本發(fā)明涉及一種獲取作為中間結(jié)果的圍手術(shù)期肝移植受者信息，特別是涉及一種tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法。
背景技術(shù)：
肝硬化(livercirrhosis，lc)是一種常見的慢性肝病，是由單一的或很多種致病因素持續(xù)作用于肝臟，引起肝臟實質(zhì)彌漫性損傷等進一步引起一系列肝功損傷，最終發(fā)展成門脈高壓或晚期肝病的結(jié)局。其特點是主要由于肝細胞變性壞死，殘存的肝細胞結(jié)節(jié)再生以及纖維組織再生，導(dǎo)致肝變形變硬等，已超出肝細胞的代償能力。其主要發(fā)病機制是發(fā)生了肝纖維化。肝纖維化是由于肝組織內(nèi)細胞外的膠原纖維發(fā)生了持續(xù)大量的增殖，從而不斷擠壓肝細胞并逐漸將其包圍起來形成纖維隔，最終導(dǎo)致肝結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生了病理性改變的結(jié)果。按照臨床表現(xiàn)情況不同肝硬化可分為代償期(早期)和失代償期(晚期)，并且它們的分界線不明顯而且常呈現(xiàn)重疊征象。代償期癥狀較輕常缺乏特異性，一般沒有明顯的臨床表現(xiàn)，甚至身體上也沒有感覺到任何的不適，主要以疲倦乏力、消瘦、腹部脹氣、腹瀉、上腹不適及隱痛為主，行肝功能檢查時各項指標可在正常范圍內(nèi)或出現(xiàn)輕度異常，這種情況多見于小結(jié)節(jié)性肝硬化；失代償期癥狀顯著，常伴隨各種并發(fā)癥出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為肝功能衰退，常伴有多器官功能受損、黃疸、門脈高壓、脾大、腹水、肝性腦病或上消化道出血等，行肝功能檢查時各指標明顯異常，多見于大結(jié)節(jié)性肝硬化，因此，臨床上通常將血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能和腹水常規(guī)以及必要條件下結(jié)合影像學(xué)檢查來診斷肝硬化，而且從它們的各項指標的檢查以及臨床表現(xiàn)可不難判斷失代償期肝硬化，但代償期肝硬化的診斷卻比較艱難。
而失代償期乙型肝炎肝硬化主要是因為乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)持續(xù)感染患者并反復(fù)作用于病灶部位導(dǎo)致肝細胞受損嚴重、不斷凋亡等而導(dǎo)致肝功能受到嚴重破壞而引起機體的一系列生理病理的改變，出現(xiàn)黃疸、食管靜脈曲張、腹水、肝腦疾病和脾臟腫大等臨床特征。在我國，乙型病毒性肝炎是引起肝硬化的主要因素，其次是丙型病毒性肝炎，其中慢性乙型肝炎病毒感染已成為全世界公共健康衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球每年約有100萬人死于hbv感染所致肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌，嚴重影響我國居民身體健康和國民經(jīng)濟，阻止患者疾病病情的發(fā)展并降低病死率的重要手段就是進行準確的診斷和早期及時進行治療。有文獻報道，有40％以上的慢性乙型肝炎病毒感染的患者會發(fā)展成嚴重的并發(fā)癥，約12％的乙肝肝硬化患者死于肝衰竭，10％左右的死于肝癌。由于臨床表現(xiàn)的多樣性和復(fù)雜的病理過程以及代償期與失代償期之間的分界不明顯甚至出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，給疾病早期及準確的診斷提出了巨大的挑戰(zhàn)。使得失代償期乙肝肝硬化的預(yù)后很差，并且多半患者在5年內(nèi)病情發(fā)展急速惡化，只有約14％的患者有5年以上的存活率。
目前，肝移植是治療晚期不可逆肝病患者唯一的方法，給患者提供了一個再生的機會，但由于供肝資源短缺以及配型不符等問題使得世界各地的許多失代償期乙肝肝硬化患者無法獲得或者沒有資格獲得這種治療方式，而對這些病人唯一的救治方法就是進行抗病毒治療。抗病毒治療是抑制慢性乙肝肝硬化患者和失代償期乙肝患者體內(nèi)hbv的復(fù)制來減少肝臟壞死性炎癥反應(yīng)并改善其肝功能情況。近十多年肝移植術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑的問世以及移植收術(shù)的提高，我國每年的移植病例數(shù)不斷在增加，在美國每年所完成的肝移植病例數(shù)中，約5％都是乙肝肝移植，這比例在亞太地區(qū)已經(jīng)是比較高的。自從1963年美國starzl進行了第1例人體原位肝移植到現(xiàn)在，無論在移植的數(shù)量還是移植的數(shù)量和臨床療效方面都取得了很大的成就。但是隨著移植數(shù)量的積累，肝移植后出現(xiàn)的排斥反應(yīng)等各種并發(fā)癥仍然避免不了，其中與免疫相關(guān)的問題成為影響術(shù)后生存率的主要因素。大部分乙肝患者以及行肝移植后手術(shù)患者都是通過抗病毒藥物和免疫抑制劑進行治療，但因為長期使用這類藥物會造成免疫力降低，從而使得患者更易受到其他病原體的感染，還會發(fā)生耐藥，一旦出現(xiàn)耐藥就會降低療效，甚至?xí)?dǎo)致病情加重。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于此，有必要針對上述問題，提供一種圍手術(shù)期肝移植受者tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法。
