本發(fā)明涉及腫瘤的細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用，具體為以腫瘤特異靶點(diǎn)cd20為基礎(chǔ)的嵌合抗原受體t(car-t)細(xì)胞技術(shù)的構(gòu)建方法及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著腫瘤免疫學(xué)理論和臨床技術(shù)的發(fā)展，嵌合抗原受體t細(xì)胞療法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成為目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療法之一。一般，嵌合抗原受體car由一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)域以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。通常，car包含抗體的單鏈片段可變(singlechainfragmentvariable，scfv)區(qū)或?qū)δ[瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen,taa)具有特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其通過(guò)鉸鏈和跨膜區(qū)與t細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)。最常見(jiàn)的淋巴細(xì)胞活化部分包括與t細(xì)胞效應(yīng)物功能觸發(fā)(例如cd3ζ)部分串聯(lián)的t細(xì)胞共刺激結(jié)構(gòu)域。car介導(dǎo)的過(guò)繼性免疫療法允許car-移植的t細(xì)胞以非hla限制性方式直接識(shí)別靶腫瘤細(xì)胞上的taa。

大多數(shù)患有b細(xì)胞惡性腫瘤(包括b細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(bcellacutelymphocyticleukemia,leukemia,b-all)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll))的患者將由于其疾病而死亡。治療這些患者的一種方法是通過(guò)car的表達(dá)，對(duì)t細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以靶向在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原。car是經(jīng)設(shè)計(jì)以人白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen,hla)非依賴(lài)性方式識(shí)別細(xì)胞表面抗原的抗原受體。嘗試使用表達(dá)car的遺傳修飾細(xì)胞來(lái)治療這些類(lèi)型的患者已經(jīng)取得了有前景的成功。

cd19分子是治療b淋巴細(xì)胞系腫瘤潛在的靶點(diǎn)，也是car研究中的熱點(diǎn)，cd19的表達(dá)局限于正常和惡性b細(xì)胞，是廣泛接受的用來(lái)安全測(cè)試的car靶標(biāo)。靶向cd19分子的嵌合抗原受體基因修飾的t細(xì)胞(cd19car-t)在治療多發(fā)性、難治性的急性b淋巴細(xì)胞白血病上取得巨大成功，而在難治性、復(fù)發(fā)性慢性b淋巴細(xì)胞白血病和b淋巴細(xì)胞系淋巴瘤的治療中療效明顯較差。

cn104788573a公開(kāi)了一種嵌合抗原受體hcd19scfv-cd8α-cd28-cd3ζ及其用途，該嵌合抗原受體由抗人cd19單克隆抗體hi19a輕鏈和重鏈可變區(qū)(hcd19scfv)、人cd8α鉸鏈區(qū)、人cd28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、以及人cd3ζ胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成，該專(zhuān)利中的cd19在進(jìn)行一次car-t細(xì)胞回輸后，cd19的表達(dá)量會(huì)降低，容易逃過(guò)免疫機(jī)制。

因此，制備一種嵌合抗原受體能夠解決cd19存在的易突變和表達(dá)量降低的問(wèn)題顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前car-t技術(shù)治療腫瘤中靶向不十分理想，以及腫瘤微環(huán)境影響car-t技術(shù)治療效果的情況，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用，本發(fā)明制備的嵌合抗原受體通過(guò)將cd20靶點(diǎn)進(jìn)行基因改造，從而提高了靶點(diǎn)的免疫效果，增強(qiáng)了car-t細(xì)胞的治療效果。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成；

其中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤表面抗原，所述腫瘤表面抗原為cd20。

本發(fā)明中，通過(guò)將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤表面抗原cd20，再通過(guò)對(duì)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域即針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體進(jìn)行特定的人源基因碼優(yōu)化改造，從而使得腫瘤表面抗原cd20能夠特異的結(jié)合在本申請(qǐng)的嵌合抗原受體上，且相比于其他嵌合抗原受體和其他腫瘤抗原有更好的效果，靶點(diǎn)的表達(dá)量高，使得car-t細(xì)胞的免疫效果增強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)獒槍?duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體(scfv)，所述針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體氨基酸序列(seqidno.1)如下：

gdivmtqtplslpvtpgepasiscrssksllhsngitylywylqkpgqspqlliyqmsnlvsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycaqnlelpytfgggtkveikgstsgsgkpgssegstkgqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsyswinwvrqapgqglewmgrifpgdgdtdyngkfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarnvfdgywlvywgqgtlvtvss.

本發(fā)明中，所述針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體進(jìn)行了特異性改造，使得改造后的序列表達(dá)出來(lái)的抗體的抗原-抗體結(jié)合力更強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包括針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的突變體的單鏈抗體，所述針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的突變體的單鏈抗體的氨基酸序列與seqidno.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根據(jù)本發(fā)明，所述跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)閏d28跨膜結(jié)構(gòu)域和/或cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域，在一些具體實(shí)施方案中，可以通過(guò)氨基酸替換來(lái)選擇或修飾跨膜結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)本發(fā)明，所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或cd137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的組合，所述cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的排列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域不同的排列不會(huì)對(duì)所述嵌合抗原受體產(chǎn)生影響，本申請(qǐng)優(yōu)選采用cd28-cd127-il-15ra-cd137的順序組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域?yàn)榘滋斓鞍酌?結(jié)構(gòu)域，所述胱天蛋白酶9結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述胱天蛋白酶9結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(seqidno.4)如下：

gsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.

根據(jù)本發(fā)明，所述可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域通過(guò)2a序列與cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相串聯(lián)，所述2a序列會(huì)使所述可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域表達(dá)的蛋白與所述嵌合抗原受體蛋白斷裂開(kāi)，從而使得所述嵌合抗原受體能夠發(fā)揮作用，而通過(guò)注入激活劑，從而使得可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域激活，從而導(dǎo)致嵌合抗原受體失去作用。

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體還包括信號(hào)肽，所述信號(hào)肽為能夠指導(dǎo)嵌合抗原受體跨膜轉(zhuǎn)移的信號(hào)肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域常規(guī)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽可以為任何一個(gè)分泌蛋白基因的信號(hào)肽，本發(fā)明所述信號(hào)肽為secretory信號(hào)肽，所述secretory信號(hào)肽的氨基酸序列如seqidno.5-6所示。

優(yōu)選地，所述secretory信號(hào)肽為cd8a基因的信號(hào)肽，所述secretory信號(hào)肽的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述seqidno.5所述的氨基酸序列如下：malpvtalllplalllhaarp。

優(yōu)選地，所述secretory信號(hào)肽為gmcsfr基因的信號(hào)肽，所述secretory信號(hào)肽的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述seqidno.6所述的氨基酸序列如下：mlllvtslllcelphpafllip。

本發(fā)明的嵌合抗原受體還可以包括鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定，鉸鏈區(qū)的存在不會(huì)對(duì)本發(fā)明的嵌合抗原受體的性能產(chǎn)生影響。

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體包括信號(hào)肽、抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、2a序列和可誘導(dǎo)自殺融合結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述嵌合抗原受體為secretory信號(hào)肽、cd20抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，cd8α和/或cd28跨膜結(jié)構(gòu)域，cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、2a序列和胱天蛋白酶9結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成，具體排列如下：

secretory-cd20-cd28-cd127-il-15ra-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9。

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體secretory-cd20-cd28-cd127-il-15ra-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列(seqidno.2)如下：

mlllvtslllcelphpafllipgdivmtqtplslpvtpgepasiscrssksllhsngitylywylqkpgqspqlliyqmsnlvsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycaqnlelpytfgggtkveikgstsgsgkpgssegstkgqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsyswinwvrqapgqglewmgrifpgdgdtdyngkfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarnvfdgywlvywgqgtlvtvssaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsasggggsggggskkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqleesekqrlggdvqspncpsedvvitpesfgrdssltclagnvsacdapilsssrsldcresgkngphvyqdlllslgttnstlpppfslqsgiltlnpvaqgqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnqsrggggsggggstsggggsggggsksrqtpplasvemeamealpvtwgtssrdedlencshhlggggsggggstsggggsggggsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelggggsggggsggggsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprtsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.

