生特定的靶標(biāo)的新的結(jié)合位置，能被修飾的殘基的總數(shù)是增加的，因?yàn)槟軐⑿揎椀臍埢峙涞絻蓚€(gè)或三個(gè)或更多的單體泛素蛋白上。因此對(duì)應(yīng)于修飾的單體泛素分子的數(shù)目，修飾的數(shù)目能是兩倍或X-倍?？傊诜核氐慕Y(jié)合蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)允許增加修飾的氨基酸的總數(shù)，因?yàn)樗鲂揎椀陌被岚ㄔ趦蓚€(gè)或三個(gè)或更多的單體泛素分子上的。本方法提供識(shí)別具有一個(gè)單價(jià)特異性(對(duì)于一個(gè)單獨(dú)的抗原決定基)的異源多聚體泛素分子?！皢蝺r(jià)的”應(yīng)該理解成修飾的二聚體(可選地三聚體或通常的多聚體)泛素的第一和第二 (和可選地另外的)單體單元中形成的兩種結(jié)合區(qū)域以協(xié)作的和組合的方式一起結(jié)合ED-B的能力，即，兩種結(jié)合區(qū)域共同起作用以便形成單價(jià)的結(jié)合活性。所述異源二聚體分子中第一和第二修飾的泛素的每一結(jié)合區(qū)域分別地結(jié)合ED-B具有的效率和親和力顯然將低于二聚體分子。兩種結(jié)合區(qū)域形成單一的(獨(dú)特的)結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)作為異源二聚修飾的泛素蛋白的表面上的氨基酸的臨近區(qū)域形成，以致所述修飾的泛素比每一個(gè)單體蛋白單獨(dú)結(jié)合到ED-B更加有效，因此所述修飾的泛素是切實(shí)可行的。依照本發(fā)明，沒有在已經(jīng)篩選了最有效的結(jié)合泛素分子之后連接兩種單體蛋白而是在有異源二聚體泛素的情況下實(shí)施該篩選過程，這是非常重要的。在已經(jīng)接收最有效的結(jié)合泛素分子之上的序列信息之后，可通過其他方法獲得這些分子，例如，通過化學(xué)合成或通過遺傳工程方法，例如，通過將兩個(gè)已經(jīng)識(shí)別的單體泛素單元連接在一起。應(yīng)該理解，也可將此處提供的所有二聚體 修飾的泛素蛋白的實(shí)例更改成三聚體或通常的多聚體修飾的泛素蛋白。因此，具有用于結(jié)合伴侶的共同的結(jié)合位點(diǎn)的異源多聚體特別是異源二聚體的使用打開了引入增加的修飾殘基數(shù)量的可能性，其中修飾的殘基不能過度地影響最終結(jié)合分子的蛋白化學(xué)完整性，因?yàn)槟切┬揎棜埢目倲?shù)分布在兩個(gè)或更多形成二或多聚體的單體單元上。所述異源多聚體修飾的泛素蛋白出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的庫(kù)中。通過在每一個(gè)單體泛素單元中不同地修飾挑選的密碼子而已經(jīng)建立例如至少兩種不同的用于編碼單體修飾的泛素蛋白質(zhì)的DNA庫(kù)之后，這些庫(kù)遺傳融合以獲得編碼異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的DNA分子。這些庫(kù)的DNA翻譯成蛋白質(zhì)且依照本發(fā)明因此獲得的修飾的異源多聚體蛋白與靶分子接觸，以便如果確實(shí)存在結(jié)合親和力，伴侶能夠彼此結(jié)合。優(yōu)選的修飾的泛素是異源二聚物。本發(fā)明至關(guān)重要的方面是關(guān)于異源-多聚體，例如異源-二聚體的修飾的泛素蛋白質(zhì)已經(jīng)進(jìn)行了接觸和篩選方法(過程)。這個(gè)方法能夠?qū)δ切┨峁?duì)靶分子的單價(jià)結(jié)合活性的泛素蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。依照本發(fā)明，單體修飾的泛素蛋白質(zhì)不是在已經(jīng)通過篩選最有效的結(jié)合泛素分子進(jìn)行選擇之后連接在一起，而是在有異源二聚體泛素的情況下實(shí)施篩選過程，這是特別重要的。然而，應(yīng)該注意，在已經(jīng)獲得(接收)最有效的異源多聚體泛素結(jié)合分子的序列信息之后，也可通過任何其他的方法獲得這些分子，例如，通過化學(xué)合成或通過遺傳工程方法，例如，通過將兩個(gè)已經(jīng)識(shí)別的不同地修飾的單體泛素單元連接在一起，以便形成異源二聚體結(jié)合蛋白質(zhì)。依照本發(fā)明，優(yōu)選地通過適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)和選擇方法，例如噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、mRNA展示或細(xì)胞表面展示、酵母表面展示或細(xì)菌表面展示方法,優(yōu)選地依靠核糖體或噬菌體展示方法，來(lái)進(jìn)行接觸，。為了完全公開，也可以參考下列參考文獻(xiàn)Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993)，572-579; Wells and Lowmann, Curr.Opin.Struct.Biol. 2(1992), 597-604;25 Kay et al, Phage Display of Peptides andProteins-A Laboratory Manual (1996)，Academic Press。上述提到的方法都是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的且依照本發(fā)明可以使用，包括其變化/修飾方法。依照本發(fā)明優(yōu)選地通過一個(gè)或更多下列方法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance spectroscopy)、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography)、突光各向異性(fluorescence anisotropy)、突光光譜(fluorescence spectroscopy)、FACS、等溫滴定溫量熱儀(isothermal titrationcalorimetry)、和分析超速離心(analytical ultracentrifugation),能確定修飾的蛋白質(zhì)是否具有對(duì)預(yù)定的結(jié)合伴侶的可定量的結(jié)合親和力。通過專家的常識(shí)，也能利用本領(lǐng)域中可用的其他方法?！爱愒炊嗑垠w”此處被認(rèn)作是包括至少兩個(gè)不同的單體泛素蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的“異源二聚體”被認(rèn)為是兩個(gè)不同地修飾的單體泛素蛋白的融合。兩者對(duì)特定的結(jié)合伴侶均表現(xiàn)組合的單價(jià)結(jié)合性能。強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明的修飾的多聚體(例如，二聚體)配體結(jié)合泛素蛋白質(zhì)不是通過分別地篩選每一個(gè)單體泛素蛋白然后組合它們中的至少兩個(gè)獲得的，而是通過篩選由第一和第二或進(jìn)一步的單體單元組成的多聚體(可選地二聚體)蛋白質(zhì) 獲得的，單體單元一起表現(xiàn)所述配體的單價(jià)結(jié)合活性。每一個(gè)所述子單元對(duì)配體表現(xiàn)相當(dāng)有限的結(jié)合親和力，而只有組合的多聚體或二聚體修飾的泛素具有本文描述的極好的結(jié)合性能，這是期望的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法涉及識(shí)別修飾的異源二聚體泛素蛋白質(zhì)，其中兩個(gè)單體泛素單元以首尾排列的方式連接在一起，其中通過在SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處至少3個(gè)、優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸(它們中每一個(gè)都是暴露在表面的)的取代，不同地修飾所述二聚體蛋白質(zhì)的每一個(gè)單體，其中所述取代包括(I)第一個(gè)單體單元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66的取代；和在第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可選地外加在氨基酸位置2的取代，或者(2)第一個(gè)單體單元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66的取代；可選地外加在氨基酸位置2的取代，和可選地進(jìn)一步的修飾，優(yōu)選地其他氨基酸的取代，所述修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%組成的組中的至少之一，所述蛋白質(zhì)對(duì)于配體具有的特定的結(jié)合親和力Kd = 10_7-10_2M且所述蛋白質(zhì)對(duì)于所述配體表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例中，在每一個(gè)單體泛素單元中修飾SEQ ID NO: I的位置2、4、5、6、8、62、63、64、65、66、和68中的6、7、8、9個(gè)或所有的氨基酸。應(yīng)該理解本發(fā)明允許在每一個(gè)單體單元中(例如，在第一和第二單元中)的這些變體的每一個(gè)的組合。例如第一單體單元能包括6處修飾而第二單元包括7或8處修飾，第一單元可包括8處修飾和第二單元包括7處修飾等等。上述列出的每一個(gè)氨基酸能在第一和第二單元中選出，然后兩個(gè)單元組合。本文下面描述優(yōu)選的取代。
具體實(shí)施方式
修飾的異源多聚體泛素蛋白的展示方法在下文和實(shí)施例中描述了適于這個(gè)申請(qǐng)的噬菌體和核糖體展示程序。依照本發(fā)明，它們被描述作為選擇過程的實(shí)施例，以便檢測(cè)泛素的變體，其顯示對(duì)此處描述的潛在的配體的結(jié)合性能。同樣地，例如能利用細(xì)菌(細(xì)菌表面展示；Daugherty etal. , 1998, Protein Eng. 11 (9) :825-832)或酵母細(xì)胞(酵母表面展示；Kieke et al, 1997Protein Eng. 10 (11) : 1303-10)或無(wú)細(xì)胞選擇體系(cell-free selection systems)例如核糖體展不(Hanes and Pluckthun, 1997 Proc Natl Acad Sci USA. 94 (10) : 4937-4942; Heand Taussig, 1997_Nucleic Acids Res analytical ultracentrifugation, . 25(24):5132-5134)或 cis 展示(Odegrip et al, 2004 Proc Natl Acad Sci USA. 101(9) :2806-2810)或mRNA展示上表現(xiàn)的方法。在后面的情形中，利用核糖體通過將蛋白質(zhì)變體與適當(dāng)?shù)膍RNA結(jié)合(偶聯(lián))獲得基因型和表現(xiàn)型短暫的物理連接。在此處描述的噬菌體展示程序中，泛素的重組變體出現(xiàn)在絲狀噬菌體上，而出現(xiàn)的變體的譯碼DNA同時(shí)出現(xiàn)，且以單鏈形式包裝在噬菌體包膜中。因而，在親和力富集的結(jié) 構(gòu)中，能夠從庫(kù)中選出具有某些性能的變種且能分別通過適當(dāng)?shù)募?xì)菌感染或增加另外的富集循環(huán)擴(kuò)增它們的遺傳信息。通過遺傳的融合到對(duì)氨基末端信號(hào)序列上-優(yōu)選的PelB信號(hào)序列-和噬菌體的衣殼或表面蛋白質(zhì)-優(yōu)選的是羧基末端融合到衣殼蛋白pill或它的碎片上，獲得噬菌體表面上的突變的泛素的表達(dá)。此外，編碼的融合蛋白能包含進(jìn)一步的功能元件例如，用于通過親和色譜法檢測(cè)和/或純化的親和標(biāo)簽或抗體抗原決定基或在親和富集期間用于融合蛋白的特定斷裂的蛋白酶識(shí)別序列。此外，例如能在泛素變體的基因和噬菌體衣殼蛋白的譯碼區(qū)域或它的碎片之間出現(xiàn)琥珀終止子，部分地由于一個(gè)氨基酸的引入，在適當(dāng)?shù)囊种苹?suppressor strain)的翻譯期間不能辨別琥拍終止子。在對(duì)特定的靶標(biāo)具有結(jié)合性能的泛素變體的分離的背景中，適合于選擇過程(步驟)的且融合蛋白的基因表達(dá)盒(gene cassette)插入其中的細(xì)菌載體優(yōu)選是噬菌粒。其中，它包含絲狀噬菌體(例如M13或fl)或它的部分的基因間隔區(qū)，在依靠輔助噬菌體例如M13K07攜帶噬菌粒的細(xì)菌細(xì)胞的雙重感染的情況下，其導(dǎo)致共價(jià)的環(huán)狀噬菌粒DNA組裝成噬菌體衣殼。以這種方式產(chǎn)生的噬菌體顆粒是通過細(xì)菌分泌的，且由于在它們表面上對(duì)衣殼蛋白PlII或它的碎片的融合，噬菌體顆粒提供各自在它們表面上編碼的泛素變體。天然的PlII衣殼蛋白出現(xiàn)在噬菌體顆粒中，所以保留它重新感染適當(dāng)?shù)募?xì)菌株的能力，且因此保留擴(kuò)增的相應(yīng)的DNA的可能性。因而，確保泛素變體的表現(xiàn)型和它的基因型之間的物理連接，表現(xiàn)型例如，它的潛在的結(jié)合性能。根據(jù)出現(xiàn)在其上的泛素變體與任何靶分子的結(jié)合，例如，ED-B、腫瘤壞死因子、MIA-2、NGF、IgG或其他靶，依靠本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法能選擇獲得的噬菌體顆粒。為了這個(gè)目的，出現(xiàn)的泛素變體能短暫地固定在靶物質(zhì)界限上，例如，微量滴定板上(microtiter plates)且在分離出非結(jié)合的變體之后能特定地洗脫。通過基礎(chǔ)溶液優(yōu)選地實(shí)行洗脫，例如IOOmM三乙胺?？商鎿Q地，洗脫能在酸性條件下通過蛋白質(zhì)水解或感染的細(xì)菌的直接加入來(lái)實(shí)行。通過泛素變體選擇和擴(kuò)增的連續(xù)循環(huán)，能再次擴(kuò)增和富集以這種方式獲得的噬菌體顆粒，其中泛素變體具有對(duì)例如，ED-B, TNF a、MIA-2、NGF、IgG或任何其他靶分子的結(jié)合性能。卩遼菌體展不的變體是Tat卩遼菌體展不技術(shù)(Paschke,M. and ff. Hohne (2005). Gene350(1) :79-88; see also EP 1567643)。使用這種方法，由噬菌粒編碼的泛素變體通過雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Tat)系統(tǒng)分泌，雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)輸出折疊的蛋白質(zhì)，其中已經(jīng)在細(xì)胞質(zhì)中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的天然構(gòu)造(Bruser 2007 Appl Microbiol Biotechnol 76 (I) : 35-45)。分泌的需求是融合到特定的N-末端信號(hào)肽上，其指引泛素變體朝向Tat孔。在進(jìn)入外周胞質(zhì)空間以后，通過信號(hào)肽酶清除N-末端信號(hào)肽。在外周胞質(zhì)空間中，泛素變體然后共價(jià)地連接到衣殼蛋白PlII或它的C-末端碎片和其他噬菌體蛋白質(zhì)上，其中它的C-末端碎片開始通過Sec途徑從細(xì)胞 質(zhì)分泌。通過pill蛋白的N-末端上的Jun亮氨酸拉鏈和泛素變體的C-末端上的Fos亮氨酸拉鏈的高親和力相互作用，實(shí)現(xiàn)泛素和pill之間的這種連接。每一個(gè)亮氨酸拉鏈的N-和C-末端上外加的半光氨酸能夠在兩種蛋白質(zhì)之間共價(jià)的連接，因此它們也能夠在展示的泛素和它的噬菌體顆粒內(nèi)的編碼基因產(chǎn)物之間共價(jià)的連接。當(dāng)仍然以噬菌粒的形式，例如，融合到噬菌體上，或以可溶解的蛋白形式相應(yīng)的基因盒克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上之后，能完成以這種方式獲得的泛素變體的進(jìn)一步特性。適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的或著作中描述的。特征能包括例如，DNA序列的測(cè)定和因而分離的變體的主要序列。此外,例如,依靠生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法例如ELISA或表面等離子共振技術(shù)、尺寸篩析色譜法、熒光各向異性、熒光光譜、FACS、等溫滴定量熱法或分析超速離心法，能檢測(cè)分離的變體的親和力和特異性。由于穩(wěn)定性分析，例如與化學(xué)或物理伸展有關(guān)的分光鏡方法是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的。其他已知的方法是CD光譜學(xué)、蛋白質(zhì)熒光光譜和NMR光譜法。