本發(fā)明涉及一種獲取作為中間結(jié)果的圍手術(shù)期腎臟移植受者信息，特別是涉及一種t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法。
背景技術(shù)：
腎臟移植是目前治療慢性腎功能衰竭最有效的方法。隨著慢性腎衰竭患者的增多，研究者們經(jīng)過不斷的探索，終于使腎移植成為了終末期腎病病人的最佳替代治療方法。成功的腎移植可顯著提高終末期腎病患者的生活質(zhì)量。近年來，腎移植受者/移植腎的短期存活率明顯得到改善，但受者/移植腎的長期存活率卻沒有進(jìn)一步提高。sellares等對美國移植研究數(shù)據(jù)庫中不同時(shí)期的腎移植受者長期存活數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：與早期階段(1982～1984年)相比，近年來(2005～2010年)腎移植的短期存活率已明顯提高，而術(shù)后5年移植腎的存活率仍每年持續(xù)下降約3.6％。
目前排斥反應(yīng)和感染是腎臟移植術(shù)后面臨的兩大問題。腎臟移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致移植腎丟失的主要原因之一，發(fā)生率為20％-50％，其也是影響移植腎長期存活率和功能的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。預(yù)防和減少早期急性排斥反應(yīng)的發(fā)生有利于移植受者和移植物的長期存活。急性排斥反應(yīng)跟很多因素有關(guān)，包括年齡、性別、透析時(shí)間、移植史、輸血次數(shù)、女性的妊娠史、供體的冷、熱缺血時(shí)間、配型、原發(fā)病、供體情況及免疫抑制方案等。
早期移植腎急性排斥反應(yīng)的主要臨床表現(xiàn)主要：①尿量減少；②發(fā)熱，特別是中低熱，一般常在下半夜和凌晨發(fā)生，常至午后退熱，次日又再次出現(xiàn)，伴有感冒樣全身癥狀；也沒有明顯的感染征象。③血壓增高尤其是突然的血壓升高且對降壓藥物反應(yīng)較差者。④移植腎區(qū)腫脹觸痛不適?；颊咭话阕杂X移植腎區(qū)脹痛、壓痛，觸診可捫及腎臟比原來增大，質(zhì)地變硬；⑤體重逐漸增加，因?yàn)槟蛏?，體內(nèi)水分未能排出導(dǎo)致的，嚴(yán)重者可出現(xiàn)明顯水腫或腹水。⑥其他全 身癥狀如肌肉關(guān)節(jié)酸痛腹脹，納差等。目前臨床監(jiān)測腎移植術(shù)后免疫狀態(tài)的方法包括受體的全身情況、血肌酐、彩色多普勒超聲、免疫抑制劑的血藥濃度監(jiān)測、移植物穿剌組織病理學(xué)檢查等。但是血肌酐敏感度和特異性較差，對臨床上的預(yù)防及治療等意義不大；彩色多普勒超聲受到超聲診斷醫(yī)生主觀影響較大；較為普遍的是監(jiān)測免疫抑制劑的血藥濃度，但是由于不同受者的體內(nèi)藥物代謝存在著個(gè)體差異，且機(jī)體內(nèi)多種因素都可以影響免疫抑制藥物的血藥濃度，許多術(shù)后患者仍不可避免排斥反應(yīng)的發(fā)生；而移植物穿刺組織病理學(xué)檢查是一種有創(chuàng)性檢查，且只能反映移植腎穿刺局部的情況,對患者具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，存在并發(fā)癥如出血、休克、動(dòng)靜脈瘺、血尿、無尿、移植腎破裂、甚至引起移植腎丟失等，不宜反復(fù)監(jiān)測。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于此，有必要針對上述問題，提供一種圍手術(shù)期腎移植受者t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法。
一種t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法，包括以下步驟：
設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標(biāo)本；
分離各所述外周血標(biāo)本的t細(xì)胞，并分別提取所述外周血標(biāo)本t細(xì)胞中的dna；
采用多重pcr技術(shù)，擴(kuò)增出t細(xì)胞受體β鏈的cdr3區(qū)；
對所述t細(xì)胞受體β鏈的cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序，對所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈進(jìn)行dna分析。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用多重pcr技術(shù)之前，所述處理方法還包括測定dna的含量以及檢測dna完整性的步驟。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用熒光分析法測定dna的含量，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測dna完整性。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，利用illuminamiseq平臺(tái)對cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用多重pcr技術(shù)，擴(kuò)增出t細(xì)胞受體β鏈的cdr3區(qū)，包括構(gòu)建dna文庫，其具體包括：
計(jì)算所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物進(jìn)行多重pcr；
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
加入末端修護(hù)混合液進(jìn)行末端修護(hù)反應(yīng)，并純化；
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
在接頭連接反應(yīng)體系中進(jìn)行接頭連接；
