本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種gephyromycin類(lèi)化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其在中國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)的死亡人數(shù)中列第二位，僅次于心腦血管疾病。因此尋找到新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)今世界的一大難題。從天然資源中尋找新的抗腫瘤藥物成為研究的趨勢(shì)，其中微生物由于特殊的生存環(huán)境，有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此從微生物中尋找活性成分來(lái)預(yù)防和治療腫瘤，越來(lái)越引起人們的重視。放線(xiàn)菌作為一類(lèi)重要的微生物，以產(chǎn)生種類(lèi)繁多的生物活性物質(zhì)而廣泛受到重視。目前，放線(xiàn)菌仍是抗生素的主要微生物來(lái)源，臨床使用的抗生素有70％是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、多氧霉素、金霉素、卡那霉素、氯霉素和慶大霉素等用于臨床治療人的多種疾病。隨著病原微生物對(duì)抗生素抗性的提高，尋找具有新型作用機(jī)制的抗生素顯得十分必要。放線(xiàn)菌是因菌絲呈放射狀而得名，自從1877年cohn從牛的頸腫病中發(fā)現(xiàn)放線(xiàn)菌以后，直到本世紀(jì)40年代初期，放線(xiàn)菌還是未被人們所熟知的一類(lèi)微不足道的微生物，當(dāng)時(shí)僅報(bào)道了含義不很明確的四五個(gè)屬，比較知名的是對(duì)人和動(dòng)物有致病性的放線(xiàn)菌屬(actinomycetes)、諾卡氏菌屬(nocardia)和被認(rèn)為是細(xì)菌的分枝桿菌(mycobacterium)。隨著認(rèn)識(shí)的深入，到60年代放線(xiàn)菌被確認(rèn)是原核生物，與細(xì)菌的關(guān)系極為密切，甚至可以包括在廣義的細(xì)菌中。目前，在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第四卷中，放線(xiàn)菌屬于原核生物界，厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌綱、放線(xiàn)菌目(actinomycetales)。放線(xiàn)菌目及其相關(guān)的微生物是革蘭氏陽(yáng)性菌中形態(tài)發(fā)生最為多樣化的組群。放線(xiàn)菌是一類(lèi)高(g+c)mol％的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬(wàn)種微生物來(lái)源的生物活性物質(zhì)中，約有70％是由放線(xiàn)菌所合成的。鏈霉菌屬，是放線(xiàn)菌中最大的一個(gè)屬，因它們能產(chǎn)生豐富的且具有一定生物活性作用的次級(jí)代謝物而受到廣泛關(guān)注。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明通過(guò)對(duì)放線(xiàn)菌進(jìn)行研究提供了一種gephyromycin類(lèi)化合物及其制備方法和應(yīng)用。一種化合物，結(jié)構(gòu)式如式i：本發(fā)明又提供了所述的化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。所述癌癥為前列腺癌。本發(fā)明還提供了所述化合物的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：(1)發(fā)酵培養(yǎng)放線(xiàn)菌獲得發(fā)酵產(chǎn)物；(2)發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾去除菌絲體獲得粗提物；(3)粗提物分離純化獲得所述化合物，其中，所述放線(xiàn)菌保藏號(hào)為ciccno.11030。鏈霉菌(streptomycessp.)，保藏號(hào)為ciccno.11030，購(gòu)買(mǎi)自位于北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓的中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)。所述的制備方法，發(fā)酵使用培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基，所述大米培養(yǎng)基按以下重量組分制成：大米40g，25％的海鹽水60ml。步驟(3)中分離純化的方法如下：(a)粗提物用乙酸乙酯萃取；(b)萃取液濃縮后，使用反向柱色譜純化，并用甲醇-水體系洗脫；(c)將包含目的化合物的洗脫產(chǎn)物合并后，使用反相高效液相色譜分離獲得所述化合物。步驟(a)中萃取方法為：用與粗提物等體積的乙酸乙酯萃取3次。步驟(b)中洗脫方法為使用體積比為10∶90～100∶0的甲醇-水體系梯度洗脫。步驟(c)中反相高效液相色譜分離使用的填料為十八烷基鍵合硅膠，流動(dòng)相為體積比為42∶58乙腈-水體系以10ml/min等度洗脫，收集21-24min的色譜峰。本發(fā)明化合物為從一種放線(xiàn)菌中分離純化得到，經(jīng)鑒定為一種gephyromycin類(lèi)化合物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞(pc3)具有較高的活性，其活性比順鉑還要高，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明具有抗腫瘤活性化合物的結(jié)構(gòu)式。圖2為本發(fā)明具有抗腫瘤活性化合物的結(jié)構(gòu)標(biāo)注圖，其中，箭頭表示碳-氫相關(guān)，加粗化學(xué)鍵表示氫-氫相關(guān)。圖3為本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的1hnmr圖譜。圖4為本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的13cnmr圖譜。圖5為本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的hsqc圖譜。圖6為本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的hmbc圖譜。圖7為本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的1h-1hcosy圖譜。具體實(shí)施方式菌種來(lái)源鏈霉菌(streptomycessp.)