本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于惡性腫瘤免疫治療的，基于octs技術(shù)的car雙靶向嵌合抗原受體、編碼基因、octs-car重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞(如，高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為機(jī)體中經(jīng)常會出現(xiàn)的突變的腫瘤細(xì)胞可被免疫系統(tǒng)所識別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。隨后，各種腫瘤免疫療法包括細(xì)胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應(yīng)用于臨床。2013年一種更先進(jìn)的腫瘤免疫療法---car-t療法成功用于臨床，并表現(xiàn)了前所未有的臨床療效。car-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療法。該療法是通過轉(zhuǎn)基因的手段，將啟動子、抗原識別區(qū)、共刺激因子、效應(yīng)區(qū)等共同組成的嵌合分子，導(dǎo)入t細(xì)胞基因組內(nèi)，從而使t細(xì)胞對靶細(xì)胞的識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、殺傷等功能融為一體，實現(xiàn)了對靶細(xì)胞的特異性殺傷[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t療法在臨床上最領(lǐng)先的有諾華的clt019，采用clt019治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者，六個月的腫瘤無進(jìn)展生存率達(dá)到67％，其中最長的應(yīng)答時間達(dá)到兩年多?？偛课挥谥袊虾５纳虾?yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司與醫(yī)院合作，截止到2017年2月，共治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達(dá)到66.6％。因此，car-t細(xì)胞療法是抗癌研究的顛覆性突破，可能是最有可能治愈癌癥的手段之一，并被《science》雜志評為2013年度十大科技突破之首。car-t目前在在治療b-淋巴細(xì)胞白血病等幾種類型的血液腫瘤方面療效顯著，但是也存在一些局限性，比如目前一個嵌合抗原受體只能識別一種抗原靶標(biāo)，但腫瘤細(xì)胞是個復(fù)雜的群體，含有相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞被清除以后，不含相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞會迅速增殖，一段時間后導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。要使car-t識別能同時識別兩種抗原，有兩個方案可選：一是將兩組嵌合抗原受體構(gòu)建進(jìn)入一個慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，一次性將兩組嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞；二是用兩個慢病毒轉(zhuǎn)基因載體分兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，將兩組嵌合抗原受體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞。方案一的缺點在于占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，不利于裝載其它功能元件；轉(zhuǎn)基因載體包裝效率低；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率非常低，很難轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入原代t淋巴細(xì)胞內(nèi)。方案二的缺點在于需要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)的綜合效率較低，轉(zhuǎn)導(dǎo)周期時間長，原代細(xì)胞容易衰老，導(dǎo)致增殖能力衰退，殺傷功能下降，影響腫瘤清除療效。作為腫瘤免疫治療的重點研究對象，多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)的腫瘤細(xì)胞起源于骨髓中的漿細(xì)胞，而漿細(xì)胞是b淋巴細(xì)胞發(fā)育到最終功能階段的細(xì)胞，因此是一種采用現(xiàn)有治療方法很難治愈的惡性漿細(xì)胞腫瘤。通?；颊叩纳嫫跒?年，短的甚至只有6-12個月。但研究發(fā)現(xiàn)，某些物質(zhì)在b細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在或高表達(dá)，可作為細(xì)胞標(biāo)記物或靶標(biāo)。如：bcma(b-cellmaturationantigen)作為一種標(biāo)志物選擇性表達(dá)在b細(xì)胞(包括多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)表面，可以作為car-t細(xì)胞的靶標(biāo)引導(dǎo)car-t細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞(b-cellmaturationantigenisapromisingtargetforadoptivetcelltherapyofmultiplemyeloma.roberto.carpenter,etal.clincancerres.2013april15；19(8):2048–2060.)。cd319又稱為cs1、slamf7，是一種穩(wěn)定的細(xì)胞表面標(biāo)志物，在正常漿細(xì)胞和惡性漿細(xì)胞表達(dá)均有表達(dá)。cd319是一種及其穩(wěn)定的抗原，即便是經(jīng)過粗糙的手段分離得到的惡性漿細(xì)胞系，甚至是經(jīng)過凍存以后，仍然可以穩(wěn)定的檢測出表達(dá)[frigyesii,adolfssonj,alim,christophersenmk,johnssone,turessoni,gullbergu,hanssonm,nilssonb(feb2014)."robustisolationofmalignantplasmacellsinmultiplemyeloma".blood.123(9):1336–40.]。cd38也稱做cyclicadpribosehydrolase，在很多免疫細(xì)胞表面能檢測到，包括b細(xì)胞和nk細(xì)胞。cd38是一種細(xì)胞活化的標(biāo)志物，與hiv感染、白血病、骨髓瘤、實體瘤等聯(lián)系在一起。目前臨床上有使用靶向cd38的抗體來治療多發(fā)性骨髓瘤[lokhorst,henkm.；plesner,torben；laubach,jacobp.；nahi,hareth；gimsing,peter；hansson,markus；minnema,moniquec.；lassen,ulrik；krejcik,jakub(2015-09-24)."targetingcd38withdaratumumabmonotherapyinmultiplemyeloma".thenewenglandjournalofmedicine.373(13):1207–1219.]。cd123是人白介素3受體的alpha鏈，在大多數(shù)的急性髓系白血病(aml)細(xì)胞和很多造血細(xì)胞表面均有表達(dá)，cd123是一個非常好的免疫治療靶點，因為即使在cd123表達(dá)很少的細(xì)胞里，它的表達(dá)會隨時間增長逐漸增強(qiáng)，并且急性髓系白血病很可能是由于處于白血病前期的造血干細(xì)胞經(jīng)過克隆演化而來，以cd123為靶點，則可以起到清髓的作用(saargill,carlh.juneetal.preclinicaltargetingofhumanacutemyeloidleukemiaandmyeloablationusingchimericantigenreceptor-modifiedtcells.blood.2014；123(15):2343-2354.)。pd-l1在多數(shù)癌癥組織中過量表達(dá)，包括nsclc、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病及各種泌尿系腫瘤、消化道腫瘤、生殖系腫瘤等[intlekoferam,thompsoncb.atthebench:preclinicalrationaleforctla-4andpd-1blockadeascancerimmunotherapy[j].jleukocbiol,2013,94(1):25-39.]。parsa在鼠和人的腫瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)t細(xì)胞異常分泌的ifn-γ，ifn-γ可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的pd-l1高表達(dá)[dingh,wux,wuj,etal.deliveringpd-1inhibitorysignalconcomitantwithblockingicosco-stimulationsuppresseslupus-likesyndromeinautoimmunebxsbmice[j].clinimmunol,2006,118(2/3):258-267.]。pd-l1高表達(dá)，可以通過抑制ras及pi3k/akt信號通路，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期檢查點蛋白和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致t細(xì)胞增殖的抑制[11]。