本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種分子標(biāo)記檢測梅花花芽休眠狀態(tài)的方法。

背景技術(shù)：

休眠是一種有益的生物學(xué)特性，是高等植物經(jīng)過長期演化而獲得的一種對環(huán)境條件及季節(jié)性變化的生物學(xué)適應(yīng)性?；ㄑ啃菝叩恼T導(dǎo)、維持、解除是一個復(fù)雜的連續(xù)的生物學(xué)過程，是植物內(nèi)部調(diào)控和外界環(huán)境因子相互作用的結(jié)果。根據(jù)休眠的誘因，lang(1987)將含有分生組織的植物結(jié)構(gòu)可見生長的暫時停止稱為休眠，并將其分為類休眠(para-dormancy)、內(nèi)休眠(endo-dormancy)和生態(tài)休眠(eco-dormancy)三大類，并將休眠的整個過程分為五個階段：類休眠、類休眠-內(nèi)休眠、內(nèi)休眠、內(nèi)休眠-生態(tài)休眠和生態(tài)休眠。這種對休眠的定義及分類已被人們廣為接受并被廣泛應(yīng)用。類休眠是由植物休眠結(jié)構(gòu)以外的相鄰器官所控制的休眠，即使在有利的環(huán)境條件下，休眠結(jié)構(gòu)仍然保持休眠，只有除去限制源，休眠結(jié)構(gòu)才能迅速恢復(fù)生長。內(nèi)休眠是由植物休眠結(jié)構(gòu)內(nèi)部的生理因素所控制的休眠，只有經(jīng)過一定時期的低溫或光周期后才能解除休眠，重新開始生長。生態(tài)休眠是由外界不利環(huán)境因素所引起的休眠，只要環(huán)境條件適宜植物生長發(fā)育時，休眠器官即恢復(fù)生長。

休眠發(fā)展進(jìn)程的檢測不僅具有重大的理論意義還具有重要的實(shí)踐意義，因?yàn)樵谏a(chǎn)中無論是避免休眠還是在休眠后期的低溫替代都是只有芽子處在這些方法能夠干預(yù)的合適階段才有效。目前廣泛應(yīng)用的是在人工氣候室或光照培養(yǎng)箱清水插枝催芽法判定芽的休眠進(jìn)程，即從夏季每隔一定時間間隔采取枝條，然后插入盛水(約2cm深)的玻璃杯中(在自然落葉前，將枝條摘除葉片，剪除頂部幼梢)，并放置于人工氣候室或光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用第一顆花芽開放所經(jīng)歷的時間或芽的平均萌芽時間或萌芽級數(shù)表示休眠狀態(tài)。在設(shè)施生產(chǎn)中，花芽自然休眠的解除至關(guān)重要，成為限制其生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。有效解除休眠方式的建立往往受限于對休眠發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識。近年來，利用分析生物學(xué)手段在生理生化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子調(diào)控等不同水平的研究，對其休眠機(jī)理進(jìn)行了探索，初步揭示了“芽休眠”的奧秘。

梅花(prunusmumesieb.etzucc.)屬薔薇科(rosaceae)李屬(prunus)，是中國的傳統(tǒng)名花，在中國已有3000年的栽培歷史。梅花早春開放，是李屬中開花最早的種。就梅花而言，休眠的生理機(jī)制研究的較為深入，但在分子水平上，芽休眠尤其花芽休眠解除過程仍存在許多不明確的機(jī)制，如休眠解除過程中起調(diào)控作用的基因的確定、低溫解除休眠的作用機(jī)制、光周期如何調(diào)控等。因此，亟需探索一種簡單方便、快速準(zhǔn)確，能夠在分子層面檢測梅花花芽休眠狀態(tài)的方法，為進(jìn)一步豐富梅花花芽休眠分子機(jī)制以及栽培生產(chǎn)提供理論支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種梅花花芽休眠狀態(tài)的分子檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了pm011905基因在監(jiān)測梅花休眠狀態(tài)方面的應(yīng)用，所述pm011905基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