根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體secretory-cd20-cd28-cd127-il-15ra-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述嵌合抗原受體的核苷酸序列(seqidno.3)如下：

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgccttcctgctgatccccggcgacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgcccgtgacccccggcgagcccgccagcatcagctgcagaagcagcaagagcctgctgcacagcaacggcatcacctacctgtactggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctaccagatgagcaacctggtgagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagagtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcgcccagaacctggagctgccctacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcagcagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacgccttcagctacagctggatcaactgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggcagaatcttccccggcgacggcgacaccgactacaacggcaagttcaagggcagagtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaacgtgttcgacggctactggctggtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccgccgccatcgaggtgatgtacccccccccctacctggacaacgagaagagcaacggcaccatcatccacgtgaagggcaagcacctgtgccccagccccctgttccccggccccagcaagcccttctgggtgctggtggtggtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggccttcatcatcttctgggtgagaagcaagagaagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgacccccagaagacccggccccaccagaaagcactaccagccctacgccccccccagagacttcgccgcctacagaagcgccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaagaagagaatcaagcccatcgtgtggcccagcctgcccgaccacaagaagaccctggagcacctgtgcaagaagcccagaaagaacctgaacgtgagcttcaaccccgagagcttcctggactgccagatccacagagtggacgacatccaggccagagacgaggtggagggcttcctgcaggacaccttcccccagcagctggaggagagcgagaagcagagactgggcggcgacgtgcagagccccaactgccccagcgaggacgtggtgatcacccccgagagcttcggcagagacagcagcctgacctgcctggccggcaacgtgagcgcctgcgacgcccccatcctgagcagcagcagaagcctggactgcagagagagcggcaagaacggcccccacgtgtaccaggacctgctgctgagcctgggcaccaccaacagcaccctgcccccccccttcagcctgcagagcggcatcctgaccctgaaccccgtggcccagggccagcccatcctgaccagcctgggcagcaaccaggaggaggcctacgtgaccatgagcagcttctaccagaaccagagcagaggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaagagcagacagaccccccccctggccagcgtggagatggaggccatggaggccctgcccgtgacctggggcaccagcagcagagacgaggacctggagaactgcagccaccacctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtggtgaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaaccagcggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccatgggcgtgcaggtggagaccatcagccccggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactacaccggcatgctggaggacggcaagaaggtggacagcagcagagacagaaacaagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctacggcgccaccggccaccccggcatcatccccccccacgccaccctggtgttcgacgtggagctgctgaagctggagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcgccatggtgggcgccctggagagcctgagaggcaacgccgacctggcctacatcctgagcatggagccctgcggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgcagagagagcggcctgagaaccagaaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgagaagaagattcagcagcctgcacttcatggtggaggtgaagggcgacctgaccgccaagaagatggtgctggccctgctggagctggccagacaggaccacggcgccctggactgctgcgtggtggtgatcctgagccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggcgccgtgtacggcaccgacggctgccccgtgagcgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcaccagctgccccagcctgggcggcaagcccaagctgttcttcatccaggcctgcggcggcgagcagaaggaccacggcttcgaggtggccagcaccagccccgaggacgagagccccggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgagaaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcaccttccccggcttcgtgagctggagagaccccaagagcggcagctggtacgtggagaccctggacgacatcttcgagcagtgggcccacagcgaggacctgcagagcctgctgctgagagtggccaacgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgcccggctgcttcaacttcctgagaaagaagctgttcttcaagaccagcgccagctga.