一種tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法，包括以下步驟：
設(shè)置實驗組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標本；
分離各所述外周血標本的淋巴細胞，并分別提取所述外周血標本淋巴細胞中的dna；
采用多重pcr技術(shù)，構(gòu)建dna文庫；
對所述dna文庫進行高通量測序，對所述實驗組及對照組中的tcrβ鏈互補決定區(qū)進行數(shù)據(jù)分析。
在其中一個實施例中，采用多重pcr技術(shù)之前，所述處理方法還包括測定dna的含量以及檢測dna完整性的步驟。
在其中一個實施例中，采用熒光分析法測定dna的含量。
在其中一個實施例中，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測dna完整性。
在其中一個實施例中，利用illuminamiseq平臺對dna文庫進行高通量測序。
在其中一個實施例中，采用多重pcr技術(shù)，構(gòu)建dna文庫，其具體包括：
計算所述實驗組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物進行多重pcr；
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
加入末端修護混合液進行末端修護反應(yīng)，并純化；
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
在接頭連接反應(yīng)體系中進行接頭連接；
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。
在其中一個實施例中，構(gòu)建dna文庫后，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進行定量。
在其中一個實施例中，對所述實驗組及對照組中的tcrβ鏈互補決定區(qū)進行數(shù)據(jù)分析包括：對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和預(yù)處理、對數(shù)據(jù)進行比對分析、對序列結(jié)構(gòu)進行分析、構(gòu)建免疫組庫及對免疫組庫進行差異分析。
在其中一個實施例中，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和預(yù)處理包括：對測序后的數(shù)據(jù)進行過濾處理。
在其中一個實施例中，采用ficoll密度梯度離心法分離出所述外周血標本的淋巴細胞。
上述tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法，設(shè)計合理可行，綜合分析失代償期乙肝肝硬化患者移植手術(shù)前后其體內(nèi)tcrβ鏈互補決定區(qū)受體庫動態(tài)變化特征，可了解病人的免疫狀態(tài)，為移植后疾病情況的監(jiān)測進行指導(dǎo)用藥，預(yù)防術(shù)后出現(xiàn)排斥、感染，并為疾病的發(fā)病機制提供依據(jù)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明一實施例中tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法的流程示意圖。
具體實施方式
為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
請參閱圖1，本發(fā)明的一個實施例是，一種tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法，其包括如下步驟。
s110、設(shè)置實驗組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標本，例如，所述實驗組包括術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組。
例如，本發(fā)明各實施例實驗組采用的外周血標本，分別來自于桂林市解放軍第181醫(yī)院器官移植與透析治療中心住院并經(jīng)確診為乙肝肝硬化終末期進行肝移植手術(shù)的患者6例和在南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第181醫(yī)院同一時間段體檢的健康者6例。