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述v區(qū)引物包括trbv2、trbv3-1、trbv4-1/2/3、trbv5-1、trbv5-4/5/6/8、trbv6-4.1、trbv6-8/5/1.2、trbv6-9/7/1.1/6、trbv6-4.2、trrbv6-2/3、trbv7-2/4/6/7/8、trbv7-3、trbv7-9、trbv9、trbv10-1、trbv10-2/3、trbv11-1/2/3、trbv12-3.2/5.2、trbv12-3.1/4/5.1、trbv13、trbv14、trbv15、trbv16、trbv18、trbv19、trbv20-1、trbv24-1、trbv25-1、trbv27-1、trbv28、trbv29-1及trbv30-f5。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述j區(qū)引物包括trbj1.1、trbj1.2、trbj1.3、trbj1.4、trbj1.5、trbj1.6、trbj2.1、trbj2.2、trbj2.3、trbj2.4、trbj2.5、trbj2.6及trbj2.7。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建dna文庫后，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進(jìn)行定量。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，分離各所述外周血標(biāo)本的t細(xì)胞包括：分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞及分離出所述淋巴細(xì)胞中的t細(xì)胞。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，采用ficoll密度梯度離心法分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
上述處理方法通過高通量測序?yàn)榛A(chǔ)對圍手術(shù)腎移植受者已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞tcr的cdr3區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期腎臟受體的部分trβv和trβj亞類的表達(dá)與正常人存在一定差異，且發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期腎 移植受者中存在特定的共有序列，這些共有序列是疾病的潛在生物標(biāo)志物，對疾病診斷、病情判斷及預(yù)后評估有重要價(jià)值。
上述t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法，設(shè)計(jì)合理可行，能夠有效地獲取作為中間結(jié)果的圍手術(shù)期腎移植受者相關(guān)信息，可用于圍手術(shù)期腎移植受者免疫狀態(tài)的后續(xù)分析，對這些信息進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證分析和研究有助于研究排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制并指導(dǎo)免疫抑制藥物的個(gè)體化合理應(yīng)用，進(jìn)而有助于提高腎移植受者和移植物術(shù)后的短期及長期存活率。
附圖說明
圖1為本發(fā)明一實(shí)施例中t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法的流程示意圖。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
請參閱圖1，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是，一種t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法，其包括如下步驟。
s110、設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標(biāo)本，例如，所述實(shí)驗(yàn)組包括術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組。
例如，本發(fā)明各實(shí)施例采用的外周血標(biāo)本，分別來自于在南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第器官移植中心住院接受腎移植的腎功能不全尿毒癥期患者(慢性腎小球腎炎引起)10例和在南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第181醫(yī)院同一時(shí)間段體檢的健康者10例。所有患者均符合2009kdigo制定的慢性腎小球腎炎引起的腎功能不全尿毒癥期診斷標(biāo)準(zhǔn)：確診慢性腎小球腎炎患者出現(xiàn)尿毒癥癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查有尿液性質(zhì)改變，不同程度貧血，代謝性酸中毒，水、電解 質(zhì)紊亂等；血尿素氮>22mmol/l，血肌酐>442umo/l；血清肌酐清除率<15ml/min。
其中尿毒癥患者10例，女性3例，男性7例，年齡25～63歲，平均年齡40.3±12.83歲，病程0.6～12年。術(shù)前血液透析治療時(shí)間平均8月(l月～5年)，所有受者均為首次移植、同種異體心死亡供體(donationaftercardiacdeath，dcd)腎移植。供、受者abo血型相容，受者群體反應(yīng)性抗體(panelreactiveantibody，pra)陰性，淋巴毒實(shí)驗(yàn)均＜10％。供腎熱缺血時(shí)間6～11分鐘，冷缺血時(shí)間3～15小時(shí)。從術(shù)中至術(shù)后采用常規(guī)免疫抑制方案，免疫抑制方案：術(shù)中至術(shù)后2天用甲基強(qiáng)的松龍(mp)500mg/d，術(shù)后第2天開始口服他克莫司(tacrolimus，fk506)+甲潑尼龍(mp)+霉酚酸酯(驍悉，mmf)三聯(lián)用藥，fk506起始量0.15mg/kg/d，根據(jù)血藥濃度和臨床癥狀逐漸調(diào)整劑量，mp起始量為70mg/d,8mg/d開始減量，減至16mg/d或12mg/d并維持；mmp0.5g，2次/d。避免使用清除淋巴細(xì)胞的免疫抑制劑。所有受者移植腎功能正?；謴?fù)，未發(fā)生延遲腎功能恢復(fù)(delayedgraftfunction，dgf)，在術(shù)后2周內(nèi)均未發(fā)生急性排斥反應(yīng)。
健康對照組10例，其中女性5例，男性5例，年齡為24～47歲，平均年齡34.9±9.39歲，為南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第181醫(yī)院同一時(shí)間段體檢的健康者，無重大疾病史，無免疫方面的相關(guān)疾病、近期感染及腎臟方面疾病，直系親屬無自身免疫性疾病。