dong等體外實驗和小鼠模型還發(fā)現(xiàn)，pd-1/pd-l1信號通路的激活可以誘導(dǎo)特異性ctl調(diào)亡，使ctl的細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)敏感性下降，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[dongh,stromese,salomaodr,etal.tumor-associatedb7-h1promotest-cellapoptosis:apotentialmechanismofimmuneevasion[j].natmed,2002,8(8):793-800.]。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而進(jìn)行的，目的在于提供一種用于惡性腫瘤，尤其是多發(fā)性骨髓瘤免疫治療的基于octs技術(shù)的car雙靶向嵌合抗原受體、編碼基因、octs-car重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。octs的全稱是onecarwithtwoscfvs，通過串聯(lián)octs(seriesocts)或者轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的連接方式，將兩段scfv與整合成一個嵌合分子(圖1所示)，賦予t淋巴細(xì)胞hla非依賴的方式識別兩種腫瘤抗原的能力，相對于傳統(tǒng)的car-t細(xì)胞能夠識別更廣泛的目標(biāo)，進(jìn)一步擴(kuò)大了腫瘤細(xì)胞的清除范圍。octs的基礎(chǔ)設(shè)計中包括兩個腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigen，taa)結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scfv段)，一個胞外鉸鏈區(qū)，一個跨膜區(qū)，兩個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)和一個效應(yīng)元件區(qū)。scfv區(qū)域?qū)τ趏cts的特異性、有效性以及基因改造t細(xì)胞自身的安全性來說是關(guān)鍵的決定因素。本發(fā)明所采用的octs-car-t技術(shù)，是在目前car-t細(xì)胞治療的基礎(chǔ)上，通過對嵌合抗原受體(car)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造，使得嵌合抗原受體能夠識別兩種抗原，大大擴(kuò)展了car-t細(xì)胞的識別范圍，針對腫瘤群體的清除更徹底，療效更持久。本發(fā)明的第一方面，提供了一種基于octs技術(shù)的car雙靶向嵌合抗原受體，包括依次串聯(lián)連接的cd8leader膜受體信號肽、雙抗原結(jié)合區(qū)、cd8hinge嵌合受體鉸鏈、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、cd28嵌合受體共刺激因子、cd134嵌合受體共刺激因子以及tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域。其中，雙抗原結(jié)合區(qū)包括以一定方式連接的兩個單鏈抗體的重鏈vh和輕鏈vl、抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker以及單鏈抗體間鉸鏈inter-linker；該兩個單鏈抗體指的是bcma單鏈抗體、cd319單鏈抗體、cd38單鏈抗體、pdl1單鏈抗體、cd123單鏈抗體之間的任意兩兩組合。進(jìn)一步，本發(fā)明的octs-car雙靶向嵌合抗原受體，還具有如下技術(shù)特征：兩個單鏈抗體以串聯(lián)或轉(zhuǎn)角的連接方式連接。本發(fā)明的第二個方面，提供了編碼上述car雙靶向嵌合抗原受體的基因，編碼上述各部分的基因的序列編號對照如下：cd8leader膜受體信號肽(seqidno.15)、bcma單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.16)、bcma單鏈抗體重鏈vh(seqidno.17)、cd319單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.18)、cd319單鏈抗體重鏈vh(seqidno.19)、cd38單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.20)、cd38單鏈抗體重鏈vh(seqidno.21)、pdl1單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.22)、pdl1單鏈抗體重鏈vh(seqidno.23)、cd123單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.24)、cd123單鏈抗體重鏈vh(seqidno.25)、抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker(seqidno.26)、單鏈抗體間鉸鏈inter-linker(seqidno.27)、cd8hinge嵌合受體鉸鏈(seqidno.28)、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)(seqidno.29)、cd28嵌合受體共刺激因子(seqidno.30)、cd134嵌合受體共刺激因子(seqidno.31)、tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域(seqidno.32)。本發(fā)明的第三方面，提供了一種octs-car重組表達(dá)載體，具有這樣的技術(shù)特征：包括表達(dá)載體、人ef1α啟動子、以及編碼car-t雙靶向嵌合抗原受體的基因。其中，人ef1α啟動子的基因序列如seqidno.14所示，編碼car-t雙靶向嵌合抗原受體中各部分的基因如上所述。其中，抗原結(jié)合區(qū)的基因序列包括bcma、cd319、cd38、pdl1、cd123中任意兩種的單鏈抗體的輕鏈vl和重鏈vh的基因序列。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了另一種octs-car重組表達(dá)載體，相對于上述的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體還包括編碼pdl1單鏈抗體的基因，其基因序列如seqidno.33所示。本發(fā)明所采用的表達(dá)載體骨架為第三代慢病毒載體(圖2a所示)，3’sinltr去除了u3區(qū)域，消除了慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率；采用rsv啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心rna的持續(xù)高效轉(zhuǎn)錄；采用人自身的ef1α啟動子，使car基因能夠在人體內(nèi)長時間持續(xù)表達(dá)。該慢病毒表達(dá)載體包括含氨芐青霉素抗性基因ampr序列、原核復(fù)制子pucori序列、病毒復(fù)制子sv40ori序列、rsv啟動子、慢病毒5terminalltr、慢病毒3terminalself-inactivatingltr、gag順式元件、rre順式元件、env順式元件、cppt順式元件、zsgreen1綠色熒光蛋白、ires核糖體結(jié)合序列、ewpre增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。本發(fā)明是將人ef1α啟動子、cd8leader嵌合受體信號肽，bcma、cd319、cd38、pdl1、cd123中任意兩種的單鏈抗體輕鏈vl和重鏈vh，抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker，單鏈抗體間鉸鏈inter-linker，cd8hinge嵌合受體鉸鏈，cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)，cd28嵌合受體共刺激因子，cd134嵌合受體共刺激因子，tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域，以及pdl1單鏈抗體的表達(dá)基因構(gòu)建進(jìn)入重組慢病毒載體，由人ef1α啟動子啟動整個octs結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。cd8leader嵌合受體信號肽位于octs蛋白的n端，用于引導(dǎo)octs蛋白定位于細(xì)胞膜；任意兩組單鏈抗體的重鏈和輕鏈相互組合形成雙抗原識別區(qū)，用于識別相應(yīng)靶抗原；cd8hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細(xì)胞膜外側(cè)；cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)用于將整個嵌合受體固定于細(xì)胞膜上；cd28嵌合受體共刺激因子用于刺激t淋巴細(xì)胞體外激活和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞殺傷作用；cd134嵌合受體共刺激因子用于促進(jìn)t淋巴細(xì)胞增殖和因子分泌，增強(qiáng)腫瘤免疫，有利于記憶t細(xì)胞的長期存活；tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域用于激活下游信號通路的表達(dá)；pdl1的單鏈抗體能有效封閉pdl1，阻斷免疫負(fù)調(diào)節(jié)信號通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細(xì)胞免疫治療的療效。