具體地說，通過梅花花芽中pm011905基因的表達(dá)量的變化，判斷梅花花芽的休眠狀態(tài)。

第二方面，本發(fā)明提供了一種梅花花芽休眠狀態(tài)的分子檢測方法，包括如下步驟：

(1)分兩次采集待測梅花的花芽，分別提取所述花芽的rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以所述cdna為模板，利用seqidno.2～3所示的引物對pm011905基因進(jìn)行熒光定量pcr；

(2)比較兩次采集的花芽的pm011905基因的表達(dá)量：

當(dāng)連續(xù)兩次采樣該基因的表達(dá)量很低，且后一次表達(dá)量比前一次表達(dá)量的增長量小于等于10％，則判斷花芽處于類休眠階段；

當(dāng)連續(xù)兩次采樣該基因的表達(dá)量比較高，且后一次表達(dá)量比前一次表達(dá)量的增長量大于10％、或減少量大于10％，則花芽處于生理休眠階段；

當(dāng)連續(xù)兩次采樣該基因的表達(dá)量很低，且后一次表達(dá)量比前一次表達(dá)量的減少量小于等于10％，則花芽處于生態(tài)休眠階段。

其中，兩次采集時間相隔7天。

作為優(yōu)選，所述熒光定量pcr的程序?yàn)椋?4℃3分鐘；94℃10秒，60℃20秒，40個循環(huán)，在60℃采集信號。進(jìn)一步地，以pp2a基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量pcr。其正向引物為atatagctgctcagttcaacc，反向引物為aaaaacagtcaccacattctt。

進(jìn)一步地，所述類休眠階段指通過人工條件培養(yǎng)后萌發(fā)率為0，所述生理休眠階段指通過人工條件培養(yǎng)后萌發(fā)率達(dá)到30～50％，所述生態(tài)休眠階段指通過人工條件培養(yǎng)后萌發(fā)率達(dá)到100％(同lang1987年提出的類休眠、生理休眠和生態(tài)休眠)。

所述人工條件培養(yǎng)具體為：將當(dāng)年生枝條底部插入水中，并將其放入人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，人工條件設(shè)為白天25℃16小時，夜晚為16℃8小時，濕度為70％。每隔2天將其底部減掉，每日觀察花芽萌動情況，培養(yǎng)10天后，分別記錄每組花芽萌發(fā)個數(shù)并計(jì)算萌發(fā)率。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可通過梅花花芽中pm011905基因的表達(dá)量的變化，監(jiān)測或判斷梅花花芽的休眠狀態(tài)。提供了一種簡單方便、快速準(zhǔn)確，能夠在分子層面檢測梅花花芽休眠狀態(tài)的方法，為進(jìn)一步豐富梅花花芽休眠分子機(jī)制以及栽培生產(chǎn)提供理論支持。

附圖說明

圖1為β-1,3-葡聚糖苷酶基因mega聚類圖。

圖2為不同休眠時期轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)量。

圖3為不同休眠時期pm011905表達(dá)量。

圖4為不同萌發(fā)率所對應(yīng)的pm011905基因表達(dá)量圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

材料：自10月15日開始，每隔7天采集鷲峰“綠萼”品種當(dāng)年生梅花枝條，每次10根枝條，大概100顆花芽，并將其隨機(jī)分為3組，每組分別統(tǒng)計(jì)枝條上花芽個數(shù)。

人工條件培養(yǎng)：將當(dāng)年生紙條底部插入水中，并將其放入人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，人工條件設(shè)為白天25℃16小時，夜晚為16℃8小時，濕度為70％。每隔2天將其底部減掉，每日觀察花芽萌動情況，培養(yǎng)10天后，分別記錄每組花芽萌發(fā)個數(shù)和萌發(fā)率。

