本發(fā)明涉及生物材料應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚是人體最重要的天然屏障，可以保護體內(nèi)臟器，防止致病微生物的入侵及體液丟失等。創(chuàng)傷、燒傷、糖尿病潰瘍等原因造成的皮膚創(chuàng)面，在愈合過程中極易受到致病微生物的侵襲而引起創(chuàng)面感染、化膿，導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合甚至不愈合。因此，一種理想的人工皮膚應(yīng)當具備良好的抗菌性能，一方面能夠持續(xù)保護創(chuàng)面不受外界致病微生物的侵襲，另一方面也能殺滅已經(jīng)定植于創(chuàng)面的細菌防止感染進一步播散，最終促進創(chuàng)面愈合，恢復(fù)皮膚的完整功能。

臨床常用的抗菌制劑為抗生素，但是近年來由于抗生素的濫用，導(dǎo)致細菌耐藥問題不斷加劇，并由此催生了多種多重耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，鮑曼不動桿菌，銅綠假單胞菌等，嚴重威脅人類健康。所以，尋找能夠替代抗生素的抗菌制劑十分必要。研究證實，納米銀不易受體內(nèi)外因素的影響，可以很好地避免抗生素耐藥問題。納米銀主要通過破壞細菌胞膜、dna以及干擾細菌呼吸鏈酶的活性來殺滅細菌。它的粒徑小，比表面積大，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，均具有良好的殺菌作用；同時，納米銀還具有抗炎止痛、促進創(chuàng)面愈合的作用。

聚偏氟乙烯具有優(yōu)良的機械性能、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。同時無毒、無害、無致畸作用，具有良好的生物相容性。聚偏氟乙烯價格低廉，且容易批量加工生產(chǎn)。因此，它是一種優(yōu)良的構(gòu)建人工皮膚的支架材料。

目前，用于制備納米銀的化學(xué)還原法操作復(fù)雜，耗時耗力。此外，如何將納米銀有效地與聚偏氟乙烯復(fù)合來制備抗菌薄膜也面臨一定挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法及應(yīng)用，其操作簡單易行，制得的薄膜厚度可控，生物相容性好，抗菌效果佳。

本發(fā)明所述的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為40-80℃和攪拌速度為1000-1500rpm的條件下磁力攪拌10-60min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為0.1~1wt%，聚偏氟乙烯的濃度為5~20wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為25—60℃和轉(zhuǎn)速為50—150rpm的條件下反應(yīng)12—72h，再在溫度為30—50℃的條件下靜置脫泡1—6h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為100—1000μm，再將含有厚度為100—1000μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置10—60min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為30—50℃的條件下干燥8—16h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

進一步，所述步驟1）中混懸液中硝酸銀的濃度為0.425wt%，聚偏氟乙烯的濃度為10wt%。

進一步，所述步驟1）中在溫度為60℃和攪拌速度1200rpm的條件下磁力攪拌30min。

進一步，所述步驟2）中在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為100rpm的條件下恒溫反應(yīng)24h，在溫度為40℃的條件下靜置脫泡1h。

進一步，所述步驟3）中模具的材質(zhì)為玻璃、聚四氟乙烯或聚酯。

進一步，所述步驟3）中控制鑄膜液的厚度為500μm，再將含有厚度為500μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置30min，得到固化薄膜。

進一步，所述步驟5）中在溫度為40℃的條件下干燥12h。

一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜在制備用于治療人的皮膚缺損的人工皮膚或外科敷料中的用途。

進一步，所述皮膚缺損是皮膚全層缺損或皮膚感染創(chuàng)面。

對本發(fā)明的聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜進行以下性能測試。

1.掃描電鏡觀察。

參見圖1，采用掃描電子顯微鏡在不同倍數(shù)下觀察制得的聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的表面結(jié)構(gòu)。使用image-proplus6.0軟件，計算出聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜表面孔洞的孔徑為0.5—1.5μm。