當(dāng)抗原識別區(qū)域與靶抗原結(jié)合時，信號通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生t細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞等一系列生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明中，bcma單鏈抗體輕鏈vl、bcma單鏈抗體重鏈vh、cd319單鏈抗體輕鏈vl、cd319單鏈抗體重鏈vh、cd38單鏈抗體輕鏈vl、cd38單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體，具有與所示核苷酸序列>＝80％同源性(優(yōu)選地，>＝90％同源性；等優(yōu)選地，>＝95％同源性；最優(yōu)選地，>＝97％同源性；)的核苷酸序列。本發(fā)明中，bcma單鏈抗體輕鏈vl、bcma單鏈抗體重鏈vh、cd319單鏈抗體輕鏈vl、cd319單鏈抗體重鏈vh、cd38單鏈抗體輕鏈vl、cd38單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體，具有與所示核苷酸序列相對應(yīng)的氨基酸序列>＝80％同源性(優(yōu)選地，>＝90％同源性；等優(yōu)選地，>＝95％同源性；最優(yōu)選地，>＝97％同源性)的氨基酸序列。本發(fā)明中，bcma單鏈抗體輕鏈vl、bcma單鏈抗體重鏈vh、cd319單鏈抗體輕鏈vl、cd319單鏈抗體重鏈vh、cd38單鏈抗體輕鏈vl、cd38單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造，能有效減少體內(nèi)人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的產(chǎn)生，延長scfv的半衰期和作用效果。本發(fā)明采用的轉(zhuǎn)基因載體是重組后的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復(fù)制和增殖，安全可靠。本發(fā)明中的octs嵌合受體中的共刺激因子區(qū)域可以是4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、、tnfrsf13b、tnfrsf18等腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的一種、二種、三種、幾種、幾十種的組合。本發(fā)明中的使用的復(fù)制缺陷型慢病毒轉(zhuǎn)基因載體可以是二代或者三代的慢病毒轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明的第四個方面，提供了octs-car重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：a.將含氨芐青霉素抗性基因ampr序列(seqidno.1)、原核復(fù)制子pucori序列(seqidno.2)、病毒復(fù)制子sv40ori序列(seqidno.3)、rsv啟動子(seqidno.4)、慢病毒5terminalltr(seqidno.5)、慢病毒3terminalself-inactivatingltr(seqidno.6)、gag順式元件(seqidno.7)、rre順式元件(seqidno.8)、env順式元件(seqidno.9)、cppt順式元件(seqidno.10)、zsgreen1綠色熒光蛋白(seqidno.11)、ires核糖體結(jié)合序列(seqidno.12)、ewpre增強(qiáng)型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(seqidno.13)存儲于第三代慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic上，該方法已由本公司開發(fā)構(gòu)建，并公開在《一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的car-t轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用》201610008360.5專利中；b.將編碼cd8leader膜受體信號肽、雙抗原結(jié)合區(qū)、cd8hinge嵌合受體鉸鏈、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、cd28嵌合受體共刺激因子、cd134嵌合受體共刺激因子以及tcr嵌合受體t細(xì)胞激活域的基因經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic中，得到第三代基于octs設(shè)計的重組慢病毒質(zhì)粒，如pocts123bcmas、pocts319bcmas、pocts38bcmas、pocts-pdl1bcmas、pocts123bcmat、pocts319bcmat、pocts38bcmat、pocts-pdl1bcmat等，其中，最后一個字母“s”代表兩段scfv串聯(lián)連接，字母“t”代表兩段scfv轉(zhuǎn)角連接。c.將步驟b得到的所述重組慢病毒質(zhì)粒分別與慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g共同轉(zhuǎn)染hek293t/17細(xì)胞，在hek293t/17細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，包裝成功重組慢病毒載體會釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；d.將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的柱純化方式進(jìn)行純化，分別得到car-t重組慢病毒表達(dá)載體，(命名為lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat)。此外，在步驟b中，還可以將編碼pdl1單鏈抗體的基因與其他基因一起經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic中，得到第三代基于octs設(shè)計的重組慢病毒質(zhì)粒。本發(fā)明的第五方面，提供了一種octs-car-t細(xì)胞，該octs-car-t細(xì)胞是基因組內(nèi)導(dǎo)入有octs-car重組表達(dá)載體或經(jīng)基于octs的car雙靶向嵌合抗原受體修飾的t淋巴細(xì)胞。本發(fā)明采用的octs-car-t細(xì)胞由gmp級別的車間生產(chǎn)后，可用于人體臨床實驗。本發(fā)明的第六方面，提供了octs-car-t細(xì)胞在制備惡性腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述惡性腫瘤治療藥物為治療惡性腫瘤為惡性漿細(xì)胞腫瘤、急性髓系白血病、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、泌尿系腫瘤、消化道腫瘤或生殖系腫瘤的藥物。發(fā)明的作用與效果本發(fā)明采用octs技術(shù)在目前傳統(tǒng)car-t細(xì)胞治療的基礎(chǔ)上，通過對嵌合抗原受體(car)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造，使得嵌合抗原受體能夠識別兩種抗原，一方面大大拓展了car-t細(xì)胞的識別范圍，針對腫瘤群體的清除更徹底，療效更持久；另一方面避免了分批培養(yǎng)car-t細(xì)胞，大大節(jié)約成本，從而避免患者多次回輸不同靶向car-t細(xì)胞，節(jié)約了患者的經(jīng)濟(jì)支出，降低復(fù)發(fā)的幾率，間接提高了患者的生存質(zhì)量。通過串聯(lián)octs(seriesocts)或者轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的連接方式，將兩段scfv整合成一個嵌合分子，不僅賦予t淋巴細(xì)胞hla非依賴的方式識別兩種腫瘤抗原的能力，而且相對于傳統(tǒng)的car-t細(xì)胞能夠識別更廣泛的目標(biāo)，進(jìn)一步擴(kuò)大了腫瘤細(xì)胞的清除范圍，隨著octs-car-t即將進(jìn)入臨床研究階段，標(biāo)志著car-t細(xì)胞治療即將進(jìn)入2.0時代。此外，本發(fā)明的bcma單鏈抗體輕鏈vl、bcma單鏈抗體重鏈vh、cd319單鏈抗體輕鏈vl、cd319單鏈抗體重鏈vh、cd38單鏈抗體輕鏈vl、cd38單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造，能有有效減少體內(nèi)人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的產(chǎn)生，延長scfv的半衰期和作用效果，增加octs-car-t細(xì)胞的存在時間。另外，本發(fā)明中使用的共刺激因子的一種或若干種組合，能夠增加轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的增殖速率、存活時間、殺傷效率、免疫記憶等特性。因此，本發(fā)明所述的octs-car-t細(xì)胞將給腫瘤細(xì)胞治療提供可靠的保障。附圖說明圖1是本發(fā)明的car雙靶向嵌合抗原受體(octs)的示意圖，其中(a)為串聯(lián)octs(seriesocts)的示意圖，(b)為轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的示意圖。圖2是本發(fā)明的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中(a)圖是本發(fā)明采用的第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，(b)圖是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較示意圖。