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例中，在核糖體展示程序中依靠非細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)制備泛素變體，且作為具有相應(yīng)的mRNA和核糖體的復(fù)合體出現(xiàn)。為了這種目的，上述描述的DNA庫(kù)用作基礎(chǔ)元素，其中變體的基因以與相應(yīng)的表達(dá)和蛋白質(zhì)生物合成的調(diào)整序列的融合的形式出現(xiàn)。由于在基因文庫(kù)的3’末端終止密碼子的缺失和由初期的蛋白質(zhì)組成的三重復(fù)合體適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)條件(低溫、高M(jìn)g2+濃度),在生物體外轉(zhuǎn)錄/翻譯期間維持mRNA和核糖體。通過在每一個(gè)單體泛素單元中挑選的氨基酸的不同地修飾，已經(jīng)建立包含異源二聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)庫(kù)之后，如果結(jié)合親和力確實(shí)存在，依照本發(fā)明，修飾的二聚體蛋白質(zhì)與靶分子接觸，以便配體能夠彼此結(jié)合。這些蛋白質(zhì)庫(kù)可以以展示方法庫(kù)的形式展示，或利用任何其他方法呈現(xiàn)修飾的蛋白質(zhì)，修飾的蛋白質(zhì)在一定程度上能夠在修飾的蛋白質(zhì)和靶蛋白之間接觸，其中所述展示方法可選地是噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、細(xì)胞表面展示、酵母展示、細(xì)菌展示或mRNA展示方法。修飾的異源多聚體泛素蛋白的潛在的配體和靶標(biāo)(target，靶分子)在下列典型的抗原上已經(jīng)成功地建立了本發(fā)明ED_B、TNF-a、MIA-2, NGF、和IgG0應(yīng)該理解，僅選擇這些抗原，以便顯示在接收此處提供的信息之后，通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員沒有過度負(fù)擔(dān)下能成功地執(zhí)行目前描述的方法。本發(fā)明不限于這些特定的抗原，但是能夠在本領(lǐng)域中已知的所有或至少大多數(shù)的配體和靶分子上執(zhí)行。能夠通過本領(lǐng)域的熟練的工匠在他的常識(shí)內(nèi)選出那些靶分子。下列提供配體和靶分子和抗原和半抗原的一般定義，且也提供選出的進(jìn)一步潛在的靶分子的實(shí)例。依照本發(fā)明，通過目前描述的功能比得上抗體的修飾的泛素，抗原將涉及限制物質(zhì)的能力。用于此處的可替換的術(shù)語(yǔ)是“配體”、“結(jié)合伴侶”、或“靶分子”。本發(fā)明修飾的泛素蛋白提供結(jié)合分子，其以相似的方式擔(dān)當(dāng)抗體的作用，且同時(shí)避免它的缺陷。術(shù)語(yǔ)抗原包括半抗原、肽、蛋白質(zhì)、糖、DNA等。從Roche Lexikon Medizin(第四版本；Urban&10Fischer/Elsevier GmbH)能獲得下列等義的抗原和半抗原,其也能用于本描述?？乖?AG):通過免疫系統(tǒng)設(shè)計(jì)用作作為外來(lái)物質(zhì)(非自身的)識(shí)別的任何物質(zhì)。在大多數(shù)免疫反應(yīng)情形中，開始引起免疫性(=“免疫原”)；分別在過敏反應(yīng)(=“過敏原”)和遺傳性過敏癥(“遺傳過敏原”)的情形中，這種免疫反應(yīng)是放大的。AG誘導(dǎo)體液(抗原-抗體反應(yīng))和/或細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)(見下文免疫性)。如果AG是容忍的(免疫耐受性)，經(jīng)過免疫系統(tǒng)它也被稱作“耐受原”。有效的抗原是主要復(fù)合體和更高分子量的物質(zhì)(蛋白體、多聚糖、核苷和許多合成的復(fù)合物)，這些物質(zhì)具有以化學(xué)方法可識(shí)別的功能性(決定性的)，這些功能性是造成免疫反應(yīng)的原因。分類為I)完整的AG，更高分子量的大部分且能夠通過自身發(fā)生免疫反應(yīng)，2)作為低分子質(zhì)量半抗原(=一半的抗原)，在結(jié)合(偶聯(lián))到大的載體分子上之后，其只擔(dān)當(dāng)免疫原的作用。涉及例如作為外來(lái)地_、不同的-或同基因的、自體同源的AG ;自體的、異體的、移植、抗癌病毒AG。半抗原簡(jiǎn)易的、低分子量的化學(xué)化合物，其分別地是造成抗原(AG)特異性的原因，或由于它的結(jié)構(gòu)(決定性的)是造成抗體特異性結(jié)合能力的原因，但是與完整的AG相比， 其不能產(chǎn)生過敏反應(yīng)。在結(jié)合到稱為載體的蛋白體上之后，其變成完整的抗原。“配體”或“靶標(biāo)(靶分子)”或“結(jié)合伴侶”是通過目前描述的修飾的異源多聚體泛素蛋白識(shí)別的分子。能夠用于本發(fā)明的實(shí)踐的配體的實(shí)例包括，但不限于，用于細(xì)胞膜受體的促效劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒抗原決定基、激素、激素受體、多肽、肽、酶、酶底物、輔助因子、毒品(例如麻醉劑、類固醇等)、外源凝集素、糖、核苷酸、核酸、低聚糖、蛋白質(zhì)、和單克隆抗體?？傊?，依照本發(fā)明，能利用作為結(jié)合伴侶的修飾的蛋白質(zhì)，其提供所有生物學(xué)上和醫(yī)學(xué)上積極的和有關(guān)的分子。將在下面以實(shí)例的方式描述可能的結(jié)合伴侶。然而，應(yīng)注意，多數(shù)其他可能的配體能加入本列。類似于抗體和抗原之間的關(guān)系，通過進(jìn)一步潛在的配體能完成潛在的結(jié)合伴侶的列。本發(fā)明中，異源二聚體泛素的結(jié)合伴侶的實(shí)例是纖連蛋白額外域(ED-B)、細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子a ) (TNF-a )、MIA-2、免疫球蛋白或它的部分，例如完整的抗體，(例如，免疫球蛋白G)，和生長(zhǎng)因子(例如，NGF，例如，人類神經(jīng)生長(zhǎng)因子)。下面提供這些配體的簡(jiǎn)要描述。然而，強(qiáng)調(diào)所有這些配體是多年來(lái)本領(lǐng)域所熟知的且是各自技術(shù)領(lǐng)域中的專家所熟知的。因此，下列描述只是這些蛋白質(zhì)的某些重要的參數(shù)的概要，因?yàn)槠浒被嵝蛄幸彩且阎?。纖連蛋白額外域(ED-B)是小的結(jié)構(gòu)域，其是通過可替換的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的片段插入到纖維蛋白分子中。已知ED-B涉及癌癥和牛皮癬。顯著地，在幾乎所有人類固體瘤實(shí)體的原發(fā)損害和新陳代謝位置都檢測(cè)到ED-B的高水平表達(dá)，包括胸腺癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、頭和頸和人類皮膚癌、和顱內(nèi)腦膜瘤、和神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤(intracraneal meningioma) (Menrad u. Menssen, 2005)。此外，ED-B 能結(jié)合到診斷試劑上且能順利地用作診斷工具。一個(gè)實(shí)例是它在分子影像中的利用，例如，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和癌癥的檢測(cè)，例如，通過癌癥病人的免疫現(xiàn)象?？赡苡糜谠S多進(jìn)一步的診斷。人類纖維蛋白的額外域B (ED-B)的91氨基酸的氨基酸序列在SEQ ID N0:2中示出。為了蛋白質(zhì)的表達(dá)，已加入起始甲硫氨酸。在哺乳動(dòng)物中ED-B是保守的，例如，在嚙齒動(dòng)物、牛、靈長(zhǎng)類、食肉動(dòng)物、人類等等中。其中與人類ED-B具有100%序列同一性的動(dòng)物的實(shí)例是褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、小家鼠(Mus musculus)、馬(Equus caballus)、稱猴(Macaca mulatta)、家犬(Canis lupus familiaris)、和黑猩猩(Pan troglodytes)。蛋白質(zhì)MIA (“黑素瘤抑制活性”，也稱作⑶-RAP，“軟骨源性維A酸敏感蛋白”)是在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，且由于它的體外抗增值性能其是最初被分離的。最初它是在黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(cell culture supernatant)中檢測(cè)到的且從那里分離。在蛋白質(zhì)純化和部分排序之后，在簡(jiǎn)并引物(degenerated primers)和RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的幫助下分離人類MIA cDNA片段。現(xiàn)在已知人類的、小家鼠的、牛的、褐家鼠的和斑馬魚的MIA序列。在EP1410803B1和US-2010/0212037中描述相關(guān)蛋白質(zhì)MIA-2。這些文獻(xiàn)并入此處以供參考。主要通過巨噬細(xì)胞制造腫瘤壞死因子- a (TNF-a )，一種多效性細(xì)胞因子，但是其他類型的細(xì)胞也產(chǎn)生它。證明TNF-a是有益的并具有病理活性。除了具有自我調(diào)節(jié)外，它具有生長(zhǎng)刺激作用和生長(zhǎng)抑制兩種性能。TNF-a的有益功能包括通過調(diào)節(jié)機(jī)體的生理周 期性維持動(dòng)態(tài)平衡、對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌和寄生的感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)、通過刺激纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)更替或改變受傷的組織和、如名字所暗示的，殺死某些腫瘤。在多種疾病中，已經(jīng)暗示TNF-a作為介導(dǎo)媒介(媒介物)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是50年前發(fā)現(xiàn)的作為促進(jìn)感覺和交感神經(jīng)的生存和分化的分子的分泌蛋白質(zhì)。NGF是已知作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員。NGF具有高親和力的結(jié)合已知作為TrkA的原肌球蛋白受體激酶。NGF也能結(jié)合已知的受體p75，腫瘤壞死因子受體超家族的成員，NGF也與其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素相互作用。NGF的P鏈僅僅負(fù)責(zé)NGF的神經(jīng)生長(zhǎng)刺激活性。P鏈同源二聚化且并入更大的蛋白復(fù)合體中。NGF的結(jié)構(gòu)和功能參考，例如，Sofroniew, M. V. et al. (2001)Annu. Rev. Neurosci. 24:1217-1281;ffeismann, C.and de Vos, A. M. (2001) Cell. MoT Life Sci. 58:748-759;Fahnestock, M. (1991)Curr. Top.Microbiol. Immunol. 165:1—26。IgG抗體是大約150kDa由4條肽鏈組成的大分子。它包括2條大約50kDa的同源重鏈和2條大約25kDa的同源輕鏈，因此是四個(gè)一組結(jié)構(gòu)的四聚物。兩條重鏈彼此連接且通過二硫鍵與輕鏈連接。合成的四聚物具有兩個(gè)共同形成類Y型的同源部分。分支的每一個(gè)末端包含同源的抗原結(jié)合位置。IgGs的Fe區(qū)域具有高度保守的N-糖基化位點(diǎn)。依附在這個(gè)位點(diǎn)上的N-多聚糖是復(fù)雜類型的主要的核心巖藻糖化雙觸角結(jié)構(gòu)。此外，少量的這些N-多聚糖的也具有平分的GIcNAc和a_2，6連接的硅鋁酸殘基。用于選擇、富集和特征化所展示的蛋白質(zhì)的方法能依靠本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行異源多聚體修飾的泛素的選擇，這些泛素就它們對(duì)于特定的配體的結(jié)合活性而言，具有Kd范圍為10_7-10_12M的特定的結(jié)合親和力。為了這個(gè)目的，出現(xiàn)例如在核糖體的復(fù)合體上的泛素變種能分別地短暫地固定在靶物質(zhì)邊緣上，例如，在微量滴定板上，或能在溶液中結(jié)合之后結(jié)合在磁性粒子上。在非結(jié)合變體的分離之后，具有結(jié)合活性的變體的遺傳信息能特定地通過核糖體復(fù)合體的破壞以mRNA的形式洗脫。優(yōu)選地利用EDTA完成洗脫。能分離以這種方式獲得的mRNA且利用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ崔D(zhuǎn)錄成DNA (反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng))，且能再擴(kuò)增以這種方式獲得的DNA。
通過體外的轉(zhuǎn)錄/翻譯、選擇、和擴(kuò)增的連續(xù)循環(huán)，能富集對(duì)預(yù)定的半抗原或抗原具有結(jié)合性能的泛素變體。在相應(yīng)的基因盒克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體之后，能以上述詳述的可溶解蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行以這種方式獲得的泛素變體的進(jìn)一步表征。適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的或在文獻(xiàn)中描述的。優(yōu)選地，在具有對(duì)預(yù)定的結(jié)合伴侶的結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)的檢測(cè)步驟之后是檢測(cè)的蛋白質(zhì)的分離和/或富集的步驟。在依照本發(fā)明修飾的泛素蛋白的表達(dá)之后，能通過本身已知的方法進(jìn)一步純化和富集泛素蛋白質(zhì)。選擇方法依賴本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員本身已知的幾種因素，例如，所使用的表達(dá)載體、宿主生物體、意欲使用的領(lǐng)域、蛋白質(zhì)的大小和其他因素。為了簡(jiǎn)化純化，依照本發(fā)明修飾的蛋白質(zhì)能融合到具有增加的親和力的其他肽序列上以分離材料。優(yōu)選地，選擇這種融合，其不能對(duì)泛素蛋白的功能性具有有害的影響，或者由于特定蛋白酶斷裂位點(diǎn)的引入能夠在純化之后分離這種融合。這些方法也是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的。 作為突變發(fā)生的起始點(diǎn)的未修飾的和修飾的泛素蛋白術(shù)語(yǔ)“具有結(jié)合能力的蛋白質(zhì)”或“結(jié)合蛋白質(zhì)”涉及包括一個(gè)結(jié)合域(bindingregion,結(jié)合區(qū)域)的泛素蛋白質(zhì),這個(gè)結(jié)合域在下面進(jìn)一步定義。結(jié)合域能涉及至少兩個(gè)結(jié)合決定域(“BDR”)。每一個(gè)單體具有至少一個(gè)結(jié)合決定域；至少兩個(gè)單體形成具有至少兩個(gè)結(jié)合決定域的多聚體，其中至少兩個(gè)結(jié)合決定域?qū)σ粋€(gè)抗原形成一個(gè)結(jié)合域。任何這種基于泛素的結(jié)合蛋白可包括不是結(jié)合結(jié)構(gòu)域的附加的蛋白域，例如，多聚化部分(multimerization moieties)、多肽標(biāo)簽、多肽連接子和/或非蛋白質(zhì)聚合體分子。非蛋白質(zhì)聚合體分子的某些實(shí)例是輕乙基淀粉(hydroxyethyl starch)、聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯烴(polyoxyalkylene)。例如通過將異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)遺傳翻譯后地融合到具有多聚體化區(qū)域的效應(yīng)分子上(例如，TNF-Q )，也能夠進(jìn)行異源多聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的進(jìn)一步多聚化。仍然進(jìn)一步的實(shí)施例中，通過利用聚乙二醇(PEG)連接子實(shí)行進(jìn)一步的多聚體化。