其中實驗組6例，女性2例，男性4例，年齡44～60歲，平均年齡48.67±6.31歲。
健康對照組6例，其中女性3例，男性3例，年齡為35～50歲，平均年齡44.17±5.85歲，為南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第181醫(yī)院同一時間段體檢的健康者，無重大疾病史，無免疫方面的相關(guān)疾病，本人及其直系親屬無乙肝病史、無自身免疫性疾病。
例如，在室溫條件下，獲取脫離人體的外周靜脈血3～4ml置于5mledta抗凝真空采血管，蓋上蓋子后，將edta抗凝真空采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次后，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２杉總€健康對照者外周肝素抗凝靜脈血約5ml，每個腎移植受者于術(shù)前1天、術(shù)后1天、術(shù)后7天共3個時間點各采集外周肝素抗凝靜脈血5ml，一共24個標本，每個標本在收集后當天分離出淋巴細胞。
s120、分離各所述外周血標本的淋巴細胞，并分別提取所述外周血標本淋巴細胞中的dna。
例如，采用ficoll密度梯度離心法分離出所述外周血標本的淋巴細胞，通過使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離，得到所述外周血標本的淋巴細胞。。
又如，步驟s120包括如下步驟：
(1)吸取1ml外周血至2.0ml的離心管中，加入1ml紅細胞裂解液并漩渦振蕩器混勻。
(2)放入離心機中，25℃的條件下，以12000rpm離心10min，。
(3)靜置分層后，棄去上清液，加入900μl的核細胞裂解液，50μl的20mg/ml的蛋白酶k和50μl的10％sds，混勻并置于恒溫混勻器中裂解1h。
(4)裂解完成后迅速冷卻，加入1ml酚/氯仿/異戊醇，上下顛倒混勻至無明顯界線。
(5)在25℃的條件下，以12000rpm離心10min，靜置，然后吸取900μl上清液置于1.5ml的離心管中，并加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇和10％3m醋酸鈉，上下顛倒混勻數(shù)次，接著放置于-20℃的冰箱中過夜。
(6)在25℃的條件下，以12000rpm離心10min，靜置。
(7)棄去上清液，加入750μl75％的乙醇，洗滌dna沉淀。
(9)在25℃的條件下，以12000rpm離心5min，靜置，棄去上清液，自然晾干。
(10)收集dna并于-80℃的條件下保存待用。
s130、測定中dna含量及完整性。
例如，步驟s130包括如下步驟：
s131、測定dna含量，例如，采用熒光分析法測定dna的含量。
具體地，步驟s131包括如下步驟：
配制dna染料工作液；
例如，dna染料為quant-ittmreagent，通過用quant-ittmbuffer將其稀釋200倍得到quant-ittmworkingsolution。
制備標準品溶液，并制作標準曲線；
例如，分別取quant-ittmstandard1(100ng/μl)和quant-ittmstandard2(100ng/μl)0～10μl混合后，其中quant-ittmstandard1和quant-ittmstandard2的總體積為10μl，再與190μlquant-ittmworkingsolution混合后，按照
將dna待測液與dna染料工作液混合，室溫靜置2分鐘后，進行熒光檢測；
分別取2～20μl的dna待測液與180～198μl的quant-ittmworkingsolution混合后，其中，dna待測液與quant-ittmworkingsolution總體積為200μl，室溫靜置2分鐘，使dna與染料充分結(jié)合，然后置于
根據(jù)標準曲線，計算得出dna待測液的dna含量。
s132、測定dna完整性，例如，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定dna的完整性。又如，測定dna待測液的完整性包括如下步驟。
具體地，稱0.6g取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置于微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化并搖勻，制成0.6％的瓊脂糖凝膠，等到瓊脂糖凝膠溶液的溫度降到到55℃左右時小心倒入電泳槽水平板上，并注意不要倒?jié)M至溢出，待瓊脂糖凝膠凝固后向電泳槽中加入適量的電泳緩沖液，然后拔出即可；將dna待測液在冰上融化后，充分混勻后離心；取3μldna樣品與加樣緩沖液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μldnamarker，選用0.6％的瓊脂糖凝膠在120v電壓下電泳50分鐘，電泳至溴酚藍在凝膠中遷移出適當距離，切斷電流，取出凝膠，在紫外燈下檢查并掃描圖像。