例如，在室溫條件下，獲取脫離人體的外周靜脈血5ml置于5mledta抗凝真空采血管，蓋上蓋子后，將edta抗凝真空采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次后，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采集每個(gè)健康對照者外周肝素抗凝靜脈血約5ml，每個(gè)腎移植受者于術(shù)前1天、術(shù)后1天、術(shù)后7天共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各采集外周肝素抗凝靜脈血5ml，一共40個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本在收集后當(dāng)天分離出t細(xì)胞。
s120、分離各所述外周血標(biāo)本的t細(xì)胞，并分別提取所述外周血標(biāo)本t細(xì)胞中的dna。
例如，分離各所述外周血標(biāo)本的t細(xì)胞包括：分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞及分離出所述淋巴細(xì)胞中的t細(xì)胞。又如，采用ficoll密度梯度離心法 分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
又如，步驟s120包括如下步驟：
s121、分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
具體地，步驟s121包括如下步驟：
(1)在離心管中按1：1比例加入適量淋巴細(xì)胞分離液，即淋巴細(xì)胞分離液與外周血的體積比為1：1。
(2)取肝素抗凝靜脈血用滴管沿離心管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心800g×25分鐘，即離心力rcf的值為800，離心時(shí)間為20min。
(3)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
(4)用平頭吸管吸出上、中層界面處絮狀液體，轉(zhuǎn)移至eppendorf管；離心細(xì)胞液800g×15分鐘，去液相，加入無菌pbslml洗滌，再用吸管吹勻細(xì)胞懸液；再次離心細(xì)胞液400g×15分鐘，去液相。
(5)末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的rpmi1640，重懸細(xì)胞。取20ul細(xì)胞懸液與20ul0.5％溴酚蘭染液混合(1：1)，于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。
s122、分離出淋巴細(xì)胞分離液中的t細(xì)胞。
具體地，步驟s122包括如下步驟：
(1)以400～900g離心已抗凝的全血。
(2)收集白膜層并用等體積的磷酸鹽緩沖液(pbs)稀釋，混勻。例如，取白膜層中部物質(zhì)1～2ml并用等體積的pbs稀釋，混勻。
(3)在5ml的管中最多加入2ml的白膜層/pbs混合液覆蓋到1.5ml的ficoll－h(huán)ypaque(密度為1.077)層上，并以1000g離心10分鐘。例如，pbs混勻后的白膜層恒溫保存并在10分鐘之內(nèi)使用，即在10分鐘之內(nèi)覆蓋到1.5ml的ficoll－h(huán)ypaque層上，并以1000g離心10分鐘。
(4)從每個(gè)管中收集約1ml的界面液體轉(zhuǎn)移到炮彈管中。1000g離心10分鐘。
(5)棄去上清并用細(xì)胞培養(yǎng)液1640再次使小球混懸。以1000g離心5分鐘(移去大部分血小板。)棄去上清，用1ml的20％的hifcs/pbs再次混懸細(xì)胞。
(6)用吸液管移去上清，用1ml的細(xì)胞培養(yǎng)液1640再次混懸細(xì)胞。
(7)加入100μl的t熒光微珠到樣品管中。
(8)在20～25℃旋混3分鐘。
(9)去蓋放在磁力架上1分鐘。
(10)去上清液后保存到另一個(gè)管中，用b熒光微珠分離b淋巴細(xì)胞。
(11)1ml細(xì)胞培養(yǎng)液1640再次混懸細(xì)胞。輕擊管子使得微珠再次混懸，放在磁力架上30秒，用吸液管移去上清。重復(fù)2次。
(12)用0.5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液1640再次混懸細(xì)胞。
(13)將部分t淋巴細(xì)胞凍存，部分用于dna提取。
s123、提取t細(xì)胞中的dna。
具體地，步驟s123包括如下步驟：
(1)事先用80ml無水乙醇將dnawashbuffer稀釋后室溫保存。
(2)在超凈工作臺(tái)中，將無菌濾膜打開，用剪刀沿濾膜濾膜外緣約減去1cm的圓環(huán)，例如，以能蓋住漏斗的孔徑為宜，放入抽濾裝置的無菌漏斗中。用0.22μm微孔濾膜過濾水樣。需要說明的是，所用水樣體積取決于所采集水樣的渾濁度，對于渾濁度高的水樣建議先用較大孔徑的濾膜過濾以防阻塞微孔。
(3)用鑷子將濾膜從漏斗中取出、折疊，用剪刀將其剪碎置入一個(gè)50ml的無菌離心管中。
(4)向離心管中加3mlslxbuffer和500mg玻璃珠。
(5)最大轉(zhuǎn)速渦旋震蕩3min左右，使樣品與溶液徹底混勻，使膜上菌體進(jìn)入溶液。
(6)70℃或90℃水浴10min使菌體裂解渦旋震蕩2～3次。
(7)向管中加1mlsp2buffer渦旋震蕩30s，冰浴5min。
(8)4℃，4000g離心10min。
(9)在超凈臺(tái)中將上清液轉(zhuǎn)移至一新的15ml或50ml管中，加0.7倍體積的異丙醇，翻轉(zhuǎn)混勻30～50次，在-20℃下至少放置30min。期間翻轉(zhuǎn)幾次。
(10)4℃，10000g離心20min使dna沉降。
(11)將離心管平放，使以沉降的dna貼于壁上在室外將液相倒掉后將管倒扣在吸水紙上瀝干，若還有殘留，則在超凈臺(tái)中用移液器吸去。
(12)向管中有dna沉降處加400μlelutionbuffer，稀釋混勻，使dna溶解后將其轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管中，渦旋震蕩徹底混勻20s。在65℃水浴10～30min以溶解dna。
(13)向1.5ml離心管中，加100μlhtrreagent。旋轉(zhuǎn)震蕩混合10s后室溫放置2min。需要說明的是，用htrreagent前要用渦旋儀將其徹底震蕩混勻。
(14)12000rpm高速離心3min使htrreagent沉降。需要說明的是，也可以選用較小的轉(zhuǎn)速和較長的離心時(shí)間。若經(jīng)htrreagent提取后樣品仍然顯棕色或深色，則用htrreagent重復(fù)步驟(13)～(14)提取。
(15)將上清液，例如，約400μl，轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中，加入等體積的xp1buffer，通過旋轉(zhuǎn)震蕩充分混勻。
(16)將處理的dna吸附柱放入一個(gè)2ml的收集管中。