圖3是本發(fā)明的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖；其中，(a)圖是慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)圖是8個octs質(zhì)粒的示意圖；(c)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(d)圖是慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-r質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(e)圖是膜蛋白質(zhì)粒penv-g的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是car雙靶向嵌合抗原受體(octs)的元件順序示意圖，其中，(a)圖是串聯(lián)octs(seriesocts)的結(jié)構(gòu)示意圖，(b)圖是轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是重組慢病毒質(zhì)粒pocts123bcmas(a)、pocts319bcmas(b)、pocts38bcmas(c)、pocts-pdl1bcmas(d)、pocts123bcmat(e)、pocts319bcmat(f)、pocts38bcmat(g)、pocts-pdl1bcmat(h)的酶切預(yù)測圖及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，在圖a～h中，lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖；lane2是上述各重組慢病毒質(zhì)粒的酶切預(yù)測圖；lane3是1kbdnaladdermarker酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；lane4是上述各重組慢病毒質(zhì)粒的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。圖6是重組慢病毒載體的滴度檢測結(jié)果。圖7是本發(fā)明的octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建的流程示意圖，包含分離培養(yǎng)、激活、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、octs-car-t細(xì)胞鑒定等階段。圖8是octs-car-t細(xì)胞的支原體檢測結(jié)果，lane1為dl2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為pbs；lane5為裂解液；lane6為octs123bcmas-car-t細(xì)胞；lane7為octs319bcmas-car-t細(xì)胞；lane8為octs38bcmas-car-t細(xì)胞；lane9為octs-pdl1bcmas-car-t細(xì)胞；lane10為octs123bcmat-car-t細(xì)胞；lane11為octs319bcmat-car-t細(xì)胞；lane12為octs38bcmat-car-t細(xì)胞；lane13為octs-pdl1bcmat-car-t細(xì)胞。圖9是流式檢測octs-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及免疫分型結(jié)果。圖a表示octs123bcmas-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖b表示octs123bcmas-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖c表示octs319bcmas-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖d表示octs319bcmas-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖e表示octs38bcmas-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖f表示octs38bcmas-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖g表示octs-pdl1bcmas-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖h表示octs-pdl1bcmas-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖i表示octs123bcmat-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖j表示octs123bcmat-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖k表示octs319bcmat-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖l表示octs319bcmat-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖m表示octs38bcmat-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖n表示octs38bcmat-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖o表示octs-pdl1bcmat-car-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖p表示octs-pdl1bcmat-car-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果。圖10為不同效靶標(biāo)條件下，octs-car-t細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷效率柱狀圖：圖a表示octs123bcmas-car-t細(xì)胞和octs123bcmat-car-t細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷結(jié)果；圖b表示octs319bcmas-car-t細(xì)胞和octs319bcmat-car-t細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷結(jié)果；圖c表示octs38bcmas-car-t細(xì)胞和octs38bcmat-car-t細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷結(jié)果；圖d表示octs-pdl1bcmas-car-t細(xì)胞和octs-pdl1bcmat-car-t細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷結(jié)果。具體實施方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用與限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例以bcma單鏈抗體分別與cd319、cd38、pdl1、cd123單鏈抗體組合成雙抗原識別區(qū)為例，對car雙靶向嵌合抗原受體的構(gòu)建、octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建以及功能測試方法進(jìn)行說明。在每種組合中，兩段scfv分別以串聯(lián)連接和轉(zhuǎn)角連接的方式連接，共形成了八種雙抗原識別區(qū)。其他四種物質(zhì)的單鏈抗體的輕鏈和重鏈也能組合成雙抗原識別區(qū)，其car雙靶向嵌合抗原受體的構(gòu)建、octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建以及功能測試方法與本實施例中所描述的方法相同。實施例所用的實驗材料如下：(1)慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic，慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g，hek293t/17細(xì)胞，同源重組酶，oligoannealingbuffer，支原體檢測試劑盒，內(nèi)毒素檢測試劑盒，psca+k562、pdl1+k562、pdl1+psca+k562、k562細(xì)胞購自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司；；(2)人新鮮外周血由健康供者提供；(3)octs123bcmas、octs319bcmas、octs38bcmas、octs-pdl1bcmas、octs123bcmat、octs319bcmat、octs38bcmat、octs-pdl1bcmatdna序列組合自行設(shè)計(參見表1)，交給上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒形式保存；表1慢病毒重組質(zhì)粒設(shè)計(4)工具酶clai、psti、bsrgi、ndei、ecori、bamhi、apali、spei、t4dna連接酶均購自neb公司；(5)0.22μm-0.8μmpes濾器購自millipore公司；d-pbs(-)、0.4％臺盼藍(lán)、篩網(wǎng)、各類型細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)板均購自corning公司；(6)opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000購自invitrogen公司；biotinylatedproteinl購自genescript公司；ldh檢測試劑盒購自promega公司；ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自ge公司；20％人血白蛋白注射液購自杰特貝林公司；cryopremium凍存液、分選緩沖液自行配置；ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21購自peprotech公司；cd3單克隆抗體，cd28單克隆抗體，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠購自德國miltenyi公司；(7)冷凍離心機(jī)購自美國thermoscientific公司；facs流式細(xì)胞儀購自thermo公司；熒光倒置顯微鏡購自olympus公司。