萌芽率統(tǒng)計(jì)：根據(jù)萌發(fā)率及萌發(fā)所需要的時間，確定花芽所處的休眠狀態(tài)。若萌發(fā)率為0，此時花芽處于類休眠階段；若萌發(fā)率達(dá)到30-50％時，此時處于生理休眠階段；若萌發(fā)率為100％時，花芽處于生態(tài)休眠階段。

本發(fā)明利用9條擬南芥和9條楊樹已經(jīng)驗(yàn)證過的gh17家族成員做目標(biāo)序列，分別對桃和梅花做本地blastp,hmm，meme等進(jìn)行同源比對，分別獲得14和11條同源序列：

1、9條擬南芥gh17家族序列號：

at2g27500、at5g42100、at1g32860、at3g13560、at3g07320、at4g16260、at3g57270、at3g57240、at3g57260。

2、9條楊樹gh17家族序列號：

gh17_6、gh17_33、gh17_39、gh17_44、gh17_61、gh17_65、gh17_79、gh17_101、gh17_102。

3、14條桃gh17家族序列號：

prupe.6g130300.1、prupe.5g132700.2、prupe.4g081200.1、prupe.3g016900.1、prupe.3g210700.1、prupe.1g168300.1、prupe.8g194400.1、prupe.7g051800.1、prupe.1g121800.1、prupe.7g052000.1、prupe.7g051700.1、prupe.7g051600.1、prupe.7g051700.1、prupe.7g051800.1。

4、11條梅花gh17家族序列號：

pm011905、pm012166、pm001330、pm025781、pm027057、pm025777、pm009499、pm027288、pm025774、pm025782、pm020865。

結(jié)合mega聚類(圖1)和在不同組織中的mrna表達(dá)情況(圖2)分別對pm011905，pm012166，pm001330，pm027057，pm027288，pm025782做rt-qpcr定量分析，最終pm011905轉(zhuǎn)錄組及rt-qpcr定量均符合正常生理特征(圖3)，因此可以為候選基因。利用primer5軟件，設(shè)計(jì)qpcr定量引物，最終通過篩選，所得正向引物為tcacgttcccgttctttctc，反向引物為cggccgtagttgattcctatt。

樣本采集及qpcr定量分析：分別采集每個有代表性時期的花芽，放入-80℃中進(jìn)行保存。利用艾德萊rna提取試劑盒，按照提取說明，分別提取rna，并將2ngrna其反轉(zhuǎn)錄成cdna，利用jena熒光定量pcr儀器，對不同時期的花芽進(jìn)行定量分析。所用內(nèi)參為pp2a，其正向引物為atatagctgctcagttcaacc，反向引物為aaaaacagtcaccacattctt，所用pm011905正向引物為tcacgttcccgttctttctc，反向引物為cggccgtagttgattcctatt。其rt-qpcr定量所用的程序?yàn)?4℃3分鐘；94℃10秒，60℃20秒，40個循環(huán)，在60℃采集信號。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)：其定量結(jié)果是在類休眠階段，該基因表達(dá)量非常低，隨著冷積溫的逐漸增加，該基因的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)生理休眠完全解除之后，即人工條件下萌芽率達(dá)到100％時，其處在生態(tài)休眠階段，此時該基因的表達(dá)量迅速下降(圖4)。

實(shí)施例2

分別在11月1號、8號采集花芽樣本，對其進(jìn)行rna提取、cdna反轉(zhuǎn)錄、和qpcr定量分析，發(fā)現(xiàn)1號和8號的樣本中pm011905基因的表達(dá)量都很低，而且8號的表達(dá)量比1號的表達(dá)量僅僅高2％(小于10％)，就說明1號、8號的花芽處在類休眠階段。為了驗(yàn)證次結(jié)果，分別將1號、8號的枝條進(jìn)行水培，發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率僅僅為0％，也符合lang提出的類休眠的定義。