仍然進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述多聚體化區(qū)域也擔(dān)當(dāng)藥物學(xué)上的活性成分；一個(gè)實(shí)例是擔(dān)當(dāng)多聚體化區(qū)域和藥物學(xué)成分的TNF-a。修飾的異源多聚體的泛素蛋白術(shù)語(yǔ)“修飾的泛素蛋白”涉及泛素蛋白質(zhì)的修飾，這種修飾是通過氨基酸或它的組合的任何一個(gè)取代、插入或缺失實(shí)現(xiàn)的，而取代是最優(yōu)選的修飾，其可通過上述描述的任何一個(gè)的修飾來(lái)補(bǔ)充。修飾的數(shù)目是嚴(yán)格地限制為所述修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%構(gòu)成的組中的至少之一。因此，至多，修飾的氨基酸的總數(shù)，優(yōu)選地在單體單元中的取代限制到相應(yīng)到80%的氨基酸同一性的15個(gè)氨基酸。進(jìn)一步可替換的是13、12、11、10、9、8、7、6、或5個(gè)修飾的氨基酸。二聚體泛素分子中修飾的氨基酸的總數(shù)，優(yōu)選地取代是30個(gè)氨基酸，其相當(dāng)于基于二聚體蛋白質(zhì)的20%的氨基酸的修飾。進(jìn)一步可替換的是二聚體泛素分子中28、26、24、22、20、18、16、14、13、12、11、10、9、9、7、6、或 5 個(gè)修飾的氨基酸。與由具有 SEQ ID NO: I的基礎(chǔ)單體序列的兩個(gè)未修飾的單體泛素蛋白組成的二聚體泛素相比，二聚體修飾的泛素蛋白質(zhì)的氨基酸同一性是選自由80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%構(gòu)成的組中的至少之一。由本發(fā)明的方法獲得的修飾的泛素蛋白質(zhì)是重組設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)，其對(duì)靶分子或配體或結(jié)合分子(其表達(dá)可替換地用于此處)具有新的結(jié)合親和力。術(shù)語(yǔ)“取代”也包括氨基酸的化學(xué)修飾，例如通過取代或向最初的氨基酸添加化學(xué)基團(tuán)或殘基。蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表面暴露的區(qū)域中的氨基酸的取代是至關(guān)緊要的，這種表面暴露區(qū)域中的氨基酸包括位于P片區(qū)域的至少一個(gè)P鏈上的氨基酸或放置在臨近3鏈的多達(dá)3個(gè)氨基酸上的氨基酸。通過本領(lǐng)域已建立的和已知的方法進(jìn)行修飾?！叭我庑揎椀暮塑账峄虬被嵝蛄小笔窃谠S多位置中已經(jīng)插入、缺失或通過核苷酸或氨基酸取代的核苷酸或氨基酸序列，其本 性是不能預(yù)知的。在很多情形中，隨機(jī)的核苷酸(氨基酸)或核苷酸(氨基酸)序列的插入將是“完全隨機(jī)的”(例如，作為隨機(jī)化合成的或PCR-介導(dǎo)的突變發(fā)生的結(jié)果)。然而，隨機(jī)序列也能包含具有共同的功能特征的序列(例如，配體表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng))或者隨機(jī)序列能隨機(jī) 的，表現(xiàn)為最終的表達(dá)產(chǎn)物具有例如不同氨基酸的平均分配的完全隨機(jī)的序列。為了將隨機(jī)化的片段恰當(dāng)?shù)匾胼d體，依照本發(fā)明，按照定點(diǎn)PCR-介導(dǎo)突變的原則隨機(jī)核苷酸引入表達(dá)載體，這是優(yōu)選的。然而，對(duì)于技術(shù)人員其他選項(xiàng)是已知的，和例如將合成的隨機(jī)序列庫(kù)插入載體，這也是可能的。為了通過融合PCR產(chǎn)生突變體或庫(kù)，例如可進(jìn)行三個(gè)PCR反應(yīng)。進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)，以便產(chǎn)生部分地重疊的中間片段。進(jìn)行第三個(gè)PCR反應(yīng)以便融合中間片段。構(gòu)建庫(kù)或突變體變種的方法可包括在期望的限制位點(diǎn)周圍構(gòu)建第一組引物(限制位點(diǎn)引物)，正向和反向限制引物，和在例如感興趣的密碼子的上游和下游周圍構(gòu)建第二組弓I物(誘導(dǎo)有機(jī)體突變的引物)，正向和反向誘導(dǎo)有機(jī)體突變的引物。一個(gè)實(shí)施例中，直接地在感興趣的密碼子各自的上游和下游構(gòu)建引物。限制和誘導(dǎo)有機(jī)體突變的引物用于構(gòu)建第一中間片段和第二中間片段。兩個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)生這些線性中間產(chǎn)物片段。每一個(gè)這些線性中間產(chǎn)物片段包含至少一個(gè)感興趣的密碼子的突變、側(cè)翼核苷酸序列和酶切位點(diǎn)。第三PCR反應(yīng)使用兩個(gè)中間片段和正向和反向限制引物，以便產(chǎn)生融合的線性產(chǎn)物。相反，這里利用限制酶酶切線性產(chǎn)物的獨(dú)立末端，以便在線性產(chǎn)物上形成粘性末端。通過DNA連接酶的使用融合線性產(chǎn)物的粘性末端，以便產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物，例如，環(huán)狀多聚核苷酸序列。為了構(gòu)建中間片段，實(shí)行了兩組正向和反向引物的設(shè)計(jì)和合成，第一組與它的側(cè)翼核苷酸序列一起包含限制性酶酶切位點(diǎn)，和第二組包含至少一個(gè)感興趣的密碼子的變種(誘導(dǎo)有機(jī)體突變的引物)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將認(rèn)可，許多變種將依賴許多期望的變種氨基酸的修飾。發(fā)明者設(shè)想，如果在這個(gè)方法中利用其他限制性酶，則可相應(yīng)地改變這種酶切位點(diǎn)的精確位置和相應(yīng)的正向和反向引物的序列。本領(lǐng)域可利用其他方法且可代替地使用其他方法。除了依照本發(fā)明將表達(dá)產(chǎn)物的隨機(jī)化片段引入骨架之外，還通過將隨機(jī)化的核苷酸序列融合到編碼至少一種融合伴侶的核苷酸序列上來(lái)將隨機(jī)序列連接到融合伴侶上，這是經(jīng)常必需的。例如，這種融合伴侶能促進(jìn)表達(dá)和/或純化/分離和/或表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步的穩(wěn)定性。為了純化的目的，融合伴侶能包括純化標(biāo)簽例如His6標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、BSP生物素靶序列、BirA、flu標(biāo)簽、lacZ、和GST。此外，融合伴侶可包括分選信號(hào)或靶向序列(targeting sequence) 依照本發(fā)明，可利用任何期望的氨基酸進(jìn)行用于產(chǎn)生對(duì)靶分子具有特異性的新的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸的取代，即，為了產(chǎn)生對(duì)靶分子的新的結(jié)合性能的修飾，并不必須關(guān)注氨基酸具有特殊的化學(xué)性能或側(cè)鏈，其與取代的氨基酸類似，因此任何期望的氨基酸能用于這種目的。依照本發(fā)明，優(yōu)選地通過在遺傳水平上的變異發(fā)生，優(yōu)選地通過隨機(jī)的變異發(fā)生，即，所選擇的氨基酸的隨機(jī)取代，進(jìn)行所選擇的氨基酸的修飾的步驟。優(yōu)選地，依靠遺傳工程的方法執(zhí)行泛素的修飾，這種遺傳工程方法用于屬于各自蛋白質(zhì)的DNA的改變。優(yōu)選地，然后在原核或真核生物體中進(jìn)行泛素蛋白質(zhì)的表達(dá)。特別在0片的四個(gè)P鏈的表面暴露的氨基酸中或者在達(dá)到3個(gè)臨近泛素蛋白的3片鏈的氨基酸的表面暴露氨基酸中進(jìn)行取代。每一個(gè)3鏈通常由5-7個(gè)氨基酸組成。對(duì)于SEQ ID N0:1，例如，單體泛素的P鏈通常包括氨基酸殘基2-7、12-16、41-45和65-71。額外地和優(yōu)選地修飾的區(qū)域包括臨近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸(例如，1、2或3)的位置。額 外地和優(yōu)選地修飾的優(yōu)選區(qū)域特別包括氨基酸殘基8-11、62-64和72-75。優(yōu)選的區(qū)域包括連接兩個(gè)0鏈的0轉(zhuǎn)角。例如一個(gè)優(yōu)選的￠-轉(zhuǎn)角包括例如氨基酸殘基62-64。接近地臨近P鏈的最優(yōu)選的氨基酸是位置8的氨基酸。另外，氨基酸取代的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)例是位置36、44、70、71和/或73。例如，那些可額外地和優(yōu)選地修飾的區(qū)域包括氨基酸62、63和64 (3個(gè)氨基酸)，或72、73 (2個(gè)氨基酸)，或8 (1個(gè)氨基酸)。可添加或缺失的氨基酸的數(shù)目限于單體泛素子單元中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14個(gè)或更多的氨基酸，和關(guān)于異源二聚物泛素蛋白質(zhì)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、24、26或28個(gè)氨基酸，通常是單體蛋白質(zhì)中修飾的數(shù)目是X-倍。通常，單體分子中插入的數(shù)目包括1-10個(gè)氨基酸和/或1-7個(gè)氨基酸的缺失。取代的數(shù)目是每個(gè)單體分子至少6個(gè)和最多14個(gè)氨基酸的取代。二聚體分子總共包括至少12和最多28個(gè)取代，和/或總共至少一個(gè)和最多20個(gè)插入和/或至少一個(gè)和最多14個(gè)缺失。本發(fā)明能利用在中間的所有數(shù)目并涵蓋在本發(fā)明中，和缺失、插入和取代數(shù)目的所有組合可能提供維持分子的全部結(jié)構(gòu)完整性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，維持P片結(jié)構(gòu)?？蛇x擇的實(shí)施例中，通過氨基酸取代改變氨基酸殘基。然而，也可允許缺失和插入。可添加或缺失的氨基酸數(shù)目限于單體泛素子單元中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，和關(guān)于二聚體泛素蛋白相應(yīng)地1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個(gè)氨基酸。一個(gè)實(shí)施例中，沒有進(jìn)行氨基酸的插入。仍然進(jìn)一步的實(shí)施例中，沒有缺失。假如本發(fā)明的修飾的泛素蛋白包括權(quán)利要求中指定的外加的所述取代和也包括此處說(shuō)明的缺失和/或一個(gè)或更多氨基酸的增加，特定的野生型人類泛素(SEQ ID NO: I)的氨基酸位置必需與修飾的泛素比對(duì)，以便彼此分配相應(yīng)的蛋白質(zhì)。融合蛋白的情況中(見下文)，以相同的方式完成每一個(gè)單體泛素子單元的編號(hào)(和比對(duì))，例如，二聚體的比對(duì)是在每一個(gè)各自的子單元的氨基酸位置I起始的。優(yōu)選地來(lái)自哺乳動(dòng)物例如人類的單體泛素蛋白中，在P鏈中或在臨近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的位置至少10%的氨基酸，優(yōu)選地至少20%，進(jìn)一步優(yōu)選地至少25%，能被修飾，優(yōu)選地被取代。在P鏈中或臨近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的位置的優(yōu)選地最多大約50 %的氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選地最多大約40 %或大約35 %或高達(dá)大約30 %或高達(dá)大約25 %是被修飾的，優(yōu)選地被取代。一個(gè)3鏈中，通常一個(gè)到四個(gè)氨基酸被修飾。一個(gè)實(shí)施例中，修飾3鏈中六個(gè)氨基酸中的兩個(gè)，優(yōu)選地在第一和第四3鏈中，例如，氨基酸殘基2-7或65-71的區(qū)域。依照本發(fā)明，修飾的單體泛素用作異源多聚物基礎(chǔ)成分，說(shuō)明了總數(shù)達(dá)到20%的氨基酸是被修飾的?？紤]到這個(gè)方面，修飾的泛素蛋白與SEQ ID NO: I的序列同一性至少是80 %。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例中，氨基酸水平上的序列同一性是至少83 %、至少85 %、至少87%和更進(jìn)一步的至少90%、至少92%或至少95%的與SEQ ID N0:1的氨基酸序列的序列同一性。與SEQ ID NO: I的氨基酸序列相比，本發(fā)明也包含氨基酸序列同一性超過97%的修飾的泛素蛋白質(zhì)。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例中，已經(jīng)預(yù)修飾的泛素(其中已經(jīng)修飾位置2、4、6、8、62、63、64、65、66中3或4或5或6或7個(gè)氨基酸和/或SEQ ID NO: I的位置68中的氨基酸)被用作進(jìn)一步修飾的起始位點(diǎn)，以便對(duì)靶分子產(chǎn)生結(jié)合性能，且可獲得泛素，其中總數(shù)達(dá)到SEQ ID NO: I的泛素的9、10、11、12、13、14個(gè)和最大限度的15個(gè)氨基酸被修飾，優(yōu)選地被取 代。例如，進(jìn)一步的修飾能包括氨基酸74和75或氨基酸45上的修飾，以便產(chǎn)生更好的穩(wěn)定性或蛋白質(zhì)化學(xué)性能。依照實(shí)例，能以這種方式獲得的作為異源多聚體的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)成分的修飾的單體泛素具有14個(gè)取代和缺失。在泛素的氨基酸的總數(shù)上這對(duì)應(yīng)大約20%的百分比。這是非常不可思議的且不是預(yù)期的，因?yàn)橥ǔ５偷枚嗟陌俜謹(jǐn)?shù)已經(jīng)足夠打亂蛋白質(zhì)的折置。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，修飾那些氨基酸，以便具有新的結(jié)合性能的區(qū)域的產(chǎn)生，這些結(jié)合性能在蛋白質(zhì)的表面上形成鄰近區(qū)域。以這種方式，能產(chǎn)生鄰近區(qū)域，其對(duì)目標(biāo)配體具有結(jié)合性能。依照本發(fā)明，“鄰近區(qū)域”涉及以下由于電荷，立體結(jié)構(gòu)和它們側(cè)鏈的疏水性/親水性，氨基酸以相應(yīng)的方式與它們的環(huán)境相互作用。環(huán)境可以是溶劑，通常水，或其他分子，例如，空間地接近氨基酸。依靠蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息和各自軟件，能表征蛋白質(zhì)的表面。例如，以這種方式能顯現(xiàn)蛋白質(zhì)的原子和溶劑之間的界面區(qū)域，其中這種方式包括如何構(gòu)成這種界面區(qū)域的信息，其表面區(qū)域易接近溶劑或在表面上電荷如何分布。例如利用適當(dāng)?shù)能浖ㄟ^這種類型的顯像能顯示鄰近區(qū)域。這種方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。依照本發(fā)明，基本上，整個(gè)表面暴露區(qū)域也能用作表面上的鄰近區(qū)域，以便修飾用于新的結(jié)合性能的產(chǎn)生。一個(gè)實(shí)施例中，這種目的的修飾也能包括a-螺旋區(qū)域。異源二聚體修飾的泛素蛋白中，結(jié)合決定區(qū)域包括共同形成的一個(gè)鄰近區(qū)域的兩個(gè)表面暴露區(qū)域，一個(gè)鄰近區(qū)域包括一個(gè)結(jié)合決定區(qū)域的長(zhǎng)度的兩倍。在包括0片區(qū)域的至少一個(gè)P鏈或鄰近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的位置的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表面暴露的區(qū)域中的氨基酸的修飾是至關(guān)緊要的。片結(jié)構(gòu)”定義為基本上是片狀的且?guī)缀跏峭耆煺沟?。與由連續(xù)的多肽鏈部分形成的a螺旋相比，P片能由不同的多肽鏈區(qū)域形成。這種方式中，在主要的結(jié)構(gòu)中進(jìn)一步分離空開的區(qū)域能進(jìn)入彼此親近區(qū)域。3鏈代表性地具有5-10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度(泛素中通常5-6個(gè)殘基)且具有幾乎完全伸長(zhǎng)的構(gòu)造。