2.透射電鏡觀察。

參見圖2，采用透射電子顯微鏡觀察制得的聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜中納米銀的形態(tài)及大小。觀察可知，納米銀在聚偏氟乙烯中無團聚現(xiàn)象，分散均勻；通過imagej軟件測量納米銀顆粒的直徑為1—5nm。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明采用n，n-二甲基甲酰胺作為溶解劑和還原劑，將硝酸銀和聚偏氟乙烯分散溶解于n，n-二甲基甲酰胺中，在攪拌速度為1000-1500rpm的條件下磁力攪拌，能夠在聚偏氟乙烯中原位生成納米銀，納米銀顆粒直徑為1—5nm；通過劇烈的磁力攪拌，無需添加致孔劑進行超聲分散，即可實現(xiàn)納米銀在聚偏氟乙烯中的分散，無團聚現(xiàn)象，將納米銀的制備和納米銀與聚偏氟乙烯的復(fù)合一步完成。

2、本發(fā)明通過浸沒沉淀相轉(zhuǎn)化法制備多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，通過n，n-二甲基甲酰胺與去離子水的相互作用，瞬時進行液液分相，最終得到特征性的含有空隙的包腔狀結(jié)構(gòu)，制備出孔徑為0.5—1.5μm的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，若孔徑過大則會降低薄膜的韌性，并且易受細菌的侵襲，若孔徑過小則會降低薄膜的透氣性，影響其在人工皮膚中或外科敷料中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的制備過程中無廢氣、廢液產(chǎn)生，對環(huán)境友好，且操作簡單易行，成本低。

4、通過浸沒沉淀相轉(zhuǎn)化法所制備的聚合物膜通常具有多種結(jié)構(gòu)，聚合物的選擇、聚合物的濃度、溶劑/非溶劑體系的選擇、鑄膜液的組成和凝膠浴的組成對膜的結(jié)構(gòu)和性能影響較大，本發(fā)明結(jié)合特定的原料配比和制備工藝，制備出孔徑為0.5—1.5μm的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，其厚度可控，生物相容性好，抗菌效果佳，能夠用于臨床耐藥菌感染創(chuàng)面的治療。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制備的聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜不同倍數(shù)下的掃描電子顯微鏡照片；

圖2是本發(fā)明制備的聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的透射電子顯微鏡照片；

圖3是制備的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的細胞活性對比柱狀圖；

圖4是制備的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的抗菌性能檢測實驗的吸光度對比柱狀圖；

圖5是制備的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的動物實驗的創(chuàng)面愈合率對比柱狀圖；

圖6是制備的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的動物實驗的創(chuàng)面愈合時間對比柱狀圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作詳細說明。

實施例一：一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為60℃和攪拌速度為1200rpm的條件下磁力攪拌30min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為0.425wt%，聚偏氟乙烯的濃度為10wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為100rpm的條件下反應(yīng)24h，再在溫度為40℃的條件下靜置脫泡1h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為500μm，再將含有厚度為500μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置30min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為40℃的條件下干燥12h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

實施例二：一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為40℃和攪拌速度為1000rpm的條件下磁力攪拌10min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為0.1wt%，聚偏氟乙烯的濃度為5wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為25℃和轉(zhuǎn)速為50rpm下恒溫反應(yīng)12h，在溫度為30℃的條件下靜置脫泡1h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為100μm，再將含有厚度為100μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置10min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為30℃的條件下干燥8h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

實施例三：一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為80℃和攪拌速度為1500rpm的條件下磁力攪拌60min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為1wt%，聚偏氟乙烯的濃度為20wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為30℃和轉(zhuǎn)速為150rpm下恒溫反應(yīng)72h，再在溫度為50℃的條件下靜置脫泡6h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為1000μm，再將含有厚度為1000μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置60min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為50℃的條件下干燥16h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