(17)將樣品全部轉(zhuǎn)入該dna吸附柱中，室溫下，10000rpm離心1min。將離心后的液相倒掉，重新將吸附柱放回收集管中。需要說明的是，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，多次重復(fù)步驟(17)。例如，重復(fù)步驟(17)直至離心后的液相體積小于步驟(17)初次離心后的液相體積的2％～5％，優(yōu)選為2％或者更低。
(18)向吸附柱中加300μlxp1buffer，室溫下，10000rpm離心1min，棄去收集管中的液相。
(19)將吸附柱放入一個(gè)新的2ml收集管中，加750μl用無水乙醇稀釋后的dnawashbuffer，10000rpm離心30s。棄去液相，將吸附柱重新放回收集管中。
(20)最大轉(zhuǎn)速空離2～3min，使吸附柱干燥。需要說明的是，空離完后在超凈臺(tái)中開蓋晾干2min。該步驟需要去除殘余乙醇，乙醇?xì)埩艨赡軙?huì)影響下游 酶的使用。
(21)將吸附柱放入一個(gè)新的1.5ml離心管中，將50～100μldnaelutionbuffer垂直懸空加至吸附柱中央，65℃水浴3min。最大轉(zhuǎn)速離心1min后洗提回收dna。需要說明的是，先加50μlelutionbuffer水浴離心完后換個(gè)1.5ml離心管，再加30μlelutionbuffer，水浴離心，將兩次得到的dna溶液合并后再分裝，一個(gè)30μl、一個(gè)50μl，前者放4℃常用，后者-20℃低溫儲(chǔ)存。
(22)收集dna并存放在2-8℃冰箱中待用。
s130、測定中dna含量及完整性。
例如，步驟s130包括如下步驟：
s131、測定dna含量，例如，采用熒光分析法測定dna的含量。
具體地，步驟s131包括如下步驟：
配制dna染料工作液；
例如，dna染料為quant-ittmreagent，通過用quant-ittmbuffer將其稀釋200倍得到quant-ittmworkingsolution。
制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
例如，分別取quant-ittmstandard1(100ng/μl)和quant-ittmstandard2(100ng/μl)0～10μl混合后，其中quant-ittmstandard1和quant-ittmstandard2的總體積為10μl，再與190μlquant-ittmworkingsolution混合后，按照
將dna待測液與dna染料工作液混合，室溫靜置2分鐘后，進(jìn)行熒光檢測；
分別取2～20μl的dna待測液與180～198μl的quant-ittmworkingsolution混合后，其中，dna待測液與quant-ittmworkingsolution總體積為200μl，室溫靜置2分鐘，使dna與染料充分結(jié)合，然后置于
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出dna待測液的dna含量。
s132、測定dna完整性，例如，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定dna的完整性。又如，測定dna待測液的完整性包括如下步驟。
具體地，將dna待測液在冰上融化后，充分混勻后離心，取3μldna樣品與加樣緩沖液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μldnamarker，選用0.6％的瓊脂糖凝膠在120v電壓下電泳45分鐘，電泳至溴酚藍(lán)在凝膠中遷移出適當(dāng)距離，切斷電流，取出凝膠，在紫外燈下檢查并掃描圖像。
s140、采用多重pcr技術(shù)，擴(kuò)增出t細(xì)胞受體β鏈的cdr3區(qū)。
例如，采用多重pcr技術(shù)，擴(kuò)增出t細(xì)胞受體β鏈的cdr3區(qū)，包括構(gòu)建dna文庫，其具體包括：
計(jì)算所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物進(jìn)行多重pcr；
例如，取dna含量為500ng的所述dna待測液，加入預(yù)設(shè)計(jì)的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物后用qiagenmultiplexpcrkit進(jìn)行多重pcr，進(jìn)行30循環(huán)(cycles)。
具體地，所述v區(qū)引物包括trbv2、trbv3-1、trbv4-1/2/3、trbv5-1、trbv5-4/5/6/8、trbv6-4.1、trbv6-8/5/1.2、trbv6-9/7/1.1/6、trbv6-4.2、trrbv6-2/3、trbv7-2/4/6/7/8、trbv7-3、trbv7-9、trbv9、trbv10-1、trbv10-2/3、trbv11-1/2/3、trbv12-3.2/5.2、trbv12-3.1/4/5.1、trbv13、trbv14、trbv15、trbv16、trbv18、trbv19、trbv20-1、trbv24-1、trbv25-1、trbv27-1、trbv28、trbv29-1及trbv30-f5。所述j區(qū)引物包括trbj1.1、trbj1.2、trbj1.3、trbj1.4、trbj1.5、trbj1.6、trbj2.1、trbj2.2、trbj2.3、trbj2.4、trbj2.5、trbj2.6及trbj2.7。具體地，本實(shí)施例中采用的v區(qū)引物及j區(qū)引物見表1。
表1：v區(qū)及j區(qū)引物
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
例如，電泳檢測回收100～190bp的多重pcr產(chǎn)物，并使用qiaquickgelextractionkit進(jìn)行回收。
加入末端修護(hù)混合液進(jìn)行末端修護(hù)反應(yīng)，并純化；
例如，在20℃條件下，加入10×endrepairbuffer及endrepairmix，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，并使用qiaquickpcrpurificationkit進(jìn)行純化。
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
例如，利用nebnextda-tailingmodule在已補(bǔ)平末端的dna片段3’端加入腺嘌呤(a)。又如，在37℃的條件下，加入nebnextda-tailingbuffer及nebnextda-tailingenzyme，反應(yīng)30分鐘。
在接頭連接反應(yīng)體系中進(jìn)行接頭連接；
例如，用adapteroligomix和dnaligase配制接頭連接反應(yīng)體系進(jìn)行接頭連接。