P鏈彼此如此接近因此一個(gè)鏈的C-O基團(tuán)和另一個(gè)鏈的NH基團(tuán)之間形成氫鍵，反之亦然。P片能由幾條鏈形成且具有片狀結(jié)構(gòu)，其中C a原子的位置交替地在片狀平面的上面或下面之間。氨基酸側(cè)鏈沿著這種模式和，因此，可替換地點(diǎn)對(duì)著頂端或?qū)χ撞?。依靠P鏈的方向，片可分為平行和反平行片。依照本發(fā)明，兩者都能轉(zhuǎn)換且用于制備需要的蛋白質(zhì)。對(duì)于0片結(jié)構(gòu)的變異發(fā)生，在接近表面的泛素中選擇0鏈區(qū)域或鄰近0片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的位置。使用相關(guān)的有用的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)能識(shí)別表面暴露的氨基酸。如果晶體學(xué)結(jié)構(gòu)是不可用的，依靠計(jì)算機(jī)分析做出嘗試，以便預(yù)知表面暴露的P片區(qū)域和關(guān)于有用的一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)別氨基酸的可達(dá)性或者模擬3d蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和用這種方式獲得關(guān)于潛在的表面暴露的氨基酸的信息。能進(jìn)一步結(jié)合它的公開，例如，J. Mol. Biol.，1987 Apr5; 194 (3) : 531-44. Vijay-Kumar S，Bugg C. E.，Cook ff. J.。然而，在P片中或鄰近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的位置實(shí)行修飾也是可能的，因?yàn)槟苁÷员徽T變的氨基酸位置的消耗時(shí)間的預(yù)選。編碼P片結(jié)構(gòu)或鄰近P片鏈達(dá)到3個(gè)氨基酸的那些DNA區(qū)域是從它們的DNA環(huán)境中分離的，這些DNA環(huán)境受到隨意的突變發(fā)生和然后那些DNA區(qū)域再恢復(fù)成譯碼蛋白質(zhì)的DNA，它們是先前從蛋白質(zhì)中清除的。這之后跟隨的是具有期望的結(jié)合性能的突變體的選擇工藝。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，P鏈區(qū)域或表面附近鄰近P片鏈多達(dá)3個(gè)氨基酸，像上述解釋過的那樣被選擇，且在這些選擇的區(qū)域內(nèi)識(shí)別將被誘變的氨基酸位置。用這種方法選取的氨基酸位置可在DNA的水平被誘變，也通過位置導(dǎo)向的突變，也就是說(shuō)，一個(gè)特定的氨基酸密碼子譯碼被另外一個(gè)之前選擇的密碼子編碼氨基酸所代替，或者這種突變?cè)陔S機(jī)突變的環(huán)境下執(zhí)行，其中，定義即將被取代的氨基酸位置，但它不是新的密碼子編碼，也不是決定的氨基酸。表面暴露的氨基酸是易受周圍溶劑影響的氨基酸。與三態(tài)甘氨酸-X-甘氨酸模式中的氨基酸的易受影響性相比，如果蛋白質(zhì)中的氨基酸的易受影響性超過8%，則氨基酸就被稱為“表面暴露的”。這些蛋白質(zhì)區(qū)域或個(gè)別的氨基酸位置也分別是潛在的結(jié)合伴侶優(yōu)選的結(jié)合位置，因?yàn)榻Y(jié)合伴侶的選擇將依照本發(fā)明實(shí)行。另外，參考Casteret al, 1983 Science, 221，709-713，和 Shrake&Rupley,1973 J Mol Biol. 79(2):351-371,其全部的公開包含在這個(gè)申請(qǐng)中以供參考。通過各自序列片段的定向突變，能夠產(chǎn)生泛素變體。這種變體不同于在重新產(chǎn)生的來(lái)自于親本蛋白質(zhì)和來(lái)自于各自的蛋白質(zhì)的人造結(jié)合位置區(qū)域的氨基酸置換。在此情形下，具有某些性質(zhì)，例如極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的氨基酸，能分別被具有其他特性的氨基酸代替或取代。除了取代之外，術(shù)語(yǔ)“變異發(fā)生”與“修飾”和“代替”也包括插入和缺失。依照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，也能通過氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)變化完成蛋白質(zhì)水平上的修飾。泛素變異發(fā)生的方法作為各自序列片段突變發(fā)生的起始點(diǎn)，例如泛素的cDNA，其能通過利用本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的方法制備、改變、和擴(kuò)增。對(duì)于相對(duì)小的第一序列(大約1-3個(gè)氨基酸)的區(qū)域中泛素的位置特定的改變，商業(yè)上可用的反應(yīng)物和方法是現(xiàn)有的(“迅速的改變”，Stratagene ;“誘變劑曬菌粒體外變異發(fā)生裝置”，Biorad)。例如,對(duì)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的更大區(qū)域特定實(shí)施例的位置定向的變異發(fā)生是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員可利用的。對(duì)于這種在期望的位置上合成具有退火堿基對(duì)組成的寡脫氧核苷酸的混合物的目的可被利用，例如用于突變的引入。這也能通過利用堿基對(duì)類似物獲得，堿基對(duì)類似物不能自然地出現(xiàn)在染色體組DNA中，例如，次黃嘌呤核苷。起始點(diǎn)對(duì)于0片區(qū)域的一個(gè)或更多P鏈或鄰近P片鏈多達(dá)3個(gè)氨基酸的位置的變異發(fā)生可以是例如泛素的cDNA或也能是染色體組DNA。此外，用于泛素蛋白質(zhì)的基因譯碼也能是合成制備。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，變異發(fā)生是通過攜帶氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸的裝配來(lái)完成的。然而，應(yīng)該理解，也能利用其他密碼子(三聯(lián)密碼)。突變是在P片結(jié)構(gòu)優(yōu)選地維持的方式中執(zhí)行的。通常，變異形成發(fā)生在暴露在蛋白質(zhì)表面上的穩(wěn)定的@片區(qū)域的外面上。它包括位置指定變異和隨意變異兩種。位置特定的變異在原始結(jié)構(gòu)中包括相對(duì)小的區(qū)域(大約3-5個(gè)氨基酸),此種變異能利用商業(yè)上可用的裝置Stratagene⑩(QuickChange (R))或 Bio-Rad ⑩ Mutagene _ phagemid in vitro mutagenesis kit) (cf.US 5，789，166;US 4，873，192)產(chǎn)生。如果更多的延伸區(qū)域隸屬于位置特定的變異，則必需制備DNA盒，其中，誘變的區(qū)域是通過包含突變和未改變位置的寡核苷酸的裝配獲得(Nord et al, 1997 Nat.Biotechnol. 8，772-777;McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250，460-470.)。通過在致突變菌株中DNA的繁殖或通過PCR擴(kuò)增(易錯(cuò)PCR)能引起隨機(jī)變異的發(fā)生(例如，Pannekoek et al., 1993 Genel28, 135 140)。為了這個(gè)目的，使用具有增加錯(cuò)誤率的聚合酶。為了分別增強(qiáng)引入的變異形成的程度或聯(lián)合不同的突變，通過DNA改組的方法，組合PCR片段中的突變(Stemmer，1994 Nature 370, 10 389-391 )。這些關(guān)于酶的變異形成的策略的評(píng)論是在Kuchner和Arnold (1997) TIBTECH15, 523-530的評(píng)論中提供的。為了在選擇的DNA區(qū)域完成隨機(jī)變異形成，也必需構(gòu)建用于變異形成的DNA盒。已知本質(zhì)上用于變異發(fā)生的不同的程序是用于位置特定的突變發(fā)生的方法、用于隨機(jī)變異發(fā)生的方法、利用PCR或類似的方法的變異。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例中，誘變的氨基酸位置是預(yù)先確定的。完成要修飾的氨基酸的選擇，以便滿足本權(quán)利要求I關(guān)于那些必需要修飾的氨基酸的限制。每一個(gè)情形中，通常建立不同突變異種的庫(kù)，其是利用本質(zhì)上已知的方法進(jìn)行篩選的。通常，要修飾的氨基酸的預(yù)選能特別容易地執(zhí)行，因?yàn)閷?duì)于要修飾的泛素蛋白質(zhì)而言，有足夠的結(jié)構(gòu)信息可用。對(duì)于定向變異和更長(zhǎng)序列片段變異發(fā)生的方法，例如，依靠PCR，通過化學(xué)的變異發(fā)生或利用細(xì)菌突變菌株，屬于以前的技術(shù)，依據(jù)本發(fā)明，這些方法也是可以用的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，變異發(fā)生是通過攜帶氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸的裝配來(lái)完成的。然而，應(yīng)該理解，也能利用其他密碼子(三聯(lián)密碼)。突變是在P片結(jié)構(gòu)優(yōu)選地維持的方式中執(zhí)行的。通常，變異形成發(fā)生在暴露在蛋白質(zhì)表面上的穩(wěn)定的@片區(qū)域的外面上。它包括位置指定變異和隨意變異兩種。位置特定的變異在原始結(jié)構(gòu)中包括相對(duì)小的區(qū)域(大約3-5個(gè)氨基酸),此種變異能利用商業(yè)上可用的裝置Stratagene _(QuickChange (R))或 Bio-Rad ⑩ Mutagene _ phagemid in vitro mutagenesis kit) (cf.US 5，789，166;US 4，873，192)產(chǎn)生。如果更多的延伸區(qū)域隸屬于位置特定的變異，則必需制備DNA盒，其中，誘變的區(qū)域是通過包含突變和未改變位置的寡核苷酸的裝配獲得(Nord et al, 1997 Nat.Biotechnol. 8，772-777;McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250，460-470.)。通過在致突變菌株中DNA的繁殖或通過PCR擴(kuò)增(易錯(cuò)PCR)能引起隨機(jī)變異的發(fā)生(例如，Pannekoeket al., 1993 Genel28, 135 140)。為了這個(gè)目的，使用具有增加錯(cuò)誤率的聚合酶。為了分別增強(qiáng)引入的變異形成的程度或聯(lián)合不同的突變，通過DNA改組的方法，組合PCR片段中的突變(Stemmer, 1994 Nature 370, 10 389-391 )。這些關(guān)于酶的變異形成的策略的評(píng)論是在Kuchner和Arnold (1997) TIBTECH15, 523-530的評(píng)論中提供的。為了在選擇的DNA區(qū)域完成隨機(jī)變異形成，也必需構(gòu)建用于變異形成的DNA盒。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，能特別容易地依靠PCR執(zhí)行在單體泛素的位置2、4、6、8、62、62、64、65、66和/或68上的至少3個(gè)，更優(yōu)的是至少6個(gè)氨基酸的隨機(jī)取代，因?yàn)樘峒暗奈恢檬蔷植炕咏鞍踪|(zhì)的氨基或羧基末端。相應(yīng)地，要處理的密碼子是在相對(duì)應(yīng)的cDNA鏈的5’和3’端。因而，用作誘變的PCR反應(yīng)的第一寡核苷酸——遠(yuǎn)離要變異的位置 2、4、6、和/或8上的密碼子一與泛素的氨基末端的譯碼鏈的序列一致。因此，第二寡核
苷酸-遠(yuǎn)離要變異的位置62、63、64、65、66和/或68的密碼子-至少部分地對(duì)應(yīng)非譯
碼鏈的多肽序列的羧基末端。利用作為模板的編碼單體泛素蛋白的DNA序列，通過兩種寡核苷酸，可完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。此外，利用側(cè)面寡核苷酸能將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物添加到另一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，其中寡核苷酸為限制性核酸內(nèi)切酶引入識(shí)別序列。依照本發(fā)明，首選的是將獲得的基因盒引入到載體系統(tǒng)，載體系統(tǒng)適用于后來(lái)的選擇過程，選擇過程用于對(duì)預(yù)定的半抗原或抗原具有結(jié)合性能的泛素變體的分離。依照本發(fā)明，可使用任何例如用于修飾的氨基酸實(shí)行氨基酸的取代，其用于對(duì)靶分子特定的新的結(jié)合區(qū)域的產(chǎn)生，以便對(duì)靶分子產(chǎn)生新的結(jié)合性能，注意氨基酸分別具有具體的化學(xué)性能或側(cè)鏈，這不是強(qiáng)制性的，這類似于氨基酸的取代酸，因此任何期望的氨基 酸能被用于這種目的。依照本發(fā)明，優(yōu)選地通過遺傳水平上變異發(fā)生通過隨機(jī)的變異發(fā)生，實(shí)行選擇的氨基酸的修飾步驟，例如，選擇的氨基酸的隨機(jī)取代。優(yōu)選地，依靠遺傳工程的方法執(zhí)行泛素的修飾，其中遺傳工程方法用于屬于各自蛋白質(zhì)的DNA的改變。優(yōu)選地，然后在原核或真核生物體中執(zhí)行泛素蛋白的表達(dá)。依照本發(fā)明，通過化學(xué)合成能進(jìn)一步優(yōu)選地制備修飾的泛素蛋白質(zhì)。優(yōu)選的實(shí)施例中，通過氨基酸取代改變氨基酸殘基。然而，也允許缺失和插入?？蛇x地，要插入或缺失的氨基酸的數(shù)目是I比10，1比5，2，3或4個(gè)氨基酸。一個(gè)實(shí)施例中，沒有做出氨基酸的插入。一個(gè)仍然進(jìn)一步的實(shí)施例中，沒有實(shí)行缺失。在做出上述的修飾之后，發(fā)明家已發(fā)現(xiàn)實(shí)施例中描述的氨基酸修飾的泛素序列， 這些泛素序列結(jié)合它們的靶分子具有很高的親和力(Kd值達(dá)到IO-wMX泛素中要修飾的區(qū)域根據(jù)它們是否是選擇的結(jié)合伴侶有用的和蛋白質(zhì)的總體結(jié)構(gòu)是否可能忍受修飾，從根本上選擇修飾的區(qū)域。除了表面暴露P鏈中的修飾之外，也能在蛋白質(zhì)的其他表面暴露的區(qū)域中進(jìn)行修飾，優(yōu)選地在鄰近3鏈高達(dá)3個(gè)氨基酸的位置中。這些修飾區(qū)域都涉及對(duì)靶分子重新產(chǎn)生的具有聞未和力的結(jié)合。依照本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例，能在單體泛素中修飾泛素、優(yōu)選地哺乳動(dòng)物或人類泛素的至少3或4或6個(gè),可選地至少8、10、12個(gè)和最大15個(gè)表面暴露的氨基酸,其中優(yōu)選的取代作為修飾。這包括泛素的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個(gè)表面暴露的氨基酸的修飾。這些至少3個(gè)和最大15個(gè)表面暴露的修飾的氨基酸然后形成對(duì)預(yù)先確定的結(jié)合伴侶具有結(jié)合親和力的區(qū)域。此處這個(gè)區(qū)域被定義為“結(jié)合域區(qū)域”(“BDR”)。這個(gè)方面中，至少2個(gè)，可選地至少4個(gè)，進(jìn)一步可選地至少6、8、10、12個(gè)和最大15個(gè)表面暴露的氨基酸是在P片區(qū)域中，例如，^片鏈中或分布在幾個(gè)P鏈上或鄰近P片鏈高達(dá)3個(gè)氨基酸的位置上，這是顯著地優(yōu)選的。所有修飾、優(yōu)選地取代的氨基酸中的至少3個(gè)氨基酸是在初始序列中彼此直接地鄰近，這是進(jìn)一步優(yōu)選的。本發(fā)明的另一個(gè)可選擇的實(shí)施例中，蛋白質(zhì)中四個(gè)P鏈的一個(gè)或兩個(gè)，優(yōu)選地兩個(gè)中的氨基酸或鄰近優(yōu)選地四個(gè)3鏈中的兩個(gè)的高達(dá)3個(gè)氨基酸的位置上的氨基酸進(jìn)行修飾，以便產(chǎn)生新的結(jié)合性能?？蛇x擇的是四個(gè)P鏈的三個(gè)或四個(gè)中的氨基酸或臨近3鏈的三個(gè)或四個(gè)的高達(dá)3個(gè)氨基酸的位置的氨基酸的用于產(chǎn)生對(duì)選擇的靶分子或配體的結(jié)合的修飾。 對(duì)氨基末端和羧基末端鏈或者鄰近氨基末端和羧基末端鏈的高達(dá)3個(gè)氨基酸的位置中的氨基酸進(jìn)行修飾，優(yōu)選地取代，以便對(duì)配體或靶分子產(chǎn)生新的結(jié)合位置，這是顯著地優(yōu)選的。