s140、采用多重pcr技術(shù)，構(gòu)建dna文庫。
例如，步驟s140具體包括：
計算所述實驗組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物進行多重pcr；
例如，取dna含量為500ng的所述dna待測液，加入預(yù)設(shè)計的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物后用qiagenmultiplexpcrkit進行多重pcr，進行30循環(huán)(cycles)。值得說明的是，采用略長一些的引物具有較好的擴增效果，例如，預(yù)設(shè)計的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物較常規(guī)的引物長15～20個堿基；例如，預(yù)設(shè)計的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物延長15～20個堿基設(shè)置；又如，預(yù)設(shè)計的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物較常規(guī)的引物增長15～20個堿基。
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
例如，電泳檢測回收100～190bp的多重pcr產(chǎn)物，并使用qiaquickgelextractionkit進行回收。
加入末端修護混合液進行末端修護反應(yīng)，并純化；
例如，在20℃條件下，加入10×endrepairbuffer及endrepairmix，進行末端修復(fù)反應(yīng)，并使用qiaquickpcrpurificationkit進行純化。
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
例如，利用nebnextda-tailingmodule在已補平末端的dna片段3’端加入腺嘌呤(a)。又如，在37℃的條件下，加入nebnextda-tailingbuffer及nebnextda-tailingenzyme，反應(yīng)30分鐘。又如，增加體系中的聚合酶的用量，例如，較常規(guī)的聚合酶的用量增加200％～300％；即，聚合酶的用量設(shè)計為常規(guī)用量的300％～400％。
在接頭連接反應(yīng)體系中進行接頭連接；優(yōu)選的，在反應(yīng)中，根據(jù)之前反應(yīng)效果提升緩沖鹽的濃度。
例如，用adapteroligomix和dnaligase配制接頭連接反應(yīng)體系進行接頭連接。
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。為提升切取效果，優(yōu)選的，解鏈溫度大于67攝氏度；又如，解鏈溫度為67攝氏度～70攝氏度，又如，之后降溫處理，例如，降至室溫。
在本實施例中，將接頭連接后的產(chǎn)物pcr擴增后，對pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，使用qiaquickgelextractionkit進行膠純化回收，溶于洗脫緩沖液中。
在本發(fā)明一實施例中，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進行定量。
例如，檢測所述基因文庫包括檢測所述基因文庫的插入片段范圍及定量測定所述基因文庫的濃度。又如，使用agilent2100bioanalyzer(agilentdna1000reagents)檢測文庫的插入片段范圍，又如，使用abisteponeplusreal-timepcrsystem(taqmanprobe)對文庫進行濃度的定量。
s150、對所述dna文庫進行高通量測序，對所述實驗組及對照組中的tcrβ鏈互補決定區(qū)進行數(shù)據(jù)分析。
對所述dna文庫進行高通量測序，對所述實驗組及對照組中的tcrβ鏈互補決定區(qū)進行數(shù)據(jù)分析，包括以下步驟：分析對照組和失代償期乙肝肝硬化患者術(shù)前1天、術(shù)后1、7天外周血淋巴細胞中tcrβ鏈的cdr3區(qū)多樣性、長度分布特征各以及各基因家族的表達頻率、堿基插入缺失情況和v-j配對；篩選出對照組和失代償期乙肝肝硬化患者術(shù)前1天、術(shù)后1天、術(shù)后7天中高度克隆性擴增(頻率大于0.5％)的氨基酸序列(aa)，dna序列和v-j組合；并根據(jù)distinct(uniq)clone數(shù)和辛普森系數(shù)去分析失代償期乙肝肝硬化患者術(shù)前1天、術(shù)后1、術(shù)后7天和nc組的tcr多樣性和克隆表達差異。