，保藏號(hào)為ciccno.11030，購(gòu)買(mǎi)自位于北京市朝陽(yáng)區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓的中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)。培養(yǎng)基高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基：以發(fā)酵培養(yǎng)基1l計(jì)，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，加水至1l，調(diào)ph7.2。高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：以發(fā)酵培養(yǎng)基1l計(jì)，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，12g瓊脂，加水至1l，調(diào)ph7.2。大米培養(yǎng)基：大米和海鹽水按以下質(zhì)量體積比：大米40g，25％的海鹽水60ml，即大米∶25％的海鹽水＝40g∶60ml。實(shí)施例11、活化從原保存斜面或甘油管取真菌適量，接種到平板培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中靜置，活化培養(yǎng)5天。2、種子液將己經(jīng)活化的上述鏈霉菌接種于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行鏈霉菌的培養(yǎng)，于室溫下倒置培養(yǎng)5-7天。接著挑取單菌落接種于含有250ml液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，每瓶含250ml高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基，在搖床中28℃下以180rpm振蕩培養(yǎng)5天，獲得種子液。3、發(fā)酵以每瓶接種8ml的量將上述種子液接種到300瓶大米發(fā)酵培養(yǎng)基(由以下重量組分制成：大米40g，25％的海鹽水60ml)中，28℃靜置培養(yǎng)30天后終止發(fā)酵。4、粗提每瓶固體發(fā)酵物用ea(乙酸乙酯)約200ml浸泡過(guò)夜，三層紗布過(guò)濾除去菌絲體，收集濾液，減壓濃縮得粗提物(油狀浸膏)共計(jì)40g(300瓶總共)。5、化合物分離將上述粗提物用等體積乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液濃縮。將所得乙酸乙酯部分進(jìn)行反相柱色譜純化，用體積比為10∶90至100∶0的甲醇-水體系梯度洗脫，使用薄層色譜分析含有新化合物的餾分，合并。所得餾分用反相高效液相色譜分離(agilentpursuitc-18(10μm，21.2×250mm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm)，采用的流動(dòng)相為體積比為42∶58乙腈-水體系以10ml/min等度洗脫，收集21-24min的色譜峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收溶劑，即得本發(fā)明化合物，外觀(guān)為無(wú)色塊狀晶體。實(shí)施例2將純化所得化合物進(jìn)行鑒定。本根據(jù)高分辨質(zhì)譜hr-esi-ms推測(cè)為c19h20o8([m+na]+399.1052)。紅外光譜吸收為：3389cm-1(羥基),1753cm-1，1635cm-1(羰基)。核磁共振數(shù)據(jù)及信號(hào)歸屬如表1所示(1hnmr400mhz，13cnmr100mhz，溶劑methanol-d4)。其標(biāo)注如圖2所示。表1本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的1hnmr(核磁共振氫譜)圖如圖3所示，本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的13cnmr(核磁共振碳譜)圖如圖4所示，本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的hsqc(異核單量子關(guān)系)圖譜如圖5所示，本發(fā)明具有抗腫瘤活性的化合物的hmbc(多鍵碳?xì)潢P(guān)系)圖譜如圖6所示，本發(fā)明具有抗菌活性的化合物的1h-1hcosy(氫-氫相關(guān)譜)圖譜如圖7所示，結(jié)合上述鑒定結(jié)果分析，該化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示，為gephyromycin的一種類(lèi)似物，命名為gephyromycinb。實(shí)施例3化合物的抗腫瘤活性檢測(cè)，使用mtt法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法如下：1、接種細(xì)胞：將人前列腺癌細(xì)胞(pc3)用含10％胎牛血清的培養(yǎng)液(dmem或者rmpi1640)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100μl，貼壁細(xì)胞提前12小時(shí)接種培養(yǎng)。2、加入式i化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑溶液(固定濃度40μm初篩，在該濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在50％附近的化合物設(shè)5個(gè)濃度進(jìn)入梯度復(fù)篩)，每孔終體積200μl，每種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。3、顯色：37攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加mtt溶液20μl。繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加200μl的sds溶液(10％)，過(guò)夜孵育(溫度37℃)，使結(jié)晶物充分融解。4、比色：選擇595m波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(bio-radimark)讀取各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，應(yīng)用兩點(diǎn)法(reedandmuench法)計(jì)算化合物的ic50值。結(jié)果如表2所示，gephyromycinb具有顯著的抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。表2化合物ic50(μm)順鉑17.0gephyromycinb13.32當(dāng)前第1頁(yè)12