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。
在本實(shí)施例中，將接頭連接后的產(chǎn)物pcr擴(kuò)增后，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，使用qiaquickgelextractionkit進(jìn)行膠純化回收，溶于洗脫緩沖液中。
在本發(fā)明一實(shí)施例中，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進(jìn)行定量。
例如，檢測所述基因文庫包括檢測所述基因文庫的插入片段范圍及定量測定所述基因文庫的濃度。又如，使用agilent2100bioanalyzer(agilentdna1000reagents)檢測文庫的插入片段范圍，又如，使用abisteponeplusreal-timepcrsystem(taqmanprobe)對文庫進(jìn)行濃度的定量。
s150、對所述t細(xì)胞受體(tcr)β鏈的cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序，對所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈進(jìn)行dna分析。
對所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈進(jìn)行dna分析，包括以下步驟：分析所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈的各個(gè)基因家族的表達(dá)頻率、v-j配對、堿基插入、缺失情況、以及cdr3區(qū)多樣性與長度分布特征，篩選出所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中高度克隆性擴(kuò)增的dna序列、氨基酸序列和v-j組合，及所述實(shí)驗(yàn)組與所述對照組中共有的dna序列、氨基酸序列和v-j組合，并根據(jù)獨(dú)特克隆數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)威納系數(shù)分析所述實(shí)驗(yàn)組及對照組的t細(xì)胞受體多樣性差異和克隆表達(dá)差異。
例如，按照預(yù)期上機(jī)數(shù)據(jù)量，在檢測合格的基因文庫加入0.5mmol/l的naoh溶液，變性30分鐘，使雙鏈dna片段變性形成單鏈dna。并將變性后的文庫加入到flowcell內(nèi)，與flowcell上的接頭進(jìn)行雜交，然后在簇生成平臺(tái)cbot上結(jié)合truseqpeclusterkitv3-cbot-hs試劑完成橋式pcr擴(kuò)增。最后將制備好的flowcell采用hiseq2000測序系統(tǒng)和truseqsbskit-hsv3試劑進(jìn)行上機(jī)測序。
例如，測序后還包括：對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理、對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析、對序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、構(gòu)建免疫組庫、免疫組庫差異性分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理具體包括：在所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先對原始數(shù)據(jù)做過濾處理，過濾的過程中，首先過濾掉含有接頭的序列；將平局質(zhì)量低于15(illumina0-41質(zhì)量體系)的reads去掉；對于未知堿基(n堿基)，要求堿基數(shù)不能多于5％；針對序列尾部質(zhì)量較差的序列，截取低質(zhì)量部分(質(zhì)量小于10的堿基)，保證截取后的序列平均質(zhì)量高于15，同時(shí)，截取后剩余序列的長度要求大于60。根據(jù)以上過濾條件， 獲得過濾后的cleandata。過濾完成后，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig(片段重疊群)，在讀長是100的情況下，拼接過程分為兩步：1、將兩條序列的尾部比對，尋找匹配序列，這樣的拼接需要最小10個(gè)堿基的重疊，重疊區(qū)域堿基的匹配率要大于90％；2、鑒于免疫組庫捕獲區(qū)域的長短不同，在某些情況下會(huì)存在端序列被測通的情況，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，嘗試用頭部將其繼續(xù)拼接。最終得到的合并后的序列及合并的序列contig的長度分布圖。
例如，利用高通量測序方法(illumina2000基因組分析儀)，對實(shí)驗(yàn)組術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組共40標(biāo)本的外周血t淋巴細(xì)胞tcrβ鏈cdr3區(qū)域進(jìn)行測序。正常對照組中平均每個(gè)樣本獲得18772948.4條總讀長(totalreads)(大小范圍為11705732條～23823568條)，術(shù)前1天組中平均每個(gè)樣本獲得20113287.5條總讀長(大小范圍為15354871條～26224954條)，術(shù)后1天組中平均每個(gè)樣本獲得23172759.2條總讀長(大小范圍為15911180條～34879146條)，術(shù)后7天組中平均每個(gè)樣本獲得18742521.1條總讀長(大小范圍為14365756條～23289408條)。然后對這些原始數(shù)據(jù)做過濾處理(過濾掉含有接頭、平均質(zhì)量低于15以及未知堿基(n堿基)多于5％的讀長reads)，得到的結(jié)果：對照組的平均過濾率為4.63％(濾掉范圍從2.27％～7.58％)，術(shù)前1天組的平均過濾率為5.33％(濾掉范圍從3.51％～6.78％)，術(shù)后1天組的平均過濾率為6.07％(濾掉范圍從3.34％～9.04％)，術(shù)后7天組的平均過濾率為5.98％(濾掉范圍從3.19％～7.30％)。過濾完成后，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig，最終得到合并后的完整優(yōu)質(zhì)序列。對照組中平均有10674277.8條優(yōu)質(zhì)序列(totalgoodsequences)(大小范圍為2452132條～17046763條)，術(shù)前1天組中平均有12205989.7條優(yōu)質(zhì)序列(大小范圍為3795908條～18798538條)，術(shù)后1天組中平均有10216958.4條優(yōu)質(zhì)序列(大小范圍為230331條～20378545條)，術(shù)后7天組中平均有10382456.9條優(yōu)質(zhì)序列(大小范圍為4635813條～15764819條)。