(8)cd4-fitc、cd8-apc購自biolegend公司；0.9％生理鹽水購自今邁公司；proteinlmagneticbeads購自biovision公司；primestar、retronectin購自takara公司；phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin購自bdbioscience公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自mn公司；感受態(tài)細(xì)胞top10購自tiangen公司；nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均購自上海生工。(9)dneasy試劑盒購自上海捷瑞公司；sa-hrp購自上海翊圣公司；(10)引物：根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計擴(kuò)增dna片段和靶位點所需的引物，該引物由上海生物公司合成，具體為：ef1α-f：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(seqidno.34)ef1α-r：5’-tcacgacacctgaaatggaaga-3’(seqidno.35)octs-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.36)octs-r：ggggagggagaggggcttagcgcggcggcagcg(seqidno.37)ires-f：gcccctctccctccccc(seqidno.38)ires-r：attatcatcgtgtttttcaaaggaa(seqidno.39)pdl1scab-f：aaaacacgatgataatgccaccatgaactccttctccacaagcg(seqidno.40)pdl1scab-r：aatccagaggttgattgtcgacgaattctcatttgcccgggctcag(seqidno.41)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.42)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.43)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.44)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.45)。實施例一octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建一、重組慢病毒載體lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat的構(gòu)建、純化、檢測如圖3所示，本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：1、將人ef1α啟動子、基于octs的car雙靶向嵌合抗原受體(octs123bcmas、octs319bcmas、octs38bcmas、octs-pdl1bcmas、octs123bcmat、octs319bcmat、octs38bcmat、octs-pdl1bcmat)、pdl1單鏈抗體克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic，分別得到重組慢病毒質(zhì)粒pocts123bcmas、pocts319bcmas、pocts38bcmas、pocts-pdl1bcmas、pocts123bcmat、pocts319bcmat、pocts38bcmat、pocts-pdl1bcmat。(1)將慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)5823bp的片段v1，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；表2瓊脂糖凝膠回收步驟步驟具體操作溶膠按200μlnti/100mggel比例加入溶膠液，50℃水浴放置5-10分鐘。結(jié)合dna11000g離心30秒，棄去濾液。洗膜加入700μlnt3，11000g離心30秒，棄去濾液。洗膜重復(fù)第三步一次晾干11000g離心1分鐘，換新的收集管，室溫放置1分鐘。洗脫dna加入15-30μlne，室溫放置1分鐘，11000g離心1分鐘，收集濾液。(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的seqidno.14為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1208bp的片段a，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度。表350μlpcr反應(yīng)體系試劑體積(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5(3)用引物octs-f和octs-r以合成的octs123bcmas為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2357bp的片段b，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(4)用引物octs-f和octs-r以合成的octs319bcmas為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2375bp的片段c，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(5)用引物octs-f和octs-r以合成的octs38bcmas為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2378bp的片段d，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(6)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pdl1bcmas為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2372bp的片段e，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(7)用引物octs-f和octs-r以合成的octs123bcmat為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2387bp的片段f，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(8)用引物octs-f和octs-r以合成的octs319bcmat為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2403bp的片段g，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(9)用引物octs-f和octs-r以合成的octs38bcmat為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2406bp的片段h，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(10)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pdl1bcmat為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)2433bp的片段i，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(11)用引物ires-f和ires-r以合成的seqidno.12為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)575bp的片段j，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(12)用引物pdl1scab-f和pdl1scab-r以合成的seqidno.33為模板，使用表3中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)1557bp的片段k，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表2)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(16)將重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合(見表4)以5μl總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入eppendorf管內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μl，混勻后在42℃孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μltop10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于amplb瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時。