本發(fā)明涉及標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法及其中所用的試劑盒。更具體而言,涉及基于載體上的該標(biāo)靶分子與抗體的抗原抗體反應(yīng)來檢測(cè)標(biāo)靶分子的方法。
背景技術(shù):
:以各種疾病的早期診斷為目的,希望有用于高靈敏度地檢測(cè)低濃度地存在于生物體樣品中的疾病標(biāo)記(生物標(biāo)記)的生物傳感技術(shù)。例如,在從體積1mm3的腫瘤中所含的100萬個(gè)癌細(xì)胞的各個(gè)細(xì)胞向5l的血中分泌出100分子的生物標(biāo)記的情況下,生物標(biāo)記的血中濃度為30am左右。希望有能夠檢測(cè)此種非常低濃度的標(biāo)靶分子的技術(shù)。非專利文獻(xiàn)1中,記載有使用單分子的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。該方法中,利用由蛋白特異性抗體覆蓋的微細(xì)的球珠來捕捉微量的蛋白質(zhì),對(duì)球珠與蛋白質(zhì)的復(fù)合體進(jìn)行熒光標(biāo)記。將包含該復(fù)合體的球珠利用離心力導(dǎo)入反應(yīng)室,計(jì)數(shù)捕捉到蛋白質(zhì)的球珠的個(gè)數(shù),由此定量地測(cè)定蛋白質(zhì)。專利文獻(xiàn)1中,作為“單分子數(shù)字式計(jì)數(shù)器件”,公開有能夠超高密度地形成微小的液滴的微陣列器件。通過在微小體積的液滴中進(jìn)行elisa,可以將來自于標(biāo)靶分子的信號(hào)二值化而進(jìn)行測(cè)定(數(shù)字式elisa法)。具體而言,首先,使標(biāo)靶分子、對(duì)捕捉抗體進(jìn)行了表面修飾的球珠、以及檢測(cè)抗體反應(yīng),在球珠表面上形成“捕捉抗體-標(biāo)靶分子-檢測(cè)抗體”的復(fù)合體。在標(biāo)靶分子的濃度低的情況下,各個(gè)球珠會(huì)是僅結(jié)合有1個(gè)復(fù)合體、或完全沒有結(jié)合復(fù)合體的某一種。然后,向微陣列器件中形成的多個(gè)微小液滴中分別各封入1個(gè)球珠。此后,計(jì)數(shù)發(fā)出來自于檢測(cè)抗體的信號(hào)的液滴的個(gè)數(shù)而作為標(biāo)靶分子的個(gè)數(shù)。由此,就可以將來自于標(biāo)靶分子的信號(hào)二值化為0或1,高靈敏度并且高精度地進(jìn)行標(biāo)靶分子的檢測(cè)及定量。與本發(fā)明相關(guān),在專利文獻(xiàn)2中,公開過如下的方法,即,在酶免疫檢查法中,使用限制性酶作為與目的物質(zhì)反應(yīng)的抗體的標(biāo)記,利用復(fù)合體的限制性酶切割具有限制性酶的切割堿基序列的dna鏈,分析測(cè)定該被切割了的dna鏈片段,由此檢測(cè)目的物質(zhì)?,F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2012/121310號(hào)專利文獻(xiàn)2:日本特開平7-270418號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:davidmrissinetal.,naturebiotechnology:doi:10.1038/nbt.1641技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:發(fā)明所要解決的問題在如上所述地利用基于elisa的單分子數(shù)字式計(jì)數(shù)來測(cè)定標(biāo)靶分子的情況下,一旦產(chǎn)生來自于非特異性地吸附在球珠上的檢測(cè)抗體的噪音,就無法準(zhǔn)確地將來自于標(biāo)靶分子的信號(hào)二值化,定量性降低。因而,本發(fā)明的主要目的在于,提供一種技術(shù),用于排除因檢測(cè)抗體的非特異性吸附而產(chǎn)生的噪音,高靈敏度并且高精度地檢測(cè)來自于標(biāo)靶分子的信號(hào)。用于解決問題的方法為了解決上述的問題,本發(fā)明提供以下的[1]~[8]。[1]一種標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法包括:復(fù)合體形成步驟,使標(biāo)靶分子、載體和第二抗體反應(yīng),在所述載體上形成由所述第一抗體、所述標(biāo)靶分子和所述第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體,其中,所述載體被修飾有與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體,所述第二抗體是與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的、被標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的兩個(gè)以上的抗體,且所述酶的底物特異性彼此不同;檢測(cè)步驟,使底物與所述復(fù)合體反應(yīng),檢測(cè)從所述熒光物質(zhì)中發(fā)出的熒光,其中,所述底物是具有所述酶的切割位點(diǎn)的、在該切割位點(diǎn)的一端側(cè)結(jié)合有熒光物質(zhì)、在另一端側(cè)結(jié)合有猝滅劑的兩個(gè)以上的底物,且所述熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)彼此不同。[2]根據(jù)[1]所述的檢測(cè)方法,其中,包括分析步驟,將熒光波長(zhǎng)不同的兩個(gè)以上的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為所述標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理。[3]根據(jù)[1]或[2]的檢測(cè)方法,其中,在所述復(fù)合體形成步驟與所述檢測(cè)步驟之間,包括封入步驟,向形成于基板上的液滴中分別各封入一個(gè)所述載體。