分別在12月10號、18號采集花芽樣本，對其進(jìn)行rna提取、cdna反轉(zhuǎn)錄、和qpcr定量分析，發(fā)現(xiàn)10號和18號pm011905基因的表達(dá)量都很高，而且18好的表達(dá)量比10號的表達(dá)量高50％(大于10％)，就說明10號、18號的花芽處在生理休眠階段。為了驗(yàn)證次結(jié)果，分別將10號、18號的枝條進(jìn)行水培，發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率為40％和50％，也符合lang提出的生理休眠的定義。

分別在1月21號、28號采集花芽樣本，對其進(jìn)行rna提取、cdna反轉(zhuǎn)錄、和qpcr定量分析，發(fā)現(xiàn)21號和28號pm011905基因的表達(dá)量都很低，而且28好的表達(dá)量比1號的表達(dá)量僅僅低2％(小于10％)，就說明21號、28號的花芽處在生態(tài)休眠階段。為了驗(yàn)證次結(jié)果，分別將21號、28號的枝條進(jìn)行水培，發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率為90％和100％，這也符合lang提出的生態(tài)休眠的定義。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京林業(yè)大學(xué)

<120>一種梅花花芽休眠狀態(tài)的分子檢測方法

<130>khp171113964.3

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1413

<212>dna

<213>pm011905

<400>1

atggccaccttcacgttcccgttctttctctcactcctcctcctcccgctcttctcactc60

ttgacttttgcagctgaaaacacaacaggtacaataggaatcaactacggccgaatagcc120

aacaatttacctacaccggaaaaagtagtggcgctcctcaagtcccaaggtatcaacaaa180

gtcaagctctacgacactgacgccgccgtcctcaccgcccttgccaactccggcataaac240

gtcgtcgtcgcgctccccaacgagctcctctcctccgccgccaacgacccctccttcgcc300

gacaaatgggtccaagccaacatctcccaataccacccgcagacccaaatagaagccatc360

gccgtcggcaacgaagtcttcgccgacccaaacaacaccaccaaattcctcgtccctgcc420

attaacaacctccaatcagcgctcgtcaagcacaatctaagctcctccatcaagctctct480

tccccaattgccctcagcgcgctccagaattcgtaccctccttcgtccggatccttcaaa540

ccggatctaatcgaacccgcaattaaacctttgttggactttttaagcaaaacgtcgtcg600

tatttgatgatcaatgcgtatccctttttcgcgtacgaggccaacgctgacgagatctct660

ctagactacgccttgtttcggaccaaccagggtaacgtggattcgggtaacgggttgcgt720

tataatagtttgatggaggcccaactcgacgccgttttcgctgccatgtcagctctcgga780

tacgatgacgttaagttggtggtgacggagaccggttggccttctaacggcgacgagaac840

gagattggctcggggaaagccaacgccgcggcgtataacggaaacttggtgaaaagagtt900

ttgacagggagtgggacccccttgaagcccaaggacccactcaacgtgtatttatttgct960

ctgtttaatgagaaccagaagcccgggcccacatcggagaggaattacgggctgttttat1020

ccggatgaagggaaggtgtacgacataccccttactctcgcgggcctgagtggggcccag1080

tcaaatccggtcaacgagagcaaggcccaggtaccgacgacggcgccgtctagtgggaac1140

acgtggtgcgtggcgaatgcgaatgcaggggaggagaagcttcaggctgcactggattac1200

gcatgcggagagggcggggctgattgccgttcgattcaggaaggctccacgtgtttcaat1260

ccaaatacgcttgaggcgcacgcttcgtacgcctttaatagttactatcagaagaaggca1320

cgtggaactggcacgtgcgattttggtggcgccgcacacgttgttgcccaacctccaagg1380

tatgggacgtgcgagtacccaacaggttactga1413

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcacgttcccgttctttctc20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cggccgtagttgattcctatt21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atatagctgctcagttcaacc21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aaaaacagtcaccacattctt21