例如，按照預(yù)期上機數(shù)據(jù)量，在檢測合格的基因文庫加入0.5mmol/l的naoh溶液，變性30分鐘，使雙鏈dna片段變性形成單鏈dna。并將變性后的文庫加入到flowcell內(nèi)，與flowcell上的接頭進行雜交，然后在簇生成平臺cbot上結(jié)合truseqpeclusterkitv3-cbot-hs試劑完成橋式pcr擴增。最后將制備好的flowcell采用hiseq2000測序系統(tǒng)和truseqsbskit-hsv3試劑進行上機測序。
例如，測序后還包括：對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和預(yù)處理、對所述測序數(shù)據(jù)進行比對分析、對序列結(jié)構(gòu)進行分析、構(gòu)建免疫組庫、免疫組庫差異性分析及統(tǒng)計學(xué)分析。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和預(yù)處理具體包括：在所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進行分析數(shù)據(jù)下機后，首先對原始數(shù)據(jù)做過濾處理，過濾的過程中，首先過濾掉含有接頭的序列；將平局質(zhì)量低于15(illumina0-41質(zhì)量體系)的reads去掉；對于未知堿基(n堿基)，要求堿基數(shù)不能多于5％；針對序列尾部質(zhì)量較差的序列，在對低質(zhì)量部分(質(zhì)量小于10的堿基)截取，保證截取后的序列平均質(zhì)量高于15，同時，截取后剩余序列的長度要求不小于60。根據(jù)以上過濾條件，獲得過濾后的cleandata。過濾完成后，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig(片段重疊群)，在讀長是100的情況下，拼接過程分為兩步：1、將兩條序列的尾部比對，尋找匹配序列，這樣的拼接需要最小10個堿基的重疊，重疊區(qū)域堿基的匹配率要不小于90％；2、鑒于免疫組庫捕獲區(qū)域的長短不同，在某些情況下會存在端序列被測通的情況，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，嘗試用頭部將其繼續(xù)拼接，經(jīng)過前面的數(shù)據(jù)處理后便可得到最終的合并后的序列及合并的序列contig的長度分布圖。
例如，利用高通量測序方法(illumina2000基因組分析儀)，對實驗組術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組共24標本的外周血tcrβ鏈互補決定區(qū)進行測序。對照組中平均每個樣本獲得17769012.83條總讀長(totalreads)，術(shù)前1天組中平均每個樣本獲得16499515.8條總讀長，術(shù)后1天組中平均每個樣本獲得17158190.3條總讀長，術(shù)后7天組中平均每個樣本獲得20811576.2條總讀長。然后對這些原始數(shù)據(jù)做過濾處理(過濾掉含有接頭、平均質(zhì)量低于15以及未知堿基(n堿基)多于5％的讀長reads)，得到的結(jié)果：對照組的平均過濾率為4.37％，術(shù)前1天組的平均過濾率為11.27％，術(shù)后1天組的平均過濾率為18.70％，術(shù)后7天組的平均過濾率為11.82％。過濾完成后，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig，最終得到合并后的完整優(yōu)質(zhì)序列。對照組中平均有9446150.2條優(yōu)質(zhì)序列(totalgoodsequences)，術(shù)前1天組中平均有9090364.7條優(yōu)質(zhì)序列，術(shù)后1天組中平均有8385257.2條優(yōu)質(zhì)序列，術(shù)后7天組中平均有12796683.8條優(yōu)質(zhì)序列。而對照組的平均克隆(clones)數(shù)為79360.7個，術(shù)前1天組的平均克隆(clones)數(shù)為46274.5個，術(shù)后1天組的平均克隆(clones)數(shù)為28850.8個，術(shù)后7天組的平均克隆(clones)數(shù)為80009.5個。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進行比對分析具體包括：使用milaboratory開發(fā)的mitcr對t細胞受體進行自動校正，校正由pcr、測序等原因帶來的序列錯誤。比對完成后，自動統(tǒng)計互補決定區(qū)克隆的表達及插入缺失情況。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進行分析具體包括：根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，得到比對得到v基因序列的最后位點，d基因的起始位點，d基因的終止位點及j基因的起始位點，通過位點信息找到v-d-j插入缺失的堿基并統(tǒng)計其長度分布。根據(jù)比對找到的互補決定區(qū)，并統(tǒng)計互補決定區(qū)序列的長度分布。