表4重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合重組慢病毒質(zhì)粒片段組合pocts123bcmasa、b、j、kpocts319bcmasa、c、j、kpocts38bcmasa、d、j、kpocts-pdl1bcmasa、e、j、kpocts123bcmata、f、j、kpocts319bcmata、g、j、kpocts38bcmata、h、j、kpocts-pdl1bcmata、i、j、k挑取克隆進(jìn)行菌落pcr鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pocts123bcmas、pocts319bcmas、pocts38bcmas、pocts-pdl1bcmas、pocts123bcmat、pocts319bcmat、pocts38bcmat、pocts-pdl1bcmat，對正確的克隆進(jìn)行酶切鑒定(見圖5)，并送測序復(fù)核結(jié)果。如圖5所示，a圖代表pocts123bcmas的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts123bcmas的bamhi酶切預(yù)測，條帶從上到下依次為：9712bp、1277bp、1023bp、511bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts123bcmas的bamhi酶切電泳結(jié)果。b圖代表pocts319bcmas的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts319bcmas的apali酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：6543bp、1961bp、1723bp、1234bp、488bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts319bcmas的apali酶切電泳結(jié)果。c圖代表pocts38bcmas的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts38bcmas的bsrgi酶切預(yù)測，條帶從上到下依次為：10928bp、1087bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts38bcmas的bsrgi酶切電泳結(jié)果。d圖代表pocts-pdl1bcmas的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts-pdl1bcmas的clai酶切預(yù)測，條帶從上到下依次為：8876bp、3139bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts-pdl1bcmas的clai酶切電泳結(jié)果。e圖代表pocts123bcmat的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts123bcmat的bamhi酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：9545bp、1467bp、977bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts123bcmat的bamhi酶切電泳結(jié)果。f圖代表pocts319bcmat的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts319bcmat的ndei酶切預(yù)測，條帶從上到下依次為：9686bp、2342bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts319bcmat的ndei酶切電泳結(jié)果。g圖代表pocts38bcmat的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts38bcmat的spei酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：9976bp、1926bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts38bcmat的spei酶切電泳結(jié)果。h圖代表pocts-pdl1bcmat的酶切預(yù)測圖和酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。lane1是1kbdnaladdermarker的酶切預(yù)測圖，條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pocts-pdl1bcmat的psti酶切預(yù)測，條帶從上到下依次為：10821bp、1340bp、411bp；lane3是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；lane4是pocts-pdl1bcmat的psti酶切電泳結(jié)果。由圖5所顯示的電泳結(jié)果可知，各待測重組慢病毒質(zhì)粒的酶切電泳結(jié)果和酶切預(yù)測結(jié)果基本一致，上述重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建方法有效。2、重組慢病毒載體lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat的包裝2.1溶液配置(1)完全培養(yǎng)基：取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下顛倒混勻即可；(2)1xpbs溶液：稱量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml燒杯中，加入900mlmilli-qgrade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫濕熱滅菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:稱量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml燒杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm過濾除菌，長期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：稱量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超純水溶解；用milli-qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：稱量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超純水溶解；校準(zhǔn)ph儀后，用2mnaoh溶液將hbs溶液的ph調(diào)到7.05。調(diào)整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh為3ml左右。2.2hek293t/17細(xì)胞培養(yǎng)(1)從液氮罐中取出凍存的hek293t/17細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，1～2min后轉(zhuǎn)移到超凈臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合的程度大于80％進(jìn)行傳代；(2)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染的hek293t/17細(xì)胞，每2-6個培養(yǎng)皿為一組，將細(xì)胞胰酶消化后，用電動移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免培養(yǎng)皿變干；使用1ml移液器將所有細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；(3)將上述2-6個培養(yǎng)皿中的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再沖洗一便培養(yǎng)皿；(4)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細(xì)胞懸液，將細(xì)胞傳到8-24個10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)約4×106個/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細(xì)胞密度和預(yù)期的相差較大，則需要對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后按照4×106個/皿的量接種；(5)每6個培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后晃動數(shù)次，使細(xì)胞充分鋪開，然后放入5％co2培養(yǎng)箱。剩余細(xì)胞做同樣處理；(6)檢查所傳代細(xì)胞，細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻分布；(7)為細(xì)胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基,每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值提高到8％；2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一個新的5ml離心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，補(bǔ)充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(2)另取一支5ml離心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動，另一只手拿一把1ml移液槍，吸取0.5ml2×hbs溶液，緩慢滴加進(jìn)入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×hbs加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；(3)取一皿細(xì)胞，將離心管中的1ml鈣轉(zhuǎn)液滴加進(jìn)去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整個培養(yǎng)皿中；(4)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個5％co2培養(yǎng)箱中。