這個(gè)方面中，顯著地優(yōu)選的是，鄰近羧基末端3片鏈的高達(dá)3個(gè)氨基酸被修飾，優(yōu)選地取代，和修飾鄰近氨基末端3片鏈達(dá)到I個(gè)氨基酸，優(yōu)選地取代。依照本發(fā)明，在它的氨基酸中修飾泛素，優(yōu)選地通過取代，在哺乳動(dòng)物泛素的下列位置的至少三個(gè)氨基酸中，優(yōu)選地人類泛素2、4、6、8、62、63、64、65、66、68。這些所述氨基酸的組中的至少三個(gè)氨基酸在泛素表面上形成鄰近的表面暴露區(qū)域，其中發(fā)現(xiàn)泛素顯著地適于具有結(jié)合親和力的修飾的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)于特定的結(jié)合伴侶，例如，ED-B, TNF a，NGF, IgG, MIA-2,或者任何其他靶分子，結(jié)合親和力是先前不存在的。必需修飾這些氨基酸殘基中的至少三個(gè)?？蛇x地修飾所述氨基酸殘基的3、4、5、6、7、8、9或10位，優(yōu)選地取代，可選地與附加的氨基酸殘基結(jié)合。為了確定泛素衍生物與SEQ ID NO: I的氨基酸序列的序列同一性的程度的目的，例如，能利用 SIM Local 類似地程序(Xiaoquin Huang and Webb Miller, " Advances inApplied Mathematics, 20 vol. 12:337-357，1991)，能自由的使用作者和他們的協(xié)會(huì)有用的多重聯(lián)合分析(Thompson et al. , Nucleic Acids Res.，22 (22) : 4673-4680，1994.)。優(yōu)選地，相對(duì)于SEQ ID NO: I的完整序列，衍生物與SEQ ID NO: I的序列同一性的程度是確定的。決定結(jié)合親和力的方法是本身已知的，且能從下列方法中選出ELISA、表面等離子共振技術(shù)(SPR)基礎(chǔ)技術(shù)、例如通過Biacore⑩提供的、尺寸篩析色譜法、熒光各向異性、熒光光譜和等溫滴定量熱儀(ITC)。仍然進(jìn)一步方法，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的異源多聚體結(jié)合蛋白的融合蛋白，這種融合蛋白融合到藥學(xué)上和/或診斷上的有效部分上；做出參考，例如US 7，838，629，其全部?jī)?nèi)容包括在此以供參考。本發(fā)明的融合蛋白可包括非多肽成分，例如，非肽連接子、非肽配體，例如用于治療學(xué)上或診斷上相關(guān)的放射性核素。它也可包括小的有機(jī)的或非氨基酸基礎(chǔ)的混合物，例如，糖、寡聚或多聚糖、脂肪酸，等等。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，以泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合分子連接到肽、以氨基酸基礎(chǔ)的連接子或配體或蛋白質(zhì)上，其中蛋白質(zhì)具有治療學(xué)上或診斷上相關(guān)的性能。結(jié)合特異性(分離常數(shù))
依照本發(fā)明，融合蛋白的結(jié)合特異性是如上定義的對(duì)于非融合蛋白的Kd定義。依照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“Kd”定義特定的結(jié)合親和力，其根據(jù)本發(fā)明在范圍10_7-10_12M之內(nèi)。10_5M和以下的值能夠被認(rèn)為是可定量的結(jié)合親和力。依照本申請(qǐng)，10_7到10_nM的值優(yōu)選的用于例如色析法應(yīng)用，或者10-9到KT12M是用于例如診斷或治療的應(yīng)用。進(jìn)一步優(yōu)選的結(jié)合親和力范圍為Kr7到KTiqM,優(yōu)選地到l(TnM。泛素的多聚化依照本發(fā)明，遺傳上通過首尾融合連接的至少兩個(gè)不同地修飾的泛素單體結(jié)合到靶分子的相同抗原決定基上，例如，ED-B, TNFa、IgG, Mia-2, NGF或者任何其他靶分子上，且只有當(dāng)兩個(gè)結(jié)合域區(qū)域共同起作用則兩個(gè)不同地修飾的泛素單體是有效的?；蛘邠Q句話說(shuō)，他們通過單個(gè)鄰近的結(jié)合區(qū)域結(jié)合到相同的抗原決定基上，其中單個(gè)鄰近的結(jié)合區(qū)域是由兩個(gè)分子的兩個(gè)結(jié)合區(qū)域的共同作用形成的。
單體能直接地連接或通過連接子連接。適當(dāng)優(yōu)選的連接子是SEQ ID N0:32的那些，或具有至少序列GIG，或者具有至少序列SGGGG或任何其他連接子，例如GIG、SGGGG,SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或者SGGGGSGGGG。然而，有很多可能用于替代的連接子。庫(kù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在包含編碼上述描述的修飾的單體泛素蛋白的DNA庫(kù)，其形成提供本發(fā)明的異源多聚體、優(yōu)選地異源二聚體泛素蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。本發(fā)明仍然進(jìn)一步的方面中，提供包括DNA的融合庫(kù)，其中DNA是通過如上述詳述的兩個(gè)庫(kù)融合獲得的；為了獲得異源二聚體泛素融合蛋白，每一個(gè)庫(kù)編碼不同地修飾的單體泛素蛋白單元，它的單體單元以首尾排列連接在一起。所述編碼泛素的異源二聚體的融 合蛋白的庫(kù)對(duì)特定的靶分子表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性。通過利用任何一個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的連接子或者此處描述的連接子實(shí)行所述的連接?！安煌匦揎棥币舶ó愒炊垠w蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的一個(gè)可替換的未修飾分子。實(shí)施例I略述復(fù)合體庫(kù)的產(chǎn)物。然而，必需當(dāng)心關(guān)于這種庫(kù)的質(zhì)量。骨架技術(shù)中庫(kù)的質(zhì)量是首先依靠它的復(fù)雜性(單獨(dú)變體的數(shù)目)和功能性(合成的候選物的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)化學(xué)整體性)。然而，兩種特征可彼此表現(xiàn)負(fù)面影響通過骨架上修飾的位置的數(shù)目的增加增強(qiáng)庫(kù)的復(fù)雜性，可導(dǎo)致變體的蛋白質(zhì)化學(xué)特征的退化。這可能導(dǎo)致減少的溶解性、聚集和/或低產(chǎn)量。這樣的原因是天然的骨架更大的反常，天然的骨架具有積極地有利的蛋白 質(zhì)包裝。因此，原始序列中引入盡可能多的變體以便為靶分子最優(yōu)化它，另一方面，盡可能保存原始的最初序列以便避免蛋白質(zhì)化學(xué)的負(fù)面效果，在這兩者之間適當(dāng)?shù)貥?gòu)建這種骨架庫(kù)，這是平衡操作。異源二聚泛素蛋白中特定的修飾依照本發(fā)明，泛素的異源二聚體對(duì)配體結(jié)合具有的Kd = 10_7_10_12M，且關(guān)于所述配體表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性，從下列兩個(gè)可替換方案中選出泛素的異源二聚體(I)第一單體單元中至少在氨基酸位置6、8、63、64、65、和、66的取代；和在第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65、和66的取代；可選地另加在位置2的取代，和(2)第一單體單元中至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66的取代；和
第二單體單元中至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66，可選地另加位置2的取代。一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白是所述泛素蛋白質(zhì)的遺傳上的融合二聚物，其中泛素蛋白在第一泛素單體的位置6、8、63-66的氨基酸取代和在第二泛素單體的位置6、8、62-66、和可選地位置2的氨基酸殘基取代，優(yōu)選地-第一泛素單體中的取代位置6上的賴氨酸(K)到色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，位置8上的亮氨酸(L)到色氨酸或苯丙氨酸(W，F(xiàn))，位置63，25上的賴氨酸(K)到精氨酸(R)或組氨酸(H)， 位置64上的谷氨酸(E)到賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)，位置65上的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)和位置66中的蘇氨酸(T)脯氨酸(P);-第二泛素單體中，優(yōu)選的取代是位置6上的賴氨酸(K)到蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)或谷酰胺(Q)，位置8上的亮氨酸(L)到谷酰胺(Q)或蘇氨酸(T)或天冬酰胺(N)或絲氨酸(S)，位置62上的谷酰胺(Q)到色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，位置63上的賴氨酸(K)到絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)或谷酰胺(Q)，位置64上的谷氨酸(E)到天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、或谷酰胺(Q)，位置65上的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)，和位置66上的蘇氨酸(T)到谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，和位置2上可選地谷氨酰胺(Q)到精氨酸(R)、組氨酸(H)或賴氨酸(K)。這些每個(gè)單體中可替換的取代能彼此沒有任何限制的結(jié)合，假設(shè)合成的修飾的泛素異源二聚體對(duì)所述配體顯示特定的結(jié)合親和力Kd = 10_7-10_12M，且關(guān)于所述配體表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性，條件是沒有破壞或妨礙泛素蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。最優(yōu)選的是下列取代(I)第一單體單元中至少 K6W、L8W、K63R、E64K、S65F、和 T66P ；和第二單體單元中至少1(61\180、0621、1(635、￡64隊(duì)565、和166￡；可選地另加Q2R，或者(2)第一單體單元中至少 Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和 T66S ；和第二單體單元至少位置6、8、62、63、64、65、和66中的修飾，進(jìn)一步可選地第二單體單元中至少K6X、L8X、Q62X、K63X、E64X、S65X、和 T66X ;可選地另加 Q2X，
其中X能是任何氨基酸。顯著地優(yōu)選的是下列第一泛素單體中的取代，以便產(chǎn)生對(duì)ED-B的結(jié)合蛋白2 :Q — T、4 F — W、6 K — H、62 Q — N、63 K — F、64 E — K、65 S — L、66 T — S。沒有使用連接子或能使用任何連接子來(lái)連接兩個(gè)單體的首尾。優(yōu)選地連接子是SEQ ID NO: 32的那些或者序列GIG或者SGGGGIG或者SGGGGSGGGGIG。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，具有兩個(gè)共同起作用的結(jié)合決定區(qū)域的、結(jié)合配體ED-B的泛素異源二聚物包括SEQ ID NO: 33或34的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的包括作為藥學(xué)上有效部分的TNF-a的融合蛋白具有SEQ ID N0:35或36的序列。另一個(gè)實(shí)施例中，具有兩個(gè)共同起作用的結(jié)合決定區(qū)域的、結(jié)合配體ED-B的泛素異源二聚物包括圖11的氨基酸序列，與 SEQ ID NO:XX 對(duì)應(yīng)。由下列序列提供進(jìn)一步優(yōu)選的蛋白質(zhì)，其中XXXX可以是任何氨基酸(SEQ IDN0:47)。MTIWVHTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNINFKLSLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQTFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNTXXXXXLHLVLRLRGG圖11中示出具有這些序列的蛋白質(zhì)的實(shí)例。作為連接子，SGGGGSGGGGIG用于此處應(yīng)該理解，其他類型的連接子或沒有連接子也是切實(shí)可行的可替換方案。本發(fā)明的多聚核苷酸、宿主細(xì)胞載體本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明也包括多聚核苷酸，其編碼之前描述的蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明包含包括所述多聚核苷酸的載體。本發(fā)明的另外的方面中，宿主細(xì)胞包括此處描述的蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)和/或編碼所述重組蛋白的多聚核苷酸或本發(fā)明的融合蛋白或包含所述多聚核苷酸的載體。修飾的異源多聚體的泛素分子的用途本發(fā)明具有以高親和力結(jié)合配體的能力的修飾的泛素蛋白用于例如制備用于體內(nèi)或體外使用的診斷工具和治療工具。依照本發(fā)明，例如，蛋白質(zhì)能用作直接的效應(yīng)分子(解調(diào)劑、拮抗劑、促效劑)或抗原識(shí)別域。人類和獸醫(yī)領(lǐng)域中，能通過本身已知的方法制備醫(yī)學(xué)治療和預(yù)防藥學(xué)上有效的藥物，其包含至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明修飾的異源二聚體泛素蛋白。依靠草本制劑的制備，這些組合物能通過注射或灌輸、全身給藥、直腸給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、皮下給藥、皮膚給藥或通過其他按照慣例上使用的應(yīng)用方法腸胃外給予。藥物的制備的類型依賴要治療的疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度、要治療的病人和其他藥學(xué)領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的因素。取決于挑選的融合伴侶，本發(fā)明的藥學(xué)的組合物適于指導(dǎo)疾病的治療，其中靶分子是豐富的。組合物適于包含治療學(xué)上的有效劑量。要執(zhí)行的劑量的質(zhì)量依賴要治療的有機(jī)體、疾病的類型、病人的年齡和體重和本身已知的進(jìn)一步的因素。組合物包含藥學(xué)上或診斷上可接收的載體且能可選地包含進(jìn)一步的輔助劑和本身已知的賦形劑。這些包括但不限于，例如，穩(wěn)定劑、表面活性劑、鹽、緩沖液、著色劑等等。藥物組合物能以液體制備、乳劑、用于局部滴旋的洗劑、氣霧劑形式，以粉末、顆粒、藥片、栓劑或者膠囊的形式，以乳劑或脂質(zhì)體(liposomal)制備的形式。組合物優(yōu)選的是無(wú)菌的、非高溫和等張的，且包含藥學(xué)上傳統(tǒng)的和可接收的本身已知的添加劑。此外，已做出參考美國(guó)藥典或Remington' s藥物科學(xué)(Mac Publishing Company (1990)) 的規(guī)則。依照本發(fā)明，“藥物組合物”可以組合物的形式出現(xiàn)，其中不同的有效成分和稀釋劑和/或載體是彼此混合的，或者采取組合制備的形式，其中有效成分以部分地或完全地不同的形式出現(xiàn)。這種組合或組合制備的實(shí)例是多部分的試劑盒(kit-of-parts)。依照本發(fā)明，“組合物”包括至少兩種制藥學(xué)上的活性化合物。這些化合物能利用一分鐘到幾天的時(shí)間間隔同時(shí)地或個(gè)別地給予?；衔锬芡ㄟ^相同的途徑或不同地途徑給予；例如，一種活性化合物的口服給予和另外的腸胃外給藥都是可能的?；钚曰衔镆部梢耘渲圃谝环N藥物中，例如，在一種輸注溶液中或作為包括分別配制的兩種化合物的試劑盒中配制。兩種化合物在兩個(gè)或更多包裝中出現(xiàn)，這也是可能的。進(jìn)一步的實(shí)施例中，制物組合物是以多部分的試劑盒的形式，為本發(fā)明的組合的泛素蛋白質(zhì)/融合蛋白質(zhì)和為一個(gè)或更多化學(xué)治療藥提供分離的實(shí)體。依照本發(fā)明，可通過很多傳統(tǒng)的和已知的技術(shù)中的任何一個(gè)，例如普通的有機(jī)合成策略，固相合成技術(shù)(solid phase-assisted synthesis techniques)或者通過商業(yè)上可用的自動(dòng)化的合成器制備修飾的泛素蛋白。另一方面，也可單獨(dú)通過傳統(tǒng)的重組技術(shù)或與傳統(tǒng)的合成技術(shù)組合來(lái)制備修飾的泛素蛋白?？蛇x地，可通過遺傳工程在DNA水平上進(jìn)行修飾，且在原核或真核生物體中或體外表達(dá)修飾的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述修飾步驟包括化學(xué)合成步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面，通過遺傳上融合兩個(gè)DNA庫(kù)獲得所述不同地修飾的蛋白質(zhì)的群，其中這兩個(gè)DNA庫(kù)各自編碼不同地修飾的單體泛素蛋白。