又如，對6個乙肝后肝硬化失代償期患者圍手術(shù)期三個時間點(術(shù)前1天、術(shù)后1天及術(shù)后7天)和6個正常健康者外周血的tcrβ鏈的互補決定區(qū)(cdr3)、vdindel以及djindel長度分布進行統(tǒng)計并求平均值，發(fā)現(xiàn)在術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組中，根據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)tcrβcdr3的長度分布在16nt～106nt之間，并且發(fā)現(xiàn)乙肝后肝硬化失代償期患者移植前后中分布頻率最大的5個cdr3長度是：其中在術(shù)前1天組中為42，39，45，36和48nt，在術(shù)后1天組中為42，45，39，48和36nt，在術(shù)后7天組中為42，45，39，36和48nt，對照組中5個頻率最大的cdr3長度為42，45，36，39，48nt；djindel長度分布在-1～68nt間，其中乙肝后肝硬化患者各個組中分布頻率最大的5個djindel長度分別是：在術(shù)前1天組中為0，2，3，1和4nt，術(shù)后1天組中為0，2，3，1，和4nt，術(shù)后7天組中為0，2，3，1和4nt，而在對照組中，頻率最大的5個djindel長度是0，3，2，1及4nt；vdindel長度分布為-1～73nt區(qū)間，其中術(shù)前1天組中分布頻率最大的5個vdindel長度為0，3，2，1和4nt，術(shù)后1天組中為0，2，3，1和4nt，術(shù)后7天組中為0，3，2，4和1nt，對照組中5個頻率最大的vdindel長度為1，0，2，3和4nt；根據(jù)前面的分析結(jié)果可知，乙肝后肝硬化失代償期患者移植前1天、移植后1天及移植后7天的外周血單個核細胞中tcrβcdr3、djindel、vdindel長度分布頻率和對照組中的分布頻率相類似，沒有顯著的差異。
例如，對所述測序結(jié)果進行分析還包括：
1、免疫組庫的構(gòu)建，其具體包括：根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，統(tǒng)計每一個克隆的表達情況，分別統(tǒng)計dna序列，氨基酸序列，v-j組合三種不同分辨率情況下得到的各個樣本的表達情況。例如，為了衡量樣品的多樣性，分別統(tǒng)計和計算各個樣本的distinctclone數(shù)，辛普森系數(shù)及香農(nóng)威納系數(shù)，三個系數(shù)分別針對dna、氨基酸、v-j組合三種不同的分辨率。對于每一個樣本中每個克隆的表達情況，按照dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種不同分辨率統(tǒng)計每個克隆的表達。篩選出各細胞亞群的高度克隆性擴增(頻率大于0.5％)的dna序列，氨基酸序列，v-j組合。
2、免疫組庫的差異分析，其主要包括：樣本多樣性差異和克隆表達差異兩部分。其中，樣本多樣性差異旨在找出樣品間整體克隆表達模式的差別，表達差異則旨在找出差異顯著的克隆。樣本多樣性差異首先針對的是每個樣本計算出的多樣性系數(shù)，即distinct(uniq)clone數(shù)，辛普森和香農(nóng)威納系數(shù)。根據(jù)不同組間樣本屬性，針對的是dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種分辨率，統(tǒng)計計算差異顯著性。進一步地，在dna序列、氨基酸序列和v-j組合三個層面進行分析，使用泊松分布等相應(yīng)的檢驗方案計算出每一個差異對的p值，同時使用fdr和bonferroni對p值做校正。
例如，將克隆擴增程度劃分為≥0.5％，0.05～0.5％，0.005～0.05％，0.0005～0.005％和<0.0005％五個等級，定義克隆頻率大于0.5％的clones為高度擴增性克隆(highlyexpandedclones，hec)，并從dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種不同分辨率統(tǒng)計每個克隆的克隆擴增程度。每一個clone的克隆性擴增程度的計算方法是：該clone在測試樣本中出現(xiàn)的次數(shù)/該樣本的總totalgoodsequences數(shù)。在dna序列中，發(fā)現(xiàn)實驗組術(shù)前1天組(pre)、術(shù)后1天組(post1)、術(shù)后7天組(post7)和對照組(nc)的高度擴增性克隆數(shù)(highlyexpandedclones，hecs)分別為49、43、41和14個；對應(yīng)的在氨基酸序列中，術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的高度擴增性克隆數(shù)分別為49、43、41和14個；在v-j組合中，術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的高度擴增性克隆數(shù)分別292個、299個、304個和232個。