確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個。在5％co2培養(yǎng)箱中放置(6–8h)；(5)將第一個培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值調(diào)回到5％；(6)24小時后，檢查細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80–85％左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng)基吸走，更換10ml新鮮的dmem完全培養(yǎng)基；(7)48小時后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細(xì)胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95％細(xì)胞都會帶有綠色熒光。將同一個病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10ml新鮮培養(yǎng)基；(8)72小時后，再次將同一個病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養(yǎng)皿；此時收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat。3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體(1)將收集的上清液使用thermo真空泵，經(jīng)0.22μm-0.8μm的pes濾器抽濾，除去雜質(zhì)；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)將2個離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根據(jù)上樣量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進(jìn)行長期保存。4、重組慢病毒載體滴度測定(1)取24孔板接種293t細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個，所加培養(yǎng)基體積為500ul,不同種類的細(xì)胞生長速度有所差異，進(jìn)行病毒感染時的細(xì)胞融合率為40％-60％；(2)準(zhǔn)備3個無菌ep管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)接種細(xì)胞24小時后，取兩個孔的細(xì)胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細(xì)胞的實際數(shù)目，記為n；(3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500ul；(4)感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48小時；(5)72小時后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少，并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照dneasy試劑盒的說明抽提基因組dna。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna并定量；(7)準(zhǔn)備目的dna檢測qpcrmix總管ⅰ(qpcr引物序列為seqidno.42---seqidno.43)：表5qpcrmix總管ⅰ內(nèi)組分2×taqmanmastermix25μl×nforwardprimer(100pmolml-1)0.1μl×nreverseprimer(100pmolml-1)0.1μl×nprobe(100pmolml-1)0.1μl×nh2o19.7μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和，震蕩后放在冰上。(8)準(zhǔn)備內(nèi)參dna檢測qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列為seqidno.44---seqidno.45)：表6qpcrmix總管ⅱ內(nèi)組分2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和，震蕩后放在冰上。(9)在預(yù)冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna加入到a-d行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna加入到e-g行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr儀為abiprism7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環(huán)。(13)數(shù)據(jù)分析：測得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)n＝感染時細(xì)胞的數(shù)目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)重組慢病毒載體lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat的滴度結(jié)果如圖6所示。二、octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建圖7顯示了octs-car-t細(xì)胞構(gòu)建流程，本實施例中的octs-car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法如下：1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細(xì)胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補(bǔ)至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細(xì)胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細(xì)胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補(bǔ)加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細(xì)胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細(xì)胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細(xì)胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細(xì)胞分選。(1)將獲得的pbmc計數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細(xì)胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時準(zhǔn)備2個15ml離心管，分別標(biāo)記：cd4-/cd8-細(xì)胞液(a管)、cd4+/cd8+細(xì)胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細(xì)胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細(xì)胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細(xì)胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細(xì)胞，取樣計數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細(xì)胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細(xì)胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被；(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細(xì)胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及octs-car-t細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細(xì)胞量，按moi＝5～20的量，分別加入lvocts123bcmas、lvocts319bcmas、lvocts38bcmas、lvocts-pdl1bcmas、lvocts123bcmat、lvocts319bcmat、lvocts38bcmat、lvocts-pdl1bcmat慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，同時添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、octs-car-t細(xì)胞體外擴(kuò)增。(1)每2天等量補(bǔ)加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細(xì)胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，凍存培養(yǎng)的octs-car-t細(xì)胞用于后續(xù)檢測。