圖I顯示具有結(jié)合決定區(qū)域(稱為BDRl)的前面(第一)修飾的泛素單體與一個(gè)具有結(jié)合決定區(qū)域的不同修改的后面(第二)泛素單體(稱為BDR2)的結(jié)合(recombination,重組)，以便產(chǎn)生異源二聚體，導(dǎo)致對(duì)ED-B親和力的顯著增加和結(jié)合特異性的增加。通過Biacore 、熒光各向異性、細(xì)胞上的結(jié)合、和組織切片方法分析修飾的泛素分子。顯示幾種異源二聚體泛素變體與人類ED-B結(jié)合的濃度依賴ELISAs (con. -ELISA)。圖IA顯示結(jié)合親和力Kd = 9. 4 ii M = 9. 45 X IO^6M的單體41B10 (這里SPWF28-41B10th)o封閉的環(huán)顯示第一單體41B10與碎片67B89的結(jié)合，碎片67B89代表纖連蛋白的額外域-B。對(duì)照組碎片6789不包含ED-B且以空心環(huán)示出。圖IB顯示異源二聚體泛素的結(jié)合親和力。異源二聚體包含與不同的第二單體結(jié)合導(dǎo)致變體46H9的第一單體41B10 (這里SPWF28-46H9th)。與圖IA中示出的單體相比，由于兩種單體與祀分子ED-B的單價(jià)結(jié)合(Kd = 131nM = I. 3X 10_7M ;這里封閉環(huán)示出的67B89)，46H9的結(jié)合親和力是大量增加的。對(duì)照組碎片6789不包含ED-B且以空心環(huán)示出。圖2顯示融合到細(xì)胞因子上的以修飾的泛素為基礎(chǔ)的(或稱“修飾的基于泛素的”)結(jié)合ED-B的異源二聚體分子的親和力和活性。圖2A顯示以修飾的泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合ED-B的異源二聚體24H12的高親和力(Kd50. 7nM = 5X 1(T8M)。封閉環(huán)顯示24H12與EDB的結(jié)合；利用24H12與BSA (牛血清蛋白)的結(jié)合(空心環(huán))作為陰性對(duì)照。圖2B顯示融合到細(xì)胞因子TNF a上的以修飾的泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合ED-B的異源二聚體24H12的親和力提高，導(dǎo)致異源二聚體24H12的多聚化(Kd = 5. 6nM = 5. 6X10_9M)。圖2C顯示選自異源二聚體修飾的泛素庫(kù)選擇的典型的候選物的分析，例如異源二聚物變體9E12、22D1、24H12、和41B10。與用作對(duì)照組的胞液纖連蛋白(c_FN)相比，靶分 子ED-B的ELISA Kd值是增加的，證實(shí)對(duì)靶分子的特異性結(jié)合。圖2D顯示利用Biacore⑩通過非標(biāo)記相互作用技術(shù)(label-free interactionassays),修飾的異源二聚體泛素分子9E12的分析的結(jié)果。針對(duì)結(jié)合固定在芯片(Biacore)上的ED-B，分析(察看圖例9E12的0-15微M)異源二聚體泛素變體的不同濃度，以便分析異源二聚體變體9E12和ED-B之間的相互作用。不能通過分析聯(lián)合和分離的曲線來(lái)決定Kd0圖2E顯示利用Biacore⑩通過非標(biāo)記相互作用技術(shù)(label-free interactionassays)對(duì)修飾的異源二聚體泛素分子41B10進(jìn)行分析的結(jié)果。針對(duì)結(jié)合固定在芯片(Biocore)上的ED-B，分析異源二聚體泛素變體的不同濃度(參見圖例0-15 y M的41B10)，以便分析異源二聚體變體41B10和ED-B之間的相互作用。分析聯(lián)合和分離的曲線形成623nM (6. 2X I(T7M)的 Kd。
圖3顯示不同修飾的基于泛素的變體對(duì)結(jié)合親和力和特異性的貢獻(xiàn)。不同的變體共有共同的序列模塊，其用下面的框中字母標(biāo)出。針對(duì)變體的ED-B結(jié)合來(lái)分析變體。圖3顯示導(dǎo)致修飾的泛素異源二聚體的單體的不同組合。異源二聚體變體46-A5、50-Gll和46-H4具有所有相同的帶有BDRl (圖中用字母“a”標(biāo)注)的第一(前面)修飾的單體，但是第二 (后面)泛素單體在不同的位置修飾，具有BDR2。與具有BDRl的46-H9相比，變體52-D和52-B3具有不同的第一(前面)修飾的單體，但是具有相同的帶有BDR2 (用字母“e”標(biāo)注)第二 (后面)泛素單體。修飾的泛素異源二聚體具有下列序列46-H4:SEQ ID NO:25、45_H9:SEQ IDN0:26、46-A5:SEQ ID NO:27、50_G11:SEQ ID NO:28、52_B3:SEQ ID NO:29、52_D10:SEQ IDNO :30通過添加具有序列LEHHHHHH (SEQ ID NO: 31)的His-標(biāo)簽在實(shí)驗(yàn)期間修飾上述描述的序列。如能從圖3看出，46-H4對(duì)ED-B具有極好的結(jié)合親和力(Kd= 189nM);與46-H4對(duì)ED-B相比，46-A5和52-D沒有結(jié)合活性，而其他修飾的泛素蛋白提供較小的結(jié)合活性。因此能推論在異源二聚體變體中的兩種單體要求以高親和力結(jié)合靶分子；兩種單體均顯示對(duì)革巴分子的單價(jià)結(jié)合。正如與野生型泛素單體相比，通過下列兩種單體中的兩個(gè)結(jié)合域區(qū)域中的氨基酸置換，識(shí)別命名為46H9的具有高ED-B結(jié)合活性的修飾的泛素異源二聚物第一模塊中(BDRl)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64A、S65T、T66L第二模塊中(BDR2)(e)K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E50G11第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(c)K6M、L8R、Q62M、K63N、E64A、S65R、T66L46H4第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(d)K6G、L8W、Q62T、K63Q、E64Q、S65T、T66R52B3第一模塊中(g)Q2R、F4P、K6Y、Q62P、K63P、E64F、S65A、T66R第二模塊中(46H9)K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E52D10 (非-ED-B 結(jié)合物)
第一模塊中Q2V、F4C、K6R、Q62T、K63A、E64P、S65G、T66D第二模塊中(46H9)(e) K6H、L8M、Q62K、K63P、E64I、S65A、T66E46A5 (非-ED-B 結(jié)合物)第一模塊中(46H9)(a) Q2G、F4V、K6R、Q62P、K63H、E64P、S65T、T66L第二模塊中(b)K6L、L8M、Q62L、K63A、E64F、S65A,圖4顯示序列比對(duì)(alignment)。行I :野生型泛素蛋白的兩個(gè)單體(第一行)是從位置77起始并在位置88終止與12-氨基酸連接子SGGGGSGGGGIG連接在一起；具有BDR2的第二單體在位置89上以甲硫氨酸開始。這種二聚物野生型泛素蛋白與修飾的泛素異源 二聚物變體46-H9 (第二行)比對(duì)，變體46-H9在第二和第二單體中具有不同的修飾，產(chǎn)生兩個(gè)BDRs。由于對(duì)靶的單價(jià)結(jié)合，兩個(gè)BDRs在靶的結(jié)合中共同起作用。圖5顯示修飾的泛素異源二聚物變體1041-D11 (第一行)與“Ub2_TsX9”(在兩種單體與位置45對(duì)色氨酸修飾的泛素)的序列比對(duì)，顯示兩種單體之間連接子GIG (位置77到79 ;第二單體在位置88上以甲硫氨酸開始)，和在第二單體最后的C-末端氨基酸上甘氨酸到丙氨酸的交換。第三行顯示“Ubi-Dimer wt”，作為二聚物的野生型泛素；顯示沒有連接子對(duì)齊(從而，第二單體在位置77上以甲硫氨酸開始)。第四行顯示人類野生型泛素“Ubi-Monomer wt”。圖6顯示異源二聚物泛素變體1041-D11與人類ED-B的結(jié)合的濃度依賴的ELISA。變體1041-D11對(duì)結(jié)合ED-B顯示非常高的親和力(Kd = 6. 9nM = 6. 9X 1(T9M)。與這種變體對(duì)陰性對(duì)照的沒有結(jié)合相比(涉及6789-tO)(空心環(huán))，封閉的圓點(diǎn)顯示異源二聚物泛素變體1041-D11對(duì)包含纖連蛋白碎片(涉及67B89-tO)的ED-B的結(jié)合的親和力。圖7顯示在自由靶分子數(shù)量漸增的情況下，異源二聚體泛素變體1041-D11與包含纖連蛋白碎片(67B89)的固定的ED-B的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性濃度依賴的ELISAs。從具有IC50為140nM的可溶67B89的固定的67B89分離的1041-D11表明由于固定到用于conc_ELISA設(shè)備的疏水表面上，1041-D11的結(jié)合不是ED-B結(jié)構(gòu)破壞的人為現(xiàn)象(artefact)。圖8顯示利用Biacore⑩在非標(biāo)記相互作用技術(shù)中修飾的異源二聚體泛素分子1041-D11的分析結(jié)果。對(duì)于結(jié)合包含固定在SA-芯片(Biacore)上的纖連蛋白碎片(涉及67B89)的ED-B，分析(參見圖例0_200nM的1041-D11)不同濃度的異源二聚物泛素變體。分析結(jié)合和分離曲線，產(chǎn)生InM的Kd( I X I(T9M)和7. 7 X lO、—1的k0ff速率，這指示10411-D11和ED-B復(fù)合體的長(zhǎng)的半衰期。圖9顯示濃度依賴ELISA中異源二聚物泛素變體1041-D11對(duì)ED-B的結(jié)合，同時(shí)地分析結(jié)合活性的血清穩(wěn)定性。示出不同的條件，例如在鼠或鼠血清中或在作為對(duì)照的PBST中變體在37°C預(yù)孵育lh。所有的Kd值都在10和20nM之間。因此，能推論異源二聚物1041-D11對(duì)ED-B的結(jié)合沒有受到血清的顯著影響。圖10顯示通過SE-HPLC分析異源二聚體泛素變體1041-D11與纖連蛋白碎片的復(fù)合體(comp I ex)形成。圖IOA顯示1041-D11與ED-B的復(fù)合體形成。三種HPLC類型覆蓋具有21.651min的保留時(shí)間的藍(lán)色峰來(lái)源于純1041-D11 ;具有26. 289min的保留時(shí)間的黑色峰代表纖連蛋白碎片67B89 ;在SE-HPLC之后，1041-D11和67B89的混合物產(chǎn)生紅色峰具有27. 407min的保留時(shí)間。1041-D11峰到較低保留時(shí)間的移動(dòng)和67B89峰的消失指示1041-D11和可溶解的ED-B的復(fù)合體的形成。圖IOB顯示三種SE-HPLC類型的覆蓋圖，1041-D11 (藍(lán)色，21. 944min)、沒有ED-B的纖連蛋白碎片6789(黑色，26. 289min)以及1041-D11和6789的混合物(在21. 929min和26. 289min上具有峰的紅線)。觀察到1041-D11峰幾乎沒有移動(dòng)。這個(gè)事實(shí)與6789峰沒有消失一起指示不含ED-B的纖連蛋白碎片6789沒有明顯的結(jié)合。圖11顯示ED-B結(jié)合變體的保守位置(consensus positions)和氨基酸取代。16個(gè)代表性的異源二聚體序列示出，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對(duì)ED-B具有意外地強(qiáng)烈的結(jié)合親和力。保守氨基酸位置是在第一單體結(jié)合決定區(qū)域2、4、6、62、63、64、65、66中而保守氨基酸取代是Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和 T66S。圖12顯示六個(gè)基于泛素的異源二聚體MIA2結(jié)合蛋白質(zhì)的序列比對(duì)。第二泛素單體以在位置 89 (1111-B4、1111-C9)或位置 80 (1111-E10、1111-F6、1111-H12、1111-H2)的甲硫氨酸開始。
圖13顯示圖12的基于泛素的異源二聚體MIA2結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合決定區(qū)域BDRl和BDR2的比對(duì)(排序)和連接子的比對(duì)(排序)。也示出泛素序列中另外的氨基酸的交換。圖14顯示與生物素化的MIA-2 (biot. MIA2)結(jié)合的圖12的變體1111-E10的濃度依賴的ELISA, Kd = 2. 6microM (封閉的環(huán))；對(duì)照組人類血清蛋白(HSA)(空心環(huán))。圖15A.在第一和第二單體泛素單元的一系列分子中的氨基酸殘基中進(jìn)行修飾，且進(jìn)行序列排序以便評(píng)價(jià)最有效的結(jié)合位點(diǎn)/位置。部分A顯示第一單體修飾的泛素單元的序列信息和部分B顯示第二單體修飾的泛素單元的序列信息。圖15B.修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62_66、68中和第二單體中的位置6、8、62-66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖15C.顯示異源二聚物泛素變體SPWF-15-6-A12與人類腫瘤壞死因子(人類TNFa )的結(jié)合的濃度依賴的ELISA。結(jié)合蛋白質(zhì)SPWF_15_6_A12顯示以很高的親和力結(jié)合腫瘤壞死因子(Kd= 12nM= 1.2X10_8M)。圖顯示高親和力結(jié)合人類腫瘤壞死因子(封閉的環(huán))；對(duì)照組BSA (空心環(huán))。圖15D.對(duì)于腫瘤壞死因子具有特異性的異源二聚體泛素結(jié)合蛋白質(zhì)SPWF-15_16-D4_Th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62_66和第二單體中的位置6、8、62-66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖15E.顯示異源二聚體泛素變體SPWF-15_16_D4_Th與人類腫瘤壞死因子的結(jié)合的濃度依賴的ELISA。結(jié)合蛋白質(zhì)SPWF-15_16-D4_Th顯示以很高的親和力結(jié)合腫瘤壞死因子(Kd = I. 7nM = I. 7X10_9M)。圖顯示對(duì)人類腫瘤壞死因子的結(jié)合(封閉的環(huán))；對(duì)照組牛血清蛋白(BSA)(空心環(huán))。圖16顯示修飾的基于泛素的異源二聚物的NGF結(jié)合。圖16A.對(duì)NGF具有特異性的異源二聚物泛素結(jié)合蛋白SPWF9_lB7_th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62-66和在位置51以及在第二單體的位置6、8、62_66。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖16B.濃度依賴的ELISA確定/決定對(duì)NGF的高親和力的結(jié)合Kd為0. 9 y MC =9X 10_7M)。圖示出對(duì)重組人類NGF的結(jié)合(rhNGF ;封閉的環(huán))；對(duì)照組BSA (空心環(huán))。 圖16C.對(duì)NGF具有特異性的異源二聚體泛素結(jié)合蛋白SPWF9_6A2_th的序列。修飾是在第一泛素單體的位置2、4、6、62-66中和在第二單體的位置6、8、62、64_66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖16D.濃度依賴的ELISA確定對(duì)NGF的高親和力的結(jié)合Kd為180nM (=