而對照組的平均克隆(clones)數(shù)為87125個(gè)(大小范圍從65236個(gè)～120744個(gè))，術(shù)前1天組的平均克隆(clones)數(shù)為57125.7個(gè)(范圍從15907個(gè)～148401個(gè))，術(shù)后1天組的平均克隆(clones) 數(shù)為41966.5個(gè)(范圍從5929個(gè)～127489個(gè))，術(shù)后7天組的平均克隆(clones)數(shù)為54634.6個(gè)(范圍從21018個(gè)～142448個(gè))。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析具體包括：使用milaboratory開發(fā)的mitcr對t細(xì)胞受體進(jìn)行自動(dòng)校正，校正由pcr、測序等原因帶來的序列錯(cuò)誤。比對完成后，自動(dòng)統(tǒng)計(jì)cdr3克隆的表達(dá)及插入缺失情況。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析具體包括：根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，得到比對得到v基因序列的最后位點(diǎn)，d基因的起始位點(diǎn)，d基因的終止位點(diǎn)及j基因的起始位點(diǎn)，通過位點(diǎn)信息找到v-d-j插入缺失的堿基并統(tǒng)計(jì)其長度分布。根據(jù)比對找到的cdr3區(qū)域，并統(tǒng)計(jì)cdr3序列的長度分布。
又如，對10個(gè)慢性腎小球腎炎導(dǎo)致腎功能衰竭(尿毒癥期)接受同種異體心死亡供體(donationaftercardiacdeath，dcd)腎移植手術(shù)的受者圍手術(shù)期三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(術(shù)前1天、術(shù)后1天及術(shù)后7天)和10個(gè)正常健康者外周血t細(xì)胞的tcrβ鏈的cdr3、vdindel以及djindel長度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并求平均值，發(fā)現(xiàn)在術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組中，tcrβ鏈cdr3、vdindel和djindel長度的分布頻率相似。tcrβ鏈cdr3的長度分布在16nt～106nt之間，其中分布頻率最大的5個(gè)cdr3長度為42，45，39，36和48nt；vdindel長度分布在-1～71nt，其中分布頻率最大的5個(gè)vdindel長度為0，2，3，1，及4nt；djindel長度分布在-1～73nt，其中分布頻率最大的5個(gè)djindel長度為4，0，3，1，及2nt。實(shí)驗(yàn)組各組外周血t淋巴細(xì)胞中的tcrβ鏈cdr3、vdindel和djindel長度分布頻率和對照組中的分布頻率相似，也無顯著性差異(p＞0.05)。
例如，對所述測序結(jié)果進(jìn)行分析還包括：
1、免疫組庫的構(gòu)建，其具體包括：根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)克隆的表達(dá)情況，分別統(tǒng)計(jì)dna序列，氨基酸序列，v-j組合三種不同分辨率情況下得到的各個(gè)樣本的表達(dá)情況。例如，為了衡量樣品的多樣性，分別統(tǒng)計(jì)和計(jì)算各個(gè)樣本的distinctclone數(shù)，辛普森系數(shù)及香農(nóng)威納系數(shù)，三個(gè)系數(shù)分別針對dna、氨基酸、v-j組合三種不同的分辨率。對于每一個(gè)樣本中每個(gè)克隆的表達(dá)情況，按照dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種不同分辨率統(tǒng)計(jì)每 個(gè)克隆的表達(dá)。篩選出各細(xì)胞亞群的高度克隆性擴(kuò)增(頻率大于0.5％)的dna序列，氨基酸序列，v-j組合。在t細(xì)胞發(fā)育過程中，tcr的v、d、j基因片段發(fā)生重排，結(jié)果在v-j片段間或在v-d-j片段間可隨機(jī)插入不同數(shù)量的核苷酸，形成具有高度多樣性的可變區(qū)cdr3，其在長度和氨基酸序列上存在較大差異，即cdr3序列決定了一個(gè)獨(dú)特的tcr克隆型，通過免疫組庫的建立，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)克隆的表達(dá)情況，為后續(xù)的分析提供數(shù)據(jù)支持。
2、免疫組庫的差異分析，其主要包括：樣本多樣性差異和克隆表達(dá)差異兩部分。其中，樣本多樣性差異旨在找出樣品間整體克隆表達(dá)模式的差別，表達(dá)差異則旨在找出差異顯著的克隆。樣本多樣性差異首先針對的是每個(gè)樣本計(jì)算出的多樣性系數(shù)，即distinct(uniq)clone數(shù)，辛普森和香農(nóng)威納系數(shù)。根據(jù)不同組間樣本屬性，針對的是dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種分辨率，統(tǒng)計(jì)計(jì)算差異顯著性。進(jìn)一步地，在dna序列、氨基酸序列和v-j組合三個(gè)層面進(jìn)行分析，使用泊松分布等相應(yīng)的檢驗(yàn)方案計(jì)算出每一個(gè)差異對的p值，同時(shí)使用fdr和bonferroni對p值做校正。