實施例四：一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為50℃和攪拌速度為1100rpm的條件下磁力攪拌20min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為0.2wt%，聚偏氟乙烯的濃度為7wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為45℃和轉(zhuǎn)速為70rpm下恒溫反應(yīng)48h，再在溫度為35℃的條件下靜置脫泡2h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為300μm，再將含有厚度為300μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置40min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為35℃的條件下干燥10h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

實施例五：一種多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的制備方法，包括如下步驟：

1）制備混懸液：將硝酸銀分散溶解在n，n-二甲基甲酰胺中，再加入聚偏氟乙烯，在溫度為70℃和攪拌速度為1400rpm的條件下磁力攪拌40min，得到混懸液，所述混懸液中硝酸銀的濃度為0.7wt%，聚偏氟乙烯的濃度為15wt%；

2）制備鑄膜液：將步驟1）得到的混懸液置于搖床中，在溫度為50℃和轉(zhuǎn)速為120rpm下恒溫反應(yīng)36h，再在溫度為45℃的條件下靜置脫泡4h，得到鑄膜液；

3）成膜：將步驟2）得到的鑄膜液倒入模具中，控制鑄膜液的厚度為700μm，再將含有厚度為700μm的鑄膜液的模具置于去離子水中靜置50min，得到固化薄膜；

4）清洗：將步驟3）得到的固化薄膜先后用乙醇和去離子水清洗；

5）干燥：將步驟4）清洗后的固化薄膜置于真空烘箱中，在溫度為45℃的條件下干燥14h，得到多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，所述薄膜的孔徑為0.5—2.5μm。

實施例六：為檢驗制備的用于人工皮膚的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜的細胞活性，進行如下實驗。

1）將由實施例一制得的樣本裁剪成1×1cm大小的薄膜片，浸泡于75%乙醇溶液中消毒30min，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗3次；

2）將步驟1）處理后的薄膜片加入1ml含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，在溫度為37℃的條件下浸提24h，制得浸提液；

3）取對數(shù)生長期人表皮細胞系hacat細胞，以密度為3000個/孔接種至96孔板培養(yǎng)，24小時細胞貼壁生長后去除原培養(yǎng)基；

4）實驗分組：

實驗組：向步驟3）培養(yǎng)的hacat細胞按100μl/孔加入步驟2）制得的浸提液；

對照組：向步驟3）培養(yǎng)的hacat細胞加入等量的含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基；實驗組和對照組均復(fù)種4孔；

空白組：不含細胞，只加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基；

5）培養(yǎng)三天，每天均進行細胞增殖檢測實驗，棄去原有的浸提液或培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液分別對實驗組及對照組的細胞洗滌兩次，然后每孔加入100μl新的培養(yǎng)基和10μlcck8試劑，所述cck8試劑購自上海碧云天公司，在溫度為37℃的條件下孵育2h后，用酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光度，計算實驗組的細胞活性，計算公式為：（實驗組吸光度—空白組吸光度）/（對照組吸光度—空白組吸光度）×100%，根據(jù)計算結(jié)果繪制柱狀圖。

結(jié)果：參見圖3，在接種后的第一天、第二天和第三天，實驗組的細胞活性均在95%以上，與對照組的細胞活性相比無明顯差異，提示制備的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜無明顯細胞毒性，安全性較高。

實施例七：為檢驗制備的用于人工皮膚的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜對耐藥菌的抗菌活性，進行如下實驗：

1）實驗分組：實驗組：實施例一制得的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜，對照組：濃度為1mg/ml的鏈霉素，濃度為10μm的四環(huán)素，濃度為10μm的頭孢他啶，空白組：不加入任何試劑。

2）將由實施例一制得的樣本裁剪成1×1cm大小的薄膜片，浸泡于75%乙醇溶液中消毒30min，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗3次；

3）取對數(shù)生長期多重耐藥鮑曼不動桿菌，所述多重耐藥鮑曼不動桿菌由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷科微生物室提供，用lb培養(yǎng)基稀釋至酶標儀在600nm波長處檢測吸光度為0.07的菌液，將稀釋后的菌液按500μl/孔加入24孔板中；