I.8X 10_7M)。圖示出對(duì)重組人類NGF的結(jié)合(rhNGF ;封閉的環(huán))；對(duì)照組BSA (空心環(huán))。圖17異源二聚體IgG結(jié)合蛋白質(zhì)。圖17A.對(duì)IgG具有特異性的異源二聚物泛素結(jié)合蛋白SPVF4-16B2_ts的序列。修飾是在第一泛素單體的位置6、62、63、65、66中和在第二單體的位置6、62_66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖17B.濃度依賴的ELISA確定對(duì)IgG的Kd為3.8 ii M的親和力的結(jié)合。圖示出對(duì)IgG的結(jié)合(封閉的黑色環(huán));對(duì)照組為BSA-l、BSA-2和依那西普(Enbrel)(沒有擬合線的紅色、綠色和藍(lán)色環(huán))。依那西普(Enbrel)具有人類IgGl的Fe片段。對(duì)依那西普(Enbrel) 的微弱的結(jié)合指示SPVF4-16B2-ts與IgG的Fab片段的結(jié)合。圖17C.對(duì)IgG具有特異性的異源二聚物泛素結(jié)合蛋白SPVF4-9C6_ts的序列。修飾是在第一泛素單體的位置6、8、62-66中和在第二單體的位置6、8、62-66中。兩種泛素單體之間的連接子SGGGGSGGGGIG。圖17D.濃度依賴的ELISA確定對(duì)IgG的Kd為4. I y M的親和力的結(jié)合。圖示出對(duì)IgG的結(jié)合(封閉的黑色環(huán));對(duì)照組BSA (空心環(huán))和依那西普(Etanerapt)(商品名為Enbrel)(紅色環(huán),沒有擬合線)。依那西普(Enbrel)具有人類IgGl的Fe片段(moiety)。對(duì)依那西普(Enbrel)的微弱的結(jié)合指示SPVF4_9C6_ts與IgG的Fab片段的結(jié)合。實(shí)施例下列實(shí)例提供本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明關(guān)于泛素的修飾作為實(shí)施例部分地論證。然而，本發(fā)明不受實(shí)施例限制，且下列實(shí)施例僅以上述描述為基礎(chǔ)顯示本發(fā)明的實(shí)用性。用于本發(fā)明全部的公開，參考了在申請(qǐng)中和附件中引證的文獻(xiàn)，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在本申請(qǐng)中以供參考。實(shí)施例I.以修飾的泛素蛋白為基礎(chǔ)的異源二聚體ED-B結(jié)合蛋白的識(shí)別庫(kù)的構(gòu)建和克隆除非有另外的說(shuō)明，都使用如Sambrook等人描述的已知的重組遺傳方法。通過在總數(shù)15個(gè)挑選的氨基酸位置的協(xié)同的變異發(fā)生，制備具有高度復(fù)雜性的人類泛素異源二聚物的隨機(jī)庫(kù)。修飾的氨基酸，其是通過NNK三聯(lián)密碼(triplet)被取代的，包括選自第一泛素單體內(nèi)位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3個(gè)氨基酸和選自第二泛素單體內(nèi)的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68上的至少3個(gè)氨基酸。兩個(gè)泛素單體都是通過至少具有序列GIG的甘氨酸/絲氨酸連接子或通過至少具有序列為SGGGG的甘氨酸 / 絲氨酸連接子，例如，GIG、SGGGG, SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG (SEQ ID NO :32)或SGGGGSGGGG而遺傳上連接的(首到尾)，但是也可能是任何其他連接子。TAT噬菌體展示選擇利用例如作為選擇系統(tǒng)的TAT噬菌體展示，針對(duì)靶分子富集異源二聚體泛素庫(kù)。能利用本領(lǐng)域已知的其他選擇方法。靶分子能非特異性地固定在蛋白質(zhì)結(jié)合表面，或通過共價(jià)地連接到蛋白質(zhì)上的生物素化殘基。優(yōu)選的是通過生物素固定到鏈霉親和素磁珠(streptavidin beads)或親和素帶(neutravidin strips)上。在溶液中或在固定的革巴上選擇靶分子結(jié)合噬菌體；例如，對(duì)生物素化和固定的具有噬菌體的靶進(jìn)行孵育，接著對(duì)結(jié)合到基體上的噬菌體洗滌并洗脫基質(zhì)束縛的噬菌體。在每一個(gè)循環(huán)中在靶分子孵育之后，從溶液中磁性分離珠子且洗滌幾次。在第一到三個(gè)的選擇循環(huán)中，洗滌固定在靶分子負(fù)載的磁性珠上的三重復(fù)合體。第四次的選擇循環(huán)中，洗滌實(shí)行幾次。第一次的選擇循環(huán)中，生物素化的靶分子固定到親和素帶上，然而在第二到四個(gè)循環(huán)中，在溶液中進(jìn)行選擇，緊跟其后的是將祀分子卩遼菌體復(fù)合體固定到Streptavidin-coated Dynabeads⑩(Invitrogen)上。在洗滌之后，在前兩個(gè)選擇循環(huán)中，珠子再一次從溶液中磁性分離，且利用酸性溶液通過洗脫釋放靶分子結(jié)合的修飾的泛素分子的噬菌體。在第三和第四選擇循環(huán)中，利用過量的靶分子通過競(jìng)爭(zhēng)性洗脫執(zhí)行噬菌體的洗脫。重新擴(kuò)增洗脫的噬菌體。為了指導(dǎo)結(jié)合體的特異性，在選擇期間，能包括相似于靶分子的蛋白質(zhì)。對(duì)于TAT噬菌體展示選擇的可替換方式核糖體展示選擇利用例如，作為選擇系統(tǒng)的核糖體展示(Zahnd et al. , 2007, Ohashi etal.，2007)針對(duì)靶分子富集泛素庫(kù)。也能利用其他本領(lǐng)域已知的選擇方法。依照標(biāo)準(zhǔn)的方法生物素化祀分子且固定在Streptavidin-coated Dynabeads(J)(Invitrogen)上。利用 PURExpress在體外蛋白質(zhì)合成裝置中(NEB)組裝包括核糖體、mRNA和初始形成的泛素多肽的三重復(fù)合體。實(shí)行兩個(gè)初級(jí)的選擇循環(huán)(rounds)，其中孵育三重復(fù)合體，接著的是兩個(gè)相似的選擇循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中在靶分子孵育后，從溶液中磁性分離珠子，并以增加的嚴(yán)格性利用核糖體展示緩沖液洗滌。在第一到三個(gè)選擇循環(huán)中，洗滌固定在靶分子負(fù)載的磁性珠上的三重復(fù)合體。在第四個(gè)選擇循環(huán)中，再一次從溶液中磁性地分離珠子，且通過加入50mM的EDTA從核糖體上釋放祀分子結(jié)合修飾的泛素分子的mRNA。在第三和四個(gè)選擇循環(huán)中，利用過量的祀分子通過競(jìng)爭(zhēng)性洗脫執(zhí)行mRNA的洗脫(Lipovsek and Pluckthun, 2004)。在每一個(gè)循環(huán)之后，利用RNeasy MinElute Cleanup Kit (RNA回收和濃縮小體積洗脫試劑盒XQiagen, Germany)、Turbo DNA-free Kit(核酸抽提試劑盒)(Applied Biosystems, USA)和 Transcriptor Reverse Transcriptase (反轉(zhuǎn)錄 cDNA 合成試劑盒)(Roche, Germany)實(shí)行RNA純化和cDNA合成。富集庫(kù)的克隆在第四個(gè)選擇循環(huán)之后，依照本領(lǐng)域中已知的方法，通過PCR擴(kuò)增合成的cDNA，使用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂崦盖懈钋彝ㄟ^兼容的粘性末端連接到表達(dá)載體pET-20b (+)上(Merck, Germany)。單克隆Hit分析在轉(zhuǎn)入NovaBlue (DE3)細(xì)胞(Merck, Germany)之后,青霉素抗性的單克隆生長(zhǎng),通過在96孔深孔板中(Genetix，UK)利用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Studier，2005)培養(yǎng)獲得靶分子結(jié)合修飾的泛素的表達(dá)。收集細(xì)胞并隨后裂解細(xì)胞。在離心之后，通過涂上靶分子的ELISA篩選合成的上清液，且泛素特異性的Fab片段結(jié)合到辣根過氧化物酶上(P0D)。因?yàn)槭褂脵z測(cè)試劑 TMB_Plus(Biotrend，Germany),利用 0. 2MH2S04 溶液顯不黃色，且在 450nm 與 620nm 的下檢測(cè)板中的讀數(shù)。執(zhí)行對(duì)靶分子的幾個(gè)選擇展示循環(huán)。最后兩個(gè)選擇的循環(huán)中，使用過量的自由靶分子洗脫結(jié)合分子。例如，識(shí)別對(duì)靶ED-B的異源二聚體修飾的泛素結(jié)合蛋白，例如46H9 (SEQID N0:6)，9E12(SEQ ID NO:7)，22D1(SEQ ID N0:8), 1041-Dll 圖 5(SEQ ID NO:33),1045-D10(SEQ ID NO:34)。例如，識(shí)別對(duì)其他靶的異源二聚體修飾的泛素結(jié)合蛋白，例如圖12的對(duì)靶MIA-2的結(jié)合蛋白Illl-ElO (SEQ ID NO: 53)，圖15B的對(duì)靶TNF a的結(jié)合蛋白SPWF-156-A12 (SEQ ID NO:57)和圖 15D 的 SPWF-1516-D4 (SEQ ID N0:90)，圖 16A 的對(duì)靶NGF 的結(jié)合蛋白 SPWF9-lB7-th (SEQ ID NO:91)和圖 16C 的 SPWF9_6A2_th (SEQ ID NO:92)和圖 17A 的對(duì)靶 IgG 的結(jié)合蛋白 SPVF4-16B2-ts(SEQ ID NO:93)和圖 17C 的 SPVF4_9C6_ts(SEQ ID N0:94)。圖5中示出野生型泛素單體(Ubi單體wt)，與野生型泛素二聚體(ubi 二聚體wt)和具有修飾的泛素異源二聚體變種1041-D11的野生型泛素蛋白(圖5中的Ub2-TsX9，每一個(gè)單體的位置45中具有交換和在C-末端上具有兩處取代)。Ub2-TsX中在單體的C-末端(GG到AA)上的取代增加血清的穩(wěn)定性，因?yàn)槿シ核鼗?deubiquitinases)分解是在泛素的GG之后，而不是在AA之后。野生型泛素的二級(jí)結(jié)構(gòu)與在C-末端具有的這些取代的泛素相比，幾乎是相同的。通過與野生型相比的下列氨基酸置換來(lái)識(shí)別具有較高的ED-B結(jié)合活性的修 飾的泛素被稱作1041-D11 (圖X中顯示；SEQ ID N0:36)或1045-D10 :第一模塊中K6W, L8W, K63R, E64K, S65F, T66P ;第二模塊中K6T, L8Q, Q62W, K63S, E64N, S65W, T66E ；可選地Q2R (變體1041-D11中，但不在變體1045-D10中)。融合蛋白適當(dāng)優(yōu)選的連接子是具有至少序列為GIG或具有至少序列為SGGGG的連接子，或任何其他連接子，例如GIG, SGGGG, SGGGGIG, SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。然而，有很多能用于代替的可能的連接子。圖11中顯示在第一單體結(jié)合決定區(qū)域中另外的具有他們的保守序列的EDB結(jié)合體。圖12-14示出具有較高的MIA-2結(jié)合活性的修飾的泛素。圖16示出具有較高的NGF結(jié)合活性的修飾的泛。圖15示出具有較高的TNF-a結(jié)合活性的修飾的泛素。在圖17示出具有較高的IgG結(jié)合活性的修飾的泛素。實(shí)施例2 :將變體結(jié)合到人類靶分子上的基于修飾的泛素的ED-B的結(jié)合分析實(shí)施例2A.通過濃度依賴的ELISA方法進(jìn)行基于修飾的泛素的結(jié)合變體的結(jié)合分析通過濃度依賴的ELISA檢驗(yàn)以泛素為基礎(chǔ)的變體和人類靶分子的結(jié)合。如果ED-B被用作靶分子，則漸增數(shù)量的純化蛋白適用于涂上人類靶分子，BSA或HAS和可能的進(jìn)一步的對(duì)照，例如細(xì)胞纖連蛋白(cFN)(如果ED-B用作靶分子)的腔室玻片板(NUNC-medisorpplate)。每孔抗原涂上50iil蛋白質(zhì)溶液(lOii g/ml)，4°C過夜。在用PBS，0. 1%吐溫20pH7. 4 (PBST)洗滌板之后，孔利用封閉液(PBS pH7. 4 ；3% BSA ;0. 5%吐溫20)在室溫RT下封閉2h?？自俅斡肞BST洗滌三次，然后用PBS洗滌三次。用不用濃度的靶結(jié)合蛋白在RT下孵育涂覆的孔lh。在PBST洗滌孔之后，將anti-Ubi fab片段(AbyD) POD的結(jié)合物加到PBST的適當(dāng)?shù)南♂屢褐?。板用PBST洗滌三次。每一個(gè)孔中加入50U1TMB基礎(chǔ)溶液(KEM-EN-Tec)且孵育15min。通過加入0. 2M H2SO4終止反應(yīng)。利用TECAN SunriseELISA-Reader讀出ELISA板。在450nm下利用620nm作為參考波長(zhǎng)完成吸光度測(cè)量。圖6顯示變體1041-D11與ED-B的結(jié)合的很高的親和力(Kd = 6. 9nM)。關(guān)于其他靶分子MIA-2、TNFa、NGF和IgG，分別由圖14、15、16和17中描述的結(jié)果證實(shí)(高的親和力)。因此，泛素野生型中只有很少的修飾(每一個(gè)單體中高達(dá)8個(gè)取代)，結(jié)果對(duì)特定的靶分子的親和力在很低的微摩爾范圍。實(shí)施例2B.通過競(jìng)爭(zhēng)性的濃度依賴的ELISA方法進(jìn)行基于修飾的泛素的結(jié)合變體的結(jié)合分析這里描述的是對(duì)于靶分子ED-B的結(jié)合分析，但是沒有進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，它能用于任何其他的靶分子。在有增加數(shù)量的自由靶分子的情況下，利用競(jìng)爭(zhēng)性濃度依賴的ELISAs分析泛素變體1041-D11與包含纖連蛋白片段(67B89 )的固定的ED-B的結(jié)合。ELISA的條件如實(shí)施例2A中描述的，除了 1041-D11蛋白質(zhì)是與ED-B (67B89) (0 y M_10 y M)或者也與陰性對(duì)照6789 (Ou M-IO u M)預(yù)孵育lh，且隨后混合物提供給放置在酶標(biāo)板上的靶分子67B89 ；之后，通過相應(yīng)的抗體(anti-Ubiquitin-Fab-POD ；1 6500稀釋)檢測(cè)變體。圖7顯示變體1041-D11具有很高的親和力結(jié)合ED_B (IC50=140nM)。證實(shí)了圖6中顯示的結(jié)果；泛素野生型中只有少數(shù)的修飾(每一個(gè)單體中高達(dá)8個(gè)取代)，產(chǎn)生更高親和力結(jié)合ED-B。 實(shí)施例2C.通過濃度依賴ELISA方法進(jìn)行基于修飾的泛素的ED-B結(jié)合變體的結(jié)合分析，同時(shí)分析結(jié)合活性的血清穩(wěn)定性。利用本領(lǐng)域已知的且如上述描述的程序?qū)嵭蠩LISA (實(shí)施例2A和2B)。將ED-B(這里被稱作67B89)涂在微量滴定板上，變體結(jié)合到ED-B上且通過特定的泛素抗體檢測(cè)(Anti-Ubi-Fab-POD)。這種實(shí)驗(yàn)中以不同的方式處理變體；變體在鼠血清中在37°C孵育Ih(察看圖9，藍(lán)色環(huán))；變體在褐家鼠血清中在37°C孵育Ih (察看圖13X，紅色環(huán))；或者變體在PBS中在37°C孵育Ih (察看圖9、10，黑色環(huán))。圖13顯示所有變體1041-D11的Kd在10. 3uM (PBS中)到20. 74 ii M (鼠血清中)之間。實(shí)施例2D.通過Biacore實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基于修飾的泛素的ED-B結(jié)合變體的結(jié)合分析利用本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的方法，分析變體的不同濃度(例如，0-20 ii M的變體，優(yōu)選地1041-D11)對(duì)結(jié)合ED-B的影響，ED-B包含固定在CM5-芯片(Biacore)上的纖連蛋白片段(被稱作67B89)。通過模型分析軟件(BIA evaluation software)和I :I-Langmuir-裝置處理獲得的數(shù)據(jù)。如圖8中示出的，變體1041-D11的Kd是I. 0 y M。動(dòng)力學(xué)結(jié)合常數(shù)是 km=7. 6 X IO5M-1S-1 ^ff=TJXlO-4S' 融合蛋白 1041-D11-TNF a 的 Kd 是I. 13 u M0 動(dòng)力學(xué)結(jié)合常數(shù) kon=4. 5 X IO5M-1S-1 ;kQff=5. OX KT4S'實(shí)施例2E.通過SE-HPLC進(jìn)行基于修飾的泛素的ED-B結(jié)合變體的復(fù)合體形成的分析對(duì)于復(fù)合體形成的分析，利用Tricorn Superdex 755/150GL 柱(GE-Healthcare)(V=3ml)且應(yīng)用50iU量的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的條件緩沖液1XPBS，pH7.3，流量0.3ml/min,運(yùn)行45min(樣品的加入15min 之后)。條件0. 72nmol 1041-D11 蛋白質(zhì) + 0. 72nmolED-B (這里涉及67B89)或者作為陰性對(duì)照的纖連蛋白(此處被稱為6789)在RT下孵育Ih ；然后應(yīng)用于柱用于復(fù)合體形成的分析。圖14中，只有變體用黑色示出，只有靶分子ED-B用藍(lán)色示出，用粉紅示出變體與ED-B結(jié)合組成的復(fù)合體。圖IOA示出包含ED-B的纖連蛋白(67B89)與變體；圖IOB是不具有ED-B的纖連蛋白的變體(6789)。圖顯示變體1041-D11與ED-B (67B89) 一起組成復(fù)合體，但是與纖連蛋白(6789)沒有組成復(fù)合體，這證實(shí)了它的特異性。