本發(fā)明中，所述嵌合抗原受體還包括啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為ef1a、cmv-tar或cmv中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述的嵌合抗原受體通過(guò)其編碼的核酸序列轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞中表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明，所述轉(zhuǎn)染的方式為通過(guò)病毒載體、真核表達(dá)質(zhì)?；騧rna序列中的任意一種或至少兩種的組合轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞，優(yōu)選為通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述病毒載體為慢病毒載體和/或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選為慢病毒載體。

第二方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，將包含如第一方面所述的嵌合抗原受體的病毒載體與包裝輔助質(zhì)粒pnhp和phef-vsvg共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。

根據(jù)本發(fā)明，所述哺乳細(xì)胞為293細(xì)胞，293t細(xì)胞或te671細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

第三方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受體和/或如第二方面所述的重組慢病毒。

第四方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的嵌合抗原受體、如第二方面所述的重組慢病毒或如第三方面所述的組合物在制備嵌合抗原受體t細(xì)胞及其在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選地，所述腫瘤為血液相關(guān)的腫瘤疾病和/或?qū)嶓w瘤，所述腫瘤疾病選自但不限于白血病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明的嵌合抗原受體通過(guò)對(duì)cd20腫瘤表面抗原進(jìn)行特定的基因改造，改造后的抗體能夠使抗原-抗體結(jié)合力更強(qiáng)；

(2)本發(fā)明的嵌合抗原受體能特異性的識(shí)別腫瘤表面抗原cd20，cd20在白血病及淋巴瘤中表達(dá)量高，且嵌合抗原受體上的針對(duì)腫瘤表面抗原cd20的單鏈抗體不容易發(fā)生突變，相比于其他嵌合抗原受體和其他腫瘤抗原有更好的效果，使得car-t細(xì)胞的免疫效果增強(qiáng)，增強(qiáng)了car-t細(xì)胞的治療效果；

(3)本發(fā)明的嵌合抗原受體在進(jìn)行car-t細(xì)胞回輸后，腫瘤表面cd20的表達(dá)量不會(huì)降低，不容易逃過(guò)免疫機(jī)制，能夠更好的進(jìn)行治療。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的嵌合抗原受體的合成基因序列圖譜；

圖2(a)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi細(xì)胞株流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖2(b)b淋巴細(xì)胞瘤blcl1流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖2(c)b淋巴細(xì)胞瘤blcl2流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，其中，灰色區(qū)域?yàn)橥完幮詫?duì)照；

圖3(a)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi對(duì)照組培養(yǎng)2天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖3(b)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi對(duì)照組培養(yǎng)4天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖3(c)人淋巴瘤細(xì)胞daudi為對(duì)照組培養(yǎng)12天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖；

圖4為人淋巴瘤細(xì)胞daudi和cd20car-t細(xì)胞共培養(yǎng)的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，其中圖4(a)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi和cd20car-t細(xì)胞共培養(yǎng)2天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖4(b)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi和cd20car-t細(xì)胞共培養(yǎng)4天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖4(c)為人淋巴瘤細(xì)胞daudi和cd20car-t細(xì)胞共培養(yǎng)12天的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖；

圖5為gfp染色圖結(jié)果，其中，綠色熒光表示人淋巴瘤細(xì)胞的存活細(xì)胞，第一列為對(duì)照組daudi細(xì)胞未加t細(xì)胞毒殺的gfp染色圖，第二列為經(jīng)加入cd20car-t細(xì)胞毒殺后的人淋巴瘤細(xì)胞的gfp染色圖；

圖6(a)為白血病靶細(xì)胞未加cart對(duì)照組的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖6(b)為白血病靶細(xì)胞的自動(dòng)細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖7(a)為cd20car-t細(xì)胞與白血病靶細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖，圖7(b)為cd20car-t細(xì)胞與白血病靶細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)的細(xì)胞凋亡結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：嵌合抗原受體的構(gòu)建