在dna和氨基酸序列中，術(shù)后7天組中的高度擴增性克隆數(shù)比對照組、術(shù)前1天組和術(shù)后1天組都少，而在v-j組合中其高度擴增性克隆數(shù)為最多。在所有clones中，高度擴增性克隆(hecs)所占的比例很小。以dna序列為例，在nc組中克隆頻率≥0.5％的clones有1.11×10-2％，而在pre組中hec在所有的clones中所占的比例為4.99×10-2％，同樣，在post1、post7中分別有3.35×10-2％和3.86×10-3％的clones屬于hec，根據(jù)分析結(jié)果可以知道，這四個組之間沒有顯著性差異(p＝0.180＞0.05)。但從整體克隆性擴增程度方面去分析，可發(fā)現(xiàn)pre、post1、post7三個患者組中克隆頻率分布在≥0.5％，0.05～0.5％及0.005～0.05％區(qū)間的clones數(shù)量顯著多于nc組，而在0.0005～0.005％區(qū)間卻明顯比nc組少，這揭示了pre、post1、post7患者組中的克隆性擴增程度比對照組明顯要高。
為了進一步定量術(shù)前1天組，術(shù)后1天組，術(shù)后7天組和對照組的tcrβ鏈cdr3多態(tài)性，進一步使用辛普森(simpson)指數(shù)倒數(shù)(1/ds)統(tǒng)計每一個clone的頻率。這個指數(shù)的變化范圍從1到∞，在該范圍中的1表明樣本中所有個體clones的擴增程度不均勻，多樣性最??；∞則相反，表示樣本clones的擴增程度較均勻，其多樣性最大，即simpson系數(shù)的值越大說明樣本所有的克隆的擴增性程度越均勻，其多樣性就越高。例如，從dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種分辨率分析術(shù)前1天組、術(shù)后1天組、術(shù)后7天組和對照組的tcrβ鏈cdr3多樣性，三種分辨率顯示對照組：dna水平：1/ds＝1.023；氨基酸和v-j組合水平：1.031；術(shù)前1天組的tcrβ鏈cdr3多樣性：dna水平：1/ds≈1.007；氨基酸和v-j組合水平：1.017；術(shù)后一天組的tcrβ鏈cdr3多樣性：dna水平：1/ds≈1.005；氨基酸和v-j組合水平：1.014；術(shù)后7天組的tcrβ鏈cdr3多樣性：dna水平：1/ds≈1.001；氨基酸和v-j組合水平：1.009)，以上對比表明：與對照組比較，術(shù)前1天組及術(shù)后1天組的多樣性相對抑制，在術(shù)后1天組及術(shù)后7天組之間tcrβ鏈cdr3多樣性呈抑制趨勢。
可以理解，對于多樣性高的樣品，其表達也相對均勻。根據(jù)前面的分析，在nc組、pre患者組、post1患者組和post7組中分別有50、43、41和14個hecs，進一步分別對nc組、pre組、post1組和post7組組內(nèi)不同個體或者是組間是否存在共有的hecs進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個個體都存在一個獨特的組庫，這些組庫之間少一部分重疊。同時不同個體之間在dna序列和氨基酸序列中并沒有共同的hecs，而在nc組、pre組、post1組和post7組組間也沒有共同的hecs；相反，在v-j組合中卻發(fā)現(xiàn)nc組、pre組、post1組和post7患者組組內(nèi)不同個體之間以及組間都存在在很多頻率不一致的共有組合。
上述tcrβ鏈互補決定區(qū)的處理方法，設(shè)計合理可行，綜合分析失代償期乙肝肝硬化患者移植手術(shù)前后其體內(nèi)tcrβ鏈互補決定區(qū)受體庫動態(tài)變化特征，可了解病人的免疫狀態(tài)，為移植后疾病情況的監(jiān)測進行指導(dǎo)用藥，預(yù)防術(shù)后出現(xiàn)排斥、感染，并為疾病的發(fā)病機制提供依據(jù)。
需要補充的是，本發(fā)明的直接目的不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只是對已經(jīng)脫離人體的體液，即外周血，進行處理或檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息的方法，或處理該信息的方法，根據(jù)目前的醫(yī)學(xué)知識和本發(fā)明所公開的內(nèi)容，從所獲得的信息本身不能夠直接得出疾病的診斷結(jié)果，但是采用對所述實驗組及對照組中tcrβ鏈進行dna分析的結(jié)果或所述實驗組及對照組的t細胞抗原受體β鏈互補決定區(qū)的分析結(jié)果，能夠作為中間數(shù)據(jù)對圍手術(shù)期肝移植受者的急性排斥反應(yīng)作出進一步研究，以有利于移植受者和移植物的長期存活。
以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。