實(shí)施例3 :對(duì)TNF-a具有改善的結(jié)合的基于泛素的異源二聚體的結(jié)合蛋白依照本發(fā)明的方法，選出對(duì)TNF-a特異性的基于泛素的異源二聚體的結(jié)合蛋白，即建立噬菌體庫(kù)，其包括修飾的異源二聚體的泛素的結(jié)合蛋白的群，在它們與TNF-a潛在的結(jié)合蛋白上篩選群。實(shí)行下列的修飾第一單體中在位置2、4、6、62_66上的一個(gè)或更多的氨基酸中，可選地另外在位置68、70、72-74的一個(gè)或更多的位置上，可選地另外的位置上。第二單體中位置6、8、62_66上的一個(gè)或更多的氨基酸的修飾。作為連接子，除了對(duì)于1144-Dll (SEQ ID NO:79))和 1144-E9 (SEQ ID N0:80)之外，SGGGGSGGGGIG用于大多數(shù)情形中。在第一和第二泛素單體之間1144-D11和1144-E9沒有利用連接子。位置75和76是AA或GG。圖15的A部分中示出連接子。圖15B-E中示出結(jié)合親和力。
實(shí)施例4 :具有改善的結(jié)合MIA-2的基于泛素的異源二聚體的結(jié)合蛋白的產(chǎn)生MIA-2是在例如肝的硬化、纖維化和癌變的情形中診斷和治療的標(biāo)記。能在US2004076965中發(fā)現(xiàn)這種標(biāo)記的詳細(xì)信息。本發(fā)明的修飾的泛素的結(jié)合蛋白質(zhì)的靶蛋白是MIA-2的穩(wěn)定的101個(gè)氨基酸核心區(qū)域，此處被稱作SPR30-3。SPR30-3是MIA-2的結(jié)構(gòu)部分。除了信號(hào)肽之外，它類似于MIA(CD-RAP)，0T0R、TANGO0 它的分子量是 11569，198Da。MIA-2的氨基酸的核心區(qū)域如下(SEQ ID N0:95)MLESTKLLADLKKC⑶LECEALINRVSAMRDYRGPDCRYLNFTKGEEISVYVKLAGEREDLWAGSKGKEFGYFPRDAVQIEEVFISEEIQMSTKESDFLCL依照本發(fā)明的方法，選出對(duì)于MIA-2特異性的基于泛素的異源二聚體的結(jié)合蛋白，即建立噬菌體庫(kù)，其包括修飾的異源二聚體泛素的結(jié)合蛋白質(zhì)的群，在它們與MIA-2潛在的結(jié)合上篩選群。結(jié)果如下圖13顯示基于泛素的異源二聚體的MIA-2結(jié)合蛋白質(zhì)的比對(duì)變體1111-E10顯示對(duì)生物素化的靶分子的在微摩爾范圍中的親和力和在尺寸篩析色譜法中顯示復(fù)合體的形成。最有效(potent)的結(jié)合體指定是在第一單體泛素單元(BDRl)中位置6、8、62、63、64、65、66處具有氨基酸取代的1111-E10和在第二單體泛素單元(BDR2)的位置6、8、62、63、64、65、66處的不同的取代。第一單體泛素單元(BDRl)顯示與1111-H2和1111-H12相同的取代。因此，變體1111-H2和1111-H12能被看作BDRl和BDR2的結(jié)合，只通過一個(gè)取代的氨基酸區(qū)別BDRl和BDR2。已經(jīng)評(píng)價(jià)下列進(jìn)一步有效的結(jié)合分子1111-C9，1111-B4和1111-F6。在ELISA中和SEC上，這些結(jié)合體是不可溶解的或?qū)IA-2的SPR30-3不顯示任何結(jié)合。分別地富集變體1111-E10和1111-C9和1111-B4 (1111-B4中出現(xiàn)幾次額外的取代T9A)。1111-F6沒有富集，但是由于在Hit-ELISA中它的高信號(hào)，它似乎是令人感興趣的候選物；然而，這個(gè)結(jié)合體好像是不可溶解的。圖14顯示結(jié)合生物素化的MIA-2 (biot. MIA2)的變體1111-E10的濃度依賴的ELISA，Kd = 2. 6微摩爾(封閉的環(huán))；對(duì)照組HAS (空心環(huán))。已經(jīng)證明這些變體111 1-E10作為 MIA2 最好的結(jié)合分子。序列如下MQIFVETFTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIGWHPELHLVLRLRGGGIGMQIFVRTETGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIffAGKQLEDGRTLSDYNILMGYVLHLVLRLRAA(SEQ ID NO:53)附在所附的序列表中的使用的連接子如下1111_B4_21231 sggggsggggig SEQ ID NO:961111_C9_21265 sggggsggggig SEQ ID NO:961111-E10_21315 gig1111-F6_21331 gig1111-H12_21391 eig 1111_H2_21371 gig出版物I. Birchler, M.，F(xiàn). Vitij L. Zardi, B. Spiess，and D. Neri. 1999. Selectivetargeting and photocoagulation of ocular angiogenesis mediated by aphage-derived human antibody fragment. Nat Biotechnol 17:984-8.2. Brenmoehl，J.，M. Lang, M. Hausmann，S. N. Leebj W. Falk, J. Scholmerich，M.Gokej and G. Rogler. 2007. Evidence for a differential expression of fibronectinsplice forms ED-A and ED-Bin Crohn f s disease(CD)mucosa. Int J ColorectalDis22:611-23.3. Dubin，D.，J. H. Peters, L. F. Brown, B. Logan, K. C. Kent, B. Berse, S. Berven, B.Cercek，B. G. Sharifi, R. E. Pratt, and et al. 1995. Balloon catheterization inducedarterial expression of embryonic fibronectins. Arterioscler Thromb VaseBioll515:1958-67.4.Goodsell, D. S. 2001. FUNDAMENTALS OF CANCER MEDICINE:The MolecularPerspective:Antibodies. The Oncologist 6:547-548.5. Kaczmarek, J.，P. Castel Iani, G. Nicolo，B. Spina, G. Al lemanni, andL. Zardi. 1994. Distribution of oncofetal f ibronect in isoforms innormal, hyperplastic andneoplastic human breast tissues.Int J Cancer 59:11-6.6. Menrad，A.，and H. D. Menssen. 2005. ED-B f ibronectin as a target forantibody-based cancer treatments. Expert Opin Ther Targets 9:491-500.7. Pujuguet, P.，A. Hammann, M. Moutet, J. L. Samuel，F(xiàn). Martin，andM.Martin. 1996. Expression of fibronectin ED—A+and ED—B+isoforms by humanand experimental colorectal cancer. Contribution of cancer cells andtumor-associated myofibroblasts. Am J Pathol 148:579-92.8. Trachsel, E.，M. Kaspar, F. Bootz, M. Detmar, and D. Neri. 2007. A human mAbspecific to oncofetal fibronectin selectively targets chronic skin inflammationin vivo. J Invest Dermatoll27:881-6.9. Van Vliet, A.，H. J. Baelde，L. J. Vleming, E. de Heerj and J. A. Brui jn. 2001.Distribution of bronectin isoforms in human renal disease. J Pathol 193:256-62.10. Lipovsek，D.，and PluckthunjA. (2004). In-vitro protein evolution byribosome display and mRNA display. J. Immunol. Methods 290，51—67.
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權(quán)利要求
1.一種用于識(shí)別具有結(jié)合配體能力的異源多聚體修飾的泛素的方法，包括下列步驟 a)提供來(lái)源于單體修飾的泛素蛋白質(zhì)的異源多聚體修飾的泛素的群，所述群包括異源多聚體蛋白質(zhì)，所述異源多聚體蛋白質(zhì)包括兩個(gè)或更多以首尾排列的方式連接在一起的泛素單體，其中所述異源多聚體蛋白質(zhì)的至少一個(gè)所述單體是至少通過定位在SEQ ID NO: I的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個(gè)氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而不同地修飾的，所述修飾的單體蛋白質(zhì)與未修飾的泛素蛋白質(zhì)具有至少80%或至少90%或至少95%的氨基酸序列同一性； b)為所述不同地修飾的泛素蛋白質(zhì)的群提供潛在的配體； c)使所述不同地修飾的蛋白質(zhì)的群與所述配體接觸； d)通過篩選方法識(shí)別異源多聚體修飾的蛋白質(zhì)，其中所述修飾的異源多聚體蛋白質(zhì)以Kd范圍是10_7-10_12M的特定的結(jié)合親和力結(jié)合于所述配體并且對(duì)于所述配體表現(xiàn)單價(jià)的結(jié)合活性；和可選地 e)利用所述結(jié)合親和力分離所述異源多聚體修飾的泛素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述異源多聚體蛋白質(zhì)是異源二聚體或異源三聚體蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述修飾的單體蛋白質(zhì)包括總共I至10個(gè)氨基酸中一個(gè)或更多的插入和/或總共I至7個(gè)氨基酸中一個(gè)或更多的缺失，進(jìn)一步可選地其中所述修飾的單體泛素蛋白包括至少6個(gè)和最多14個(gè)氨基酸的取代，并且其中所述修飾的異源二聚體的泛素蛋白包括總共至少12個(gè)和最多28個(gè)取代，和/或包括總共至少I個(gè)和最多20個(gè)插入和/或至少I個(gè)和最多14個(gè)缺失。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾的單體泛素蛋白是通過編碼泛素的DNA的遺傳工程，并且在原核或真核生物體內(nèi)或體外表達(dá)所述蛋白而獲得的。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過體外選擇方法提供所述多聚體蛋白質(zhì)，所述體外選擇方法優(yōu)選地是展示方法，可選地為噬菌體展示、核糖體展示、TAT噬菌體展示、酵母菌展示、細(xì)菌展示、細(xì)胞表面展示或mRNA展示方法。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述配體是抗原或半抗原。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中進(jìn)一步地在至少一個(gè)所述單體泛素蛋白中的I至7個(gè)另外的氨基酸被取代，其可選地選自在位置36、44、70、71的一個(gè)或更多的氨基酸，和可選地附加地SEQ ID NO: I的位置62、63和64或72和73或8的氨基酸。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述泛素的異源多聚體融合蛋白的群通過以下方式提供遺傳上融合兩個(gè)DNA庫(kù)，所述DNA庫(kù)每一個(gè)編碼不同地修飾的單體蛋白質(zhì)，將所述DNA翻譯成異源多聚體融合蛋白質(zhì)，展示所述蛋白質(zhì)并在修飾的異源多聚體泛素蛋白存在下篩選展示的蛋白質(zhì)，所述修飾的異源多聚體泛素蛋白包括以首尾排列連接在一起的單體泛素蛋白，其中所述修飾的異源多聚體泛素蛋白以Kd范圍是KT7-IO-12M的特定的結(jié)合親和力結(jié)合所述配體并且對(duì)于所述配體表現(xiàn)出單價(jià)的結(jié)合活性，或者其中通過蛋白質(zhì)的化學(xué)合成提供所述泛素的異源多聚體的融合蛋白質(zhì)的群。
9.一種DNA庫(kù)，包含編碼來(lái)源于單體泛素的異源多聚體泛素融合蛋白的群的DNA，每一個(gè)多聚體蛋白質(zhì)包括兩個(gè)或更多以首尾排列的方式連接在一起的修飾的泛素單體，其中每個(gè)所述多聚體蛋白質(zhì)的所述單體的至少兩個(gè)被不同地修飾，這種修飾至少通過在位于SEQID勵(lì):1的位置2、4、、6、8、62、63、64、65、66和68處的至少三個(gè)氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而實(shí)現(xiàn)，所述修飾的單體蛋白質(zhì)與未修飾的蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列同一性為至少80 %或至少90 %或至少95 %。
10.一種通過權(quán)利要求9所述的DNA庫(kù)的表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)庫(kù)。
11.一種包含根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的DNA或蛋白質(zhì)庫(kù)的原核的或真核的細(xì)胞或噬菌體的群。
12.—種多聚核苷酸，編碼權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)庫(kù)的融合蛋白質(zhì)。
13.—種載體,包括根據(jù)權(quán)利要求12的多聚核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于識(shí)別具有結(jié)合配體能力的異源多聚體泛素的方法。此外，本發(fā)明提供編碼所述異源多聚體泛素群的DNA庫(kù)和由所述DNA庫(kù)的表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)庫(kù)、包含所述DNA或蛋白質(zhì)的細(xì)胞和噬菌體、編碼所述融合蛋白(fusion proteins)的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的載體。進(jìn)一步提供能夠以高親和力特異性地結(jié)合到所選擇的配體上的基于異源多聚體泛素的新的結(jié)合蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102753568SQ201080056911
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者埃里克·菲德萊爾, 安雅·庫(kù)納特, 托馬斯·戈特勒, 約爾格·納坎普, 阿諾德·施托伊爾納格爾, 馬庫(kù)斯·菲德萊爾 申請(qǐng)人:塞爾蛋白質(zhì)股份有限公司