[4]根據(jù)[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其中,所述載體為微球。[5]根據(jù)[1]~[4]中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其中,所述第一抗體和所述第二抗體結(jié)合于所述標(biāo)靶分子的不同的表位。[6]根據(jù)[1]~[5]中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其為數(shù)字式elisa法。[7]一種標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法包括:復(fù)合體形成步驟,使標(biāo)靶分子、載體和第二抗體反應(yīng),在所述載體上形成由所述第一抗體、所述標(biāo)靶分子和所述第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體,其中,所述載體被修飾有與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體,所述第二抗體是與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合、且被進(jìn)行了彼此不同的標(biāo)記的兩個(gè)以上的抗體;檢測(cè)步驟,檢測(cè)來自于所述標(biāo)記的信號(hào);以及分析步驟,將來自于不同的兩個(gè)以上的所述標(biāo)記的所述信號(hào)作為所述標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理。[8]一種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)試劑盒,其包含載體、第二抗體、和底物而成,所述載體被修飾有與標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體,所述第二抗體是與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的、被標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的兩個(gè)以上的抗體,且所述酶的底物特異性彼此不同,所述底物是具有所述酶的切割位點(diǎn)的、在該切割位點(diǎn)的一端側(cè)結(jié)合有熒光物質(zhì)、在另一端側(cè)結(jié)合有猝滅劑的兩個(gè)以上的底物,且所述熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)彼此不同。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明,可以提供一種技術(shù),其在對(duì)標(biāo)靶分子基于載體上的該標(biāo)靶分子與抗體的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的方法中,用于排除因檢測(cè)抗體向載體上的非特異性吸附而產(chǎn)生的噪音,高靈敏度并且高精度地檢測(cè)來自于標(biāo)靶分子的信號(hào)。附圖說明圖1是用于說明復(fù)合體形成步驟中形成的復(fù)合體的圖。圖2是用于說明封入步驟中封入微小液滴中的微球的圖。圖3是用于說明檢測(cè)步驟中的復(fù)合體與探針的反應(yīng)的圖。圖4是用于說明復(fù)合體形成步驟中形成的復(fù)合體的圖。具體實(shí)施方式以下,在參照附圖的同時(shí),對(duì)用于實(shí)施本發(fā)明的合適的方式進(jìn)行說明。而且,以下說明的實(shí)施方式表示本發(fā)明的代表性的實(shí)施方式的一例,并非由此來狹義地解釋本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法包括以下的步驟。此處,以將本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法應(yīng)用于基于elisa的單分子數(shù)字式計(jì)數(shù)(數(shù)字式elisa法)的實(shí)施方式為例,對(duì)各步驟進(jìn)行說明。(1)復(fù)合體形成步驟,使標(biāo)靶分子、載體和第二抗體反應(yīng),在所述載體上形成由所述第一抗體、所述標(biāo)靶分子和所述第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體,其中,所述載體被修飾有與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體,所述第二抗體是與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的、被標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的兩個(gè)以上的抗體,其所述酶的底物特異性彼此不同。(2)封入步驟,向形成于基板上的液滴中分別各封入一個(gè)所述載體。(3)檢測(cè)步驟,使底物與所述復(fù)合體反應(yīng),檢測(cè)從所述熒光物質(zhì)中發(fā)出的熒光,所述底物是具有所述酶的切割位點(diǎn)的、在該切割位點(diǎn)的一端側(cè)結(jié)合有熒光物質(zhì)、在另一端側(cè)結(jié)合有猝滅劑的兩個(gè)以上的底物,且所述熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)彼此不同。(4)分析步驟,將熒光波長(zhǎng)不同的兩個(gè)以上的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為所述標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理。在本發(fā)明的檢測(cè)方法中,設(shè)為檢測(cè)對(duì)象的標(biāo)靶分子只要是利用抗原-抗體反應(yīng)與抗體結(jié)合的物質(zhì)即可,特別是可以設(shè)為細(