(1)通過(guò)全基因合成secretory信號(hào)肽、cd20抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，cd8α和/或cd28跨膜結(jié)構(gòu)域，cd28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、cd127信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、il-15ra信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和cd137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、2a序列和胱天蛋白酶9結(jié)構(gòu)域，如圖1所示，即

secretory-cd20-cd28-cd127-il-15ra-cd137-cd3ζ-2a-fbkp.casp9；

所述嵌合抗原受體的核苷酸序列seqidno.3如下：

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgccttcctgctgatccccggcgacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgcccgtgacccccggcgagcccgccagcatcagctgcagaagcagcaagagcctgctgcacagcaacggcatcacctacctgtactggtacctgcagaagcccggccagagcccccagctgctgatctaccagatgagcaacctggtgagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagagtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcgcccagaacctggagctgccctacaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggccaggtgcagctggtgcagagcggcgccgaggtgaagaagcccggcagcagcgtgaaggtgagctgcaaggccagcggctacgccttcagctacagctggatcaactgggtgagacaggcccccggccagggcctggagtggatgggcagaatcttccccggcgacggcgacaccgactacaacggcaagttcaagggcagagtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctacatggagctgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaacgtgttcgacggctactggctggtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccgccgccatcgaggtgatgtacccccccccctacctggacaacgagaagagcaacggcaccatcatccacgtgaagggcaagcacctgtgccccagccccctgttccccggccccagcaagcccttctgggtgctggtggtggtgggcggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggccttcatcatcttctgggtgagaagcaagagaagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgacccccagaagacccggccccaccagaaagcactaccagccctacgccccccccagagacttcgccgcctacagaagcgccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaagaagagaatcaagcccatcgtgtggcccagcctgcccgaccacaagaagaccctggagcacctgtgcaagaagcccagaaagaacctgaacgtgagcttcaaccccgagagcttcctggactgccagatccacagagtggacgacatccaggccagagacgaggtggagggcttcctgcaggacaccttcccccagcagctggaggagagcgagaagcagagactgggcggcgacgtgcagagccccaactgccccagcgaggacgtggtgatcacccccgagagcttcggcagagacagcagcctgacctgcctggccggcaacgtgagcgcctgcgacgcccccatcctgagcagcagcagaagcctggactgcagagagagcggcaagaacggcccccacgtgtaccaggacctgctgctgagcctgggcaccaccaacagcaccctgcccccccccttcagcctgcagagcggcatcctgaccctgaaccccgtggcccagggccagcccatcctgaccagcctgggcagcaaccaggaggaggcctacgtgaccatgagcagcttctaccagaaccagagcagaggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaagagcagacagaccccccccctggccagcgtggagatggaggccatggaggccctgcccgtgacctggggcaccagcagcagagacgaggacctggagaactgcagccaccacctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcaccagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgtggtgaagagaggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgcagctgcagattccccgaggaggaggagggcggctgcgagctgggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccccgcctaccagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagagaggagtacgacgtgctggacaagagaagaggcagagaccccgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagagaagaagaggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaaccagcggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggccccatgggcgtgcaggtggagaccatcagccccggcgacggcagaaccttccccaagagaggccagacctgcgtggtgcactacaccggcatgctggaggacggcaagaaggtggacagcagcagagacagaaacaagcccttcaagttcatgctgggcaagcaggaggtgatcagaggctgggaggagggcgtggcccagatgagcgtgggccagagagccaagctgaccatcagccccgactacgcctacggcgccaccggccaccccggcatcatccccccccacgccaccctggtgttcgacgtggagctgctgaagctggagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcgccatggtgggcgccctggagagcctgagaggcaacgccgacctggcctacatcctgagcatggagccctgcggccactgcctgatcatcaacaacgtgaacttctgcagagagagcggcctgagaaccagaaccggcagcaacatcgactgcgagaagctgagaagaagattcagcagcctgcacttcatggtggaggtgaagggcgacctgaccgccaagaagatggtgctggccctgctggagctggccagacaggaccacggcgccctggactgctgcgtggtggtgatcctgagccacggctgccaggccagccacctgcagttccccggcgccgtgtacggcaccgacggctgccccgtgagcgtggagaagatcgtgaacatcttcaacggcaccagctgccccagcctgggcggcaagcccaagctgttcttcatccaggcctgcggcggcgagcagaaggaccacggcttcgaggtggccagcaccagccccgaggacgagagccccggcagcaaccccgagcccgacgccacccccttccaggagggcctgagaaccttcgaccagctggacgccatcagcagcctgcccacccccagcgacatcttcgtgagctacagcaccttccccggcttcgtgagctggagagaccccaagagcggcagctggtacgtggagaccctggacgacatcttcgagcagtgggcccacagcgaggacctgcagagcctgctgctgagagtggccaacgccgtgagcgtgaagggcatctacaagcagatgcccggctgcttcaacttcctgagaaagaagctgttcttcaagaccagcgccagctga.