4）分別向24孔板的每孔菌液中加入步驟2）制得的薄膜片、濃度為1mg/ml的鏈霉素、濃度為10μm的四環(huán)素和濃度為10μm的頭孢他啶，再將24孔板置于溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為50rpm的搖床中反應(yīng)24h；

5）收取24孔板，每孔吸取100μl菌液至96孔板中，用酶標儀在600nm波長處檢測吸光度值并記錄，繪制柱狀圖。

結(jié)果：參見圖4，實驗組較空白組及對照組的吸光度值明顯偏低，提示其能顯著抑制鮑曼不動桿菌的生長，且效果明顯好于抗生素，故多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜能夠有效抑制耐藥菌的生長，具有良好的抗菌效果。

實施例八：為檢驗制備的用于人工皮膚的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜對體內(nèi)細菌感染的抑制及對創(chuàng)面愈合的影響，進行如下實驗：

1)balb/c小鼠(購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)全層皮膚缺損創(chuàng)面模型的制備：小鼠予以1%戊巴比妥鈉腹腔注射(100mg/kg，0.01ml/g)麻醉后，固定于俯臥位并予以背部術(shù)區(qū)備皮。而后用75%乙醇棉球消毒術(shù)區(qū)，用打孔器于背部兩側(cè)各造一直徑為6mm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，立即對創(chuàng)面進行拍照記錄，該創(chuàng)面面積作為初始創(chuàng)面面積。

2)樣本涂菌準備：將由實施例一制得的多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜及凡士林紗布裁剪成0.8×0.8cm大小，正反兩面均用紫外線滅菌30min，取10μl稀釋為0.5個標準麥氏單位的鮑曼不動桿菌菌液，涂布于樣本表面，自然風(fēng)干10min后備用。

3)實驗組：將多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜涂菌面覆蓋創(chuàng)面，并用負壓吸引膜固定；對照組：將凡士林紗布涂菌面覆蓋于創(chuàng)面，并用負壓吸引膜固定；空白組：只用負壓吸引膜貼附創(chuàng)面。取30只小鼠，隨機分配10只小鼠到每組進行實驗。

4)術(shù)后于第3天、第7天從三組中分別取5只小鼠打開創(chuàng)面拍照記錄，觀察創(chuàng)面愈合情況。小鼠于第7天后采用斷頸法處死。剩余的15只小鼠(每組各剩余5只)在第八天去除固定的負壓吸引膜，每日觀察創(chuàng)面，待創(chuàng)面已完全上皮化即為創(chuàng)面完全愈合，記錄創(chuàng)面完全愈合所需時間。

5）利用imageproplus6.0軟件對第3天和第7天各組創(chuàng)面照片進行分析，測量剩余創(chuàng)面面積，即創(chuàng)緣所包圍的面積，并按下式計算創(chuàng)面愈合率：

創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-剩余創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%；

6）采用單因素方差分析法分別對第3天和第7天三組創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面完全愈合所需時間進行統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié)果：多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜覆蓋創(chuàng)面在第3天和第7天均未見紅腫及膿液滲出，與空白組一致，而凡士林紗布組創(chuàng)面可見大量膿液滲出，創(chuàng)緣紅腫。參見圖5，各時間點創(chuàng)面愈合率的比較結(jié)果顯示多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜較凡士林紗布組均明顯較高，與無細菌感染的空白組無顯著性差異，提示多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜可以有效防止耐藥鮑曼不動桿菌的侵襲感染，維持創(chuàng)面正常的愈合微環(huán)境。參見圖6，創(chuàng)面愈合時間的比較結(jié)果顯示：多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜組較凡士林紗布組愈合時間明顯縮短，提示多孔聚偏氟乙烯復(fù)合納米銀薄膜能防止細菌感染對創(chuàng)面愈合的不良影響。

以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于上述實施例，還可以有許多的操作組合。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有情形，均應(yīng)當認為是本發(fā)明的保護范圍。