例如，將克隆擴(kuò)增程度劃分為≥0.5％，0.05～0.5％，0.005～0.05％，0.0005～0.005％和<0.0005％五個(gè)等級，定義克隆頻率大于0.5％的clones為高度擴(kuò)增性克隆(highlyexpandedclones，hec)，并從dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種不同分辨率統(tǒng)計(jì)每個(gè)克隆的克隆擴(kuò)增程度。每一個(gè)clone的克隆性擴(kuò)增程度的計(jì)算方法是：該clone在測試樣本中出現(xiàn)的次數(shù)/該樣本的總totalgoodsequences數(shù)。在dna序列中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)前1天組(pre-1)、術(shù)后1天組(post-1)、術(shù)后7天組(post-7)和對照組(nc)的高度擴(kuò)增性克隆數(shù)(highlyexpandedclones，hecs)分別為326個(gè)、1321個(gè)、229個(gè)和333個(gè)；對應(yīng)的在氨基酸序列中，術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的高度擴(kuò)增性克隆數(shù)分別為326個(gè)、1321個(gè)、229個(gè)和333個(gè)；在v-j組合中，術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的高度擴(kuò)增性克隆數(shù)分別1996個(gè)、1804個(gè)、2203個(gè)和2053個(gè)。在所有clones中，高度擴(kuò)增性克隆(hecs)所占的比例很小。以dna序列為例，術(shù)前1天組中僅占8.72×10-2±6.37×10-2％的clones為高度擴(kuò)增性克隆hecs，術(shù)后1天組的高度擴(kuò)增性克隆hecs為 1.14±1.37％，術(shù)后7天組的高度擴(kuò)增性克隆hecs為6.36×10-2±4.92×10-2％，而對照組中約占4.18×10-2±2.33×10-2％的clones其克隆頻率大于0.1％。術(shù)前一天組高度擴(kuò)增性克隆hecs跟正常健康對照組相比，p＝0.05716，無明顯差異；術(shù)后1天組高度擴(kuò)增性克隆hecs跟術(shù)前一天組相比，p＝0.038，有顯著性差異；術(shù)后1天組高度擴(kuò)增性克隆hecs跟術(shù)后7天組相比，p＝0.035，有顯著性差異；術(shù)后1天組高度擴(kuò)增性克隆hecs跟正常健康對照組相比，p＝0.032，具有顯著性差異；表明術(shù)后1天組中高度擴(kuò)增性克隆數(shù)明顯多于其他組。從整體克隆性擴(kuò)增程度來看，術(shù)后1天組中克隆頻率分布在≥0.1％，0.01～0.1％和0.001～0.01％區(qū)間的clones數(shù)量都明顯多于對照組；而對于分布在低擴(kuò)增性克隆區(qū)間(0.0001～0.001％和<0.0001％)的clones，其在術(shù)后1天組的數(shù)量明顯少于對照組，該結(jié)果表明術(shù)后1天組中的clones的擴(kuò)增性程度明顯高于正常對照組。
為了進(jìn)一步定量術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性，進(jìn)一步使用辛普森指數(shù)倒數(shù)(1/ds)統(tǒng)計(jì)每一個(gè)clone的頻率。這個(gè)指數(shù)的變化范圍從1到∞，該值越大表明所分析的樣本中所有clones的擴(kuò)增性程度越相近，同時(shí)多態(tài)性越高。例如，從dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種分辨率分析術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性，三種分辨率顯示對照組：dna水平：1/ds＝1.029；氨基酸和v-j組合水平：1.039；術(shù)后1天組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性：dna水平：1/ds≈1.011；氨基酸和v-j組合水平：1.018；術(shù)前一天組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性：dna水平：1/ds≈1.011；氨基酸和v-j組合水平：1.018；術(shù)后7天組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性(dna水平：1/ds≈1.002；氨基酸和v-j組合水平：1.012)，以上對比表明：與對照組比較，術(shù)前1天組及術(shù)后1天組的多態(tài)性相對抑制，在術(shù)后1天組及術(shù)后7天組之間tcrβ鏈cdr3多態(tài)性呈抑制趨勢。
進(jìn)一步地，對實(shí)驗(yàn)組術(shù)前1天組(pre-1)、術(shù)后1天組(post-1)、術(shù)后7天組(post-7)和對照組(nc)的t細(xì)胞免疫圖譜進(jìn)行測序，在術(shù)前1天組中獲得了5.52×105個(gè)核苷酸序列，對應(yīng)于5.09×105個(gè)氨基酸序列；在術(shù)后1天組中獲得了4.05×105個(gè)核苷酸序列，對應(yīng)于3.76×105個(gè)氨基酸序列；在術(shù)后7天組中獲得了5.31×105個(gè)核苷酸序列，對應(yīng)于4.93×105個(gè)氨基酸序列；而在對照組中 獲得了8.50×105個(gè)核苷酸序列，對應(yīng)于7.77×105個(gè)氨基酸序列(非冗余序列)。例如，將各組的所有個(gè)體的非冗余tcrβ序列視為一個(gè)整體，發(fā)現(xiàn)絕大部分的cdr3核苷酸序列(其中術(shù)前1天組96.92％，術(shù)后1天組96.77％，術(shù)后7天組97.45％和對照組97.75％)和氨基酸序列(其中術(shù)前1天組94.59％，術(shù)后1天組94.87％，術(shù)后7天組95.21％和對照組94.57％)只在獨(dú)立個(gè)體中發(fā)現(xiàn)。而有些序列卻被多個(gè)個(gè)體共有，在術(shù)前1天組中，29個(gè)dna序列和199個(gè)氨基酸序列被60％以上(n≥6)的個(gè)體所共有；在術(shù)后1天組中，38個(gè)dna序列和84個(gè)氨基酸序列被60％以上(n≥6)的個(gè)體所共有；在術(shù)后7天組中，31個(gè)dna序列和176個(gè)氨基酸序列被60％以上(n≥6)的個(gè)體所共有。而對照組中，91個(gè)dna序列和721個(gè)氨基酸序列被60％以上(n≥6)的個(gè)體所共有。其中，4個(gè)氨基酸序列存在于術(shù)前1天組中的所有標(biāo)本；4個(gè)核苷酸序列和9個(gè)氨基酸序列存在于術(shù)后7天組中的所有標(biāo)本；15個(gè)核苷酸序列和30個(gè)氨基酸序列存在于對照組的所有標(biāo)本。
表2各組中所有受試者共有的dna和aa序列