實(shí)施例2：慢病毒包裝

(1)用六孔板分別培養(yǎng)293t細(xì)胞，1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)17-18小時(shí)；

(2)加入600μl/孔的新鮮的dmem，內(nèi)含10％的fbs；

(3)在無(wú)菌離心管中加入以下試劑：每孔取75μl的dmem的上清液，2.7μg的helperdnamix(1.8μgpnhp，0.5μgphef-vsv-g，0.2μgphefegfp)以及0.8μg的ptydna載體，漩渦振蕩；

(4)從每孔板中央吸取7μl的superfect加至離心管中吹打5次，室溫靜置7-10分鐘；

(5)將離心管中的dna-superfect混合液逐滴加入至每個(gè)培養(yǎng)孔中，漩渦打勻；

(6)37℃3％co2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4-5小時(shí)；

(7)吸走培養(yǎng)基的培養(yǎng)液，用1.5mlaim-v沖洗培養(yǎng)基，并加入1.5ml的aim-v繼續(xù)培養(yǎng)；

(8)將培養(yǎng)基放回3％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第二天早上用熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)施例3：慢病毒的純化和濃縮

1)病毒純化

通過(guò)離心(1000g，5分鐘)除去細(xì)胞碎片，得到病毒上清液，用一個(gè)0.45微米的低蛋白結(jié)合過(guò)濾器將病毒上清液過(guò)濾，病毒被分裝成小份，儲(chǔ)存在-80℃；

通常情況下，在每毫升的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以產(chǎn)生10⁶到10⁷轉(zhuǎn)導(dǎo)單位滴定的慢病毒載體。

2)用centricon過(guò)濾器濃縮慢病毒載體

(1)在生物安全柜中，取centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用無(wú)菌pbs清洗3次；

(2)每個(gè)centriconp-20過(guò)濾管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g下離心30分鐘或者直到病毒體積減小到0.5ml；

(3)震蕩過(guò)濾管，然后在400g下，離心2分鐘，收集濃縮的病毒到收集杯中。最后將所有管中的病毒集中到一個(gè)離心管中。

實(shí)施例4：car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將活化后的t細(xì)胞以5×10⁶接種到24孔板，加入50μl的濃縮目標(biāo)基因的慢病毒，以100g離心力的速度，室溫離心100分鐘后，置于37℃培養(yǎng)24h，加入1ml的含有2％人血清，1％青霉素或鏈霉素與細(xì)胞培養(yǎng)因子的aim-v基，培養(yǎng)2-3天后，將細(xì)胞收獲并計(jì)數(shù)，以1×10⁷接種到12孔板，培養(yǎng)2-3天，用慢病毒載體攜帶gfp感染靶細(xì)胞并用annexinv/pi染色法觀(guān)察細(xì)胞毒殺效果，結(jié)果如圖2所示。

從圖2(a)-圖2(c)可以看出，daudi細(xì)胞(人淋巴瘤細(xì)胞)、blcl1細(xì)胞和blcl2細(xì)胞表面都有cd20的表達(dá)，本發(fā)明選用的cd20car能夠用于治療daudi、blcl1和blcl2。