實施例2octs-car-t細(xì)胞病原檢測和表達(dá)檢測一、內(nèi)毒素檢測；(1)內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為15eu/支；(2)鱟試劑靈敏度λ＝0.25eu/ml,0.5ml/管(3)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支，分別用bet水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s；(4)加樣：取鱟試劑若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對照管，加入bet水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液(稀釋20倍的待測樣品1ml+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml＝2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表7，37±1℃水浴(或培養(yǎng)箱)保溫60±1min；表7內(nèi)毒素稀釋比例及octs-car-t細(xì)胞的內(nèi)毒素檢測結(jié)果如表7所示，所有細(xì)胞的內(nèi)毒素含量均小于2.5eu/ml，符合《中華人民共和國藥典》中小于10eu/ml的標(biāo)準(zhǔn)。二、支原體檢測(1)在實驗前三日，細(xì)胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)收集1ml細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞數(shù)大于1×105)，置于1.5ml離心管中；(3)13000g離心1min，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；(4)加入500ulpbs用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000g離心5min；(5)步驟4重復(fù)一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用槍頭吹吸，充分混勻后,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置于95℃中加熱5min；(8)13000g離心5min后，取5μl上清作為模板，25μlpcr反應(yīng)體系為：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循環(huán)條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。支原體檢測結(jié)果顯示請見圖8，圖8中的陽性對照、陰性對照以及樣品的判定說明見表8。如圖8結(jié)果所示，octs-car-t細(xì)胞中均不含支原體。表8陽性對照、陰性對照以及樣品的判定說明三、octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測及免疫分型檢測；(1)收集經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細(xì)胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞并調(diào)整為1×106/ml。(2)向離心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混勻，350g離心5min，棄上清。(3)重復(fù)步驟2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混勻，4℃孵育45min。(5)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混勻，350g離心5min，棄上清。(6)重復(fù)步驟5兩次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入0.2ulpe-sa，混勻，37℃避光孵育15min。(8)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混勻，350g離心5min，棄上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，350g離心5min，棄上清。(10)重復(fù)步驟9兩次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及免疫分型檢測檢測結(jié)果如圖9所示，制備的octs-car-t細(xì)胞的感染效率大多數(shù)位于37％～50％之間，cd4陽性細(xì)胞和cd8陽性細(xì)胞的比例位于1∶3～3∶1之間，可以進(jìn)行后續(xù)功能檢測。實施例3octs-car-t細(xì)胞的功能檢測一、靶細(xì)胞殺傷效果評估。(1)分別培養(yǎng)靶細(xì)胞[bcma+k562、cd319+k562、cd38+k562、pdl1+k562、cd123+k562、bcma+cd123+k562、bcma+cd319+k562、bcma+cd38+k562、bcma+pdl1+k562、k562細(xì)胞]和效應(yīng)細(xì)胞[octs-car-t細(xì)胞]，效應(yīng)細(xì)胞分別與單靶細(xì)胞和雙靶細(xì)胞共孵育的分組如表9所示。表9效應(yīng)細(xì)胞分別與單靶細(xì)胞和雙靶細(xì)胞共孵育的分組列表效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞1靶細(xì)胞2靶細(xì)胞3octs123bcmas-car-tcd123+k562bcma+k562bcma+cd123+k562octs319bcmas-car-tcd319+k562bcma+k562bmca+cd319+k562octs38bcmas-car-tcd38+k562bcma+k562bcma+cd38+k562octs-pdllbcmas-car-tpdl1+k562bcma+k562bcma+pdl1+k562octs123bcmat-car-tcd123+k562bcma+k562bcma+cd123+k562octs319bcmat-car-tcd319+k562bcma+k562bmca+cd319+k562octs38bcmat-car-tcd38+k562bcma+k562bcma+cd38+k562octs-pdl1bcmat-car-tpdl1+k562bcma+k562bcma+pdl1+k562(2)收集靶細(xì)胞4x105cells和octs-car-t細(xì)胞2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；(4)重復(fù)步驟3一次；(5)用700ul培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸靶細(xì)胞；(6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實驗孔，分組情況如表9所示，并設(shè)置對照組(k562細(xì)胞)，每組3個復(fù)孔；(7)250g，5min平板離心；(8)37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時；(9)250g，5min平板離心；(10)取每個孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul終止液；(13)酶標(biāo)儀檢測490nm吸光度；(14)將3個復(fù)孔取平均值；將所有實驗孔、靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；將靶細(xì)胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。(15)將步驟14中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計算每個效靶比所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比。殺傷效率＝(實驗孔-效應(yīng)細(xì)胞孔-靶細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞最大孔-靶細(xì)胞孔)×100％結(jié)果如圖10所示，octs-car-t對各自的單靶細(xì)胞和雙靶細(xì)胞均有較好的殺傷效果，turnocts結(jié)構(gòu)的car-t細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率略高于seriesocts結(jié)構(gòu)的car-t細(xì)胞。上述實驗結(jié)果表明，通過對傳統(tǒng)car結(jié)構(gòu)中抗原識別區(qū)的改造形成的octs結(jié)構(gòu)，能夠顯著提高octs-car-t細(xì)胞識別并殺傷靶細(xì)胞的范圍，因此octs-car-t細(xì)胞將在未來的bcma陽性/cd319陽性/cd38陽性/cd123陽性/pdl1陽性/bcma、cd319雙陽性/bcma、cd38雙陽性/bcma、cd123雙陽性/bcma、pdl1雙陽性的多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤的細(xì)胞治療中發(fā)揮巨大的作用。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。sequencelisting<110>上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司<120>octs-car雙靶向嵌合抗原受體、編碼基因、重組表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用<130>權(quán)利要求書說明書<160>45<170>patentinversion3.5<210>1<211>837<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttac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