例如，對所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈進(jìn)行dna分析之后，還包括步驟：得到所述實(shí)驗(yàn)組及對照組的t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的圖譜模型得到圍手術(shù)期腎臟受體者的圖譜模型，例如，所述圖譜模型包括：術(shù)前1天組中4個(gè)氨基酸序列，分別為carvprav～ntgelff、cas～yf、cassqgyeqyf、csar～tqyf；術(shù)后7天組中4個(gè)核苷酸序列和9個(gè)氨基酸序列，4個(gè)核苷酸序列分別為tgcgccagggtccccagggctgtgcgaacaccggggagctgtttttt、tgtgctctggggccaacgtcctgactttc、tgtgctaactatggctacaccttc、tgcagtgctagagacccagtacttc，9個(gè)氨基酸序列分別為：casslggnteaff、casslsyeqyf、carvprav～ntgelff、casslgetqyf、canygytf、calg～vltf、csar～tqyf、cas～ff、caasrgc～akniqyf。
為了鑒定與圍手術(shù)期腎移植受者免疫狀態(tài)相關(guān)的trβv和trβj亞類，進(jìn)一步比較了受者術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組各組間trβv和trβj亞類表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，在50個(gè)βv基因亞類中，術(shù)前1天組中的trbv5-4(p＝0.049489)表達(dá)水平比對照組高；術(shù)后1天組中的trbv7-6(p＝8.73*10-4)，trbv7-7(p＝0.044)表達(dá)水平比術(shù)前1天組低；術(shù)后7天組的trbv16(p＝0.032)，trbv5-8(p＝0.049)，trbv6-6(p＝0.018)，trbv7-6(p＝0.004)和trbv7-7(p＝0.037)的表達(dá)水平跟術(shù)后1天組相比明顯增高。在13個(gè)jβ基因亞類中，術(shù)后1天組中的trbj1-4(p＝0.036)，trbj1-5(p＝0.013)，trbj2-4(p＝0.014)的表達(dá)水平比術(shù)前1天組低；術(shù)后7天組的trbj2-5(p＝0.032)，trbj2-6(p＝0.043)的表達(dá)水平跟術(shù)后1天組相比明顯增高。
為了鑒定與圍手術(shù)期腎移植受者免疫狀態(tài)相關(guān)的trβv和trβj亞類，進(jìn)一步比較了受者術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和正常對照組各組間trβv和trβj亞類表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，在50個(gè)βv基因亞類中，術(shù)前1天組中的trbv5-4(p＝0.049489)表達(dá)水平比對照組高；術(shù)后1天組中的trbv7-6(p＝8.73*10-4)，trbv7-7(p＝0.044)表達(dá)水平比術(shù)前1天組低；術(shù)后7天組的trbv16(p＝0.032)，trbv5-8(p＝0.049)，trbv6-6(p＝0.018)，trbv7-6(p＝0.004)和trbv7-7(p＝0.037)的表達(dá)水平跟術(shù)后1天組相比明顯增高。在13個(gè)jβ基因亞類中，術(shù)后1天組中的trbj1-4(p＝0.036)，trbj1-5(p＝0.013)，trbj2-4(p＝0.014)的表達(dá)水平比術(shù)前1天組低；術(shù)后7天組的trbj2-5(p＝0.032)，trbj2-6(p＝0.043)的表達(dá)水平跟術(shù)后1天組相比明顯增高。
例如，所述圍手術(shù)期腎臟受體者的圖譜模型包括：6個(gè)trβv和6個(gè)trβj亞類，所述6個(gè)trβv亞類分別為trbv5-4，trbv7-6，trbv7-7，trbv16，trbv5-8及trbv6-6，所述5個(gè)trβj亞類分別為trbj1-4，trbj1-5，trbj2-4，trbj2-5及trbj2-6。
上述處理方法通過高通量測序?yàn)榛A(chǔ)對圍手術(shù)腎移植受者已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞tcr的cdr3區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期腎臟受體的部分trβv和trβj亞類的表達(dá)與正常人存在一定差異，且發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期腎移植受者中存在特定的共有序列，這些共有序列是疾病的潛在生物標(biāo)志物，對疾 病診斷、病情判斷及預(yù)后評估有重要價(jià)值。然而，本文的研究數(shù)據(jù)只是初步階段，該圖譜模型只能夠作為后續(xù)分析診斷的參考依據(jù)，如何利用該圖譜模型還有待于進(jìn)一步的醫(yī)學(xué)研究，需要更多的標(biāo)本數(shù)以及更深入的研究才有可能作為更進(jìn)一步的參考依據(jù)。
上述t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的處理方法，設(shè)計(jì)合理可行，能夠有效地獲取作為中間結(jié)果的圍手術(shù)期腎移植受者相關(guān)信息，可用于圍手術(shù)期腎移植受者免疫狀態(tài)的后續(xù)分析，對這些信息進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證分析和研究有助于研究排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制并指導(dǎo)免疫抑制藥物的個(gè)體化合理應(yīng)用，進(jìn)而有助于提高腎移植受者和移植物術(shù)后的短期及長期存活率。
需要補(bǔ)充的是，本發(fā)明的直接目的不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只是對已經(jīng)脫離人體的體液，即外周血，進(jìn)行處理或檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息的方法，或處理該信息的方法，根據(jù)目前的醫(yī)學(xué)知識(shí)和本發(fā)明所公開的內(nèi)容，從所獲得的信息本身不能夠直接得出疾病的診斷結(jié)果，但是采用對所述實(shí)驗(yàn)組及對照組中t細(xì)胞受體β鏈進(jìn)行dna分析的結(jié)果或所述實(shí)驗(yàn)組及對照組的t細(xì)胞抗原受體β鏈cdr3的圖譜模型，能夠作為中間數(shù)據(jù)對圍手術(shù)期腎移植受者的急性排斥反應(yīng)作出進(jìn)一步研究，以有利于移植受者和移植物的長期存活。
以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。