實(shí)施例5car-t細(xì)胞的daudi體外腫瘤殺傷

(1)將非專(zhuān)一性的4gs-mesocart細(xì)胞和本申請(qǐng)制備的專(zhuān)一性的4gs-cd20car-t細(xì)胞與daudi腫瘤靶細(xì)胞共培養(yǎng)，置于37度5％co2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18h、2天、4天、9天和12天；

(2)體外評(píng)估car-t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別殺傷功能，靶細(xì)胞為鈣黃綠素標(biāo)記或感染lv-gfp，結(jié)果如圖3-7所示；

從圖3(a)-圖3(c)可以看出，daudi腫瘤靶細(xì)胞培養(yǎng)2天后的腫瘤細(xì)胞數(shù)比例為98.4％，培養(yǎng)4天后的腫瘤細(xì)胞數(shù)比例為98.8％，培養(yǎng)12天后的腫瘤細(xì)胞數(shù)比例為99％，從圖4(a)-圖4(c)可以看出，當(dāng)cd20car-t細(xì)胞與daudi腫瘤靶細(xì)胞培養(yǎng)2天后，daudi腫瘤靶細(xì)胞數(shù)的比例為38.3％，培養(yǎng)4天后，daudi腫瘤靶細(xì)胞數(shù)的比例為13.6％，培養(yǎng)12天后，daudi腫瘤靶細(xì)胞數(shù)的比例為3.8％，可見(jiàn)，cd20car-t細(xì)胞共培養(yǎng)的存活細(xì)胞比例迅速減少，由此可得cd20car-t細(xì)胞對(duì)daudi腫瘤靶細(xì)胞的毒殺效果好。

從圖5可以看出，第一列一般的t細(xì)胞與daudi腫瘤靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，綠色熒光基本沒(méi)發(fā)生變化，第二列的cd20car-t細(xì)胞與daudi腫瘤靶細(xì)胞共培養(yǎng)后綠色熒光基本消失，即daudi腫瘤靶細(xì)胞基本死亡，說(shuō)明cd20car-t細(xì)胞對(duì)daudi腫瘤靶細(xì)胞的毒殺效果好。

從圖6-圖7可以看出，從圖6(a)和圖7(a)對(duì)比可以看出，熒光強(qiáng)度為10³以上的細(xì)胞為daudi腫瘤靶細(xì)胞，挑選圖6(a)和圖7(a)中熒光強(qiáng)度為10³以上的細(xì)胞做進(jìn)一步分析，從圖6(b)可以看出，23.3％的靶細(xì)胞瀕臨自然凋亡，5.3％的靶細(xì)胞自然凋亡，從圖7(b)加入cart后可以看出，80.6％的靶細(xì)胞瀕臨凋亡，17.1％的靶細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)，cd20car-t細(xì)胞的靶細(xì)胞瀕臨凋亡以及靶細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組，因此cd20car-t細(xì)胞對(duì)daudi腫瘤靶細(xì)胞有較好的毒殺作用。

綜上所述，本發(fā)明的嵌合抗原受體的針對(duì)cd20腫瘤表面抗原的單鏈抗體不容易發(fā)生突變，且相比于其他嵌合抗原受體和其他腫瘤抗原有更好的效果，使得car-t細(xì)胞的免疫效果增強(qiáng)，增強(qiáng)了car-t細(xì)胞的治療效果。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳市免疫基因治療研究院

<120>一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>250

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>1

glyaspilevalmetthrglnthrproleuserleuprovalthrpro

151015

glygluproalaserilesercysargserserlysserleuleuhis

202530

serasnglyilethrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglygln

354045

serproglnleuleuiletyrglnmetserasnleuvalserglyval

505560

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulys

65707580

ileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalagln

859095

asnleugluleuprotyrthrpheglyglyglythrlysvalgluile

100105110

lysglyserthrserglyserglylysproglysersergluglyser

115120125

thrlysglyglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

130135140

proglyserservallysvalsercyslysalaserglytyralaphe

145150155160

sertyrsertrpileasntrpvalargglnalaproglyglnglyleu

165170175

glutrpmetglyargilepheproglyaspglyaspthrasptyrasn

180185190

glylysphelysglyargvalthrilethralaasplysserthrser

195200205

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

210215220

tyrtyrcysalaargasnvalpheaspglytyrtrpleuvaltyrtrp

225230235240

glyglnglythrleuvalthrvalserser

245250

<210>2

<211>1270

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>2

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuileproglyaspilevalmetthrglnthrproleu

202530

serleuprovalthrproglygluproalaserilesercysargser

354045

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505560

leuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyrglnmetser

65707580

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859095

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100105110

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130135140

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225230235240

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245250255

tyrtrpleuvaltyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

260265270

alaalaalailegluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglu

275280285

lysserasnglythrileilehisvallysglylyshisleucyspro

290295300

serproleupheproglyproserlysprophetrpvalleuvalval

305310315320

valglyglyvalleualacystyrserleuleuvalthrvalalaphe

325330335

ileilephetrpvalargserlysargserargleuleuhisserasp

340345350

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355360365

glnprotyralaproproargaspphealaalatyrargseralaser

370375380

glyglyglyglyserglyglyglyglyserlyslysargilelyspro

385390395400

ilevaltrpproserleuproasphislyslysthrleugluhisleu

405410415

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420425430

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435440445

gluvalgluglypheleuglnaspthrpheproglnglnleugluglu

450455460

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465470475480

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485490495

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500505510

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515520525

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530535540

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545550555560

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565570575

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580585590

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595600605

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610615620

glumetglualametglualaleuprovalthrtrpglythrserser

625630635640

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645650655

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660665670

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675680685

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690695700

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705710715720

glyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserargvallys

725730735

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740745750

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755760765

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770775780

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785790795800

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805810815

lysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysasp

820825830

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850855860

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900905910

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915920925

trpglugluglyvalalaglnmetservalglyglnargalalysleu

930935940

thrileserproasptyralatyrglyalathrglyhisproglyile

945950955960

ileproprohisalathrleuvalpheaspvalgluleuleulysleu

965970975

gluglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyalametvalgly

980985990

alaleugluserleuargglyasnalaaspleualatyrileleuser

99510001005

metgluprocysglyhiscysleuileileasnasnvalasnphe

101010151020

cysarggluserglyleuargthrargthrglyserasnileasp

102510301035

cysglulysleuargargargpheserserleuhisphemetval

104010451050

gluvallysglyaspleuthralalyslysmetvalleualaleu

105510601065

leugluleualaargglnasphisglyalaleuaspcyscysval

107010751080

valvalileleuserhisglycysglnalaserhisleuglnphe

108510901095

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110011051110

lysilevalasnilepheasnglythrsercysproserleugly

111511201125

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113011351140

lysasphisglyphegluvalalaserthrserprogluaspglu

114511501155

serproglyserasnprogluproaspalathrpropheglnglu

116011651170

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117511801185

thrproseraspilephevalsertyrserthrpheproglyphe

119011951200

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120512101215

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122012251230

serleuleuleuargvalalaasnalavalservallysglyile

123512401245

tyrlysglnmetproglycyspheasnpheleuarglyslysleu

125012551260

phephelysthrseralaser

12651270

<210>3

<211>3813

<212>dna

<213>人工合成序列

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<212>prt

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202530

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505560

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100105110

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leugluglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyalametval

130135140

glyalaleugluserleuargglyasnalaaspleualatyrileleu

145150155160

sermetgluprocysglyhiscysleuileileasnasnvalasnphe

165170175

cysarggluserglyleuargthrargthrglyserasnileaspcys

180185190

glulysleuargargargpheserserleuhisphemetvalgluval

195200205

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ileserserleuprothrproseraspilephevalsertyrserthr

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leuglnserleuleuleuargvalalaasnalavalservallysgly

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iletyrlysglnmetproglycyspheasnpheleuarglyslysleu

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phephelysthrseralaser

420

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<212>prt

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hisalaalaargpro

20

<210>6

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<212>prt

<213>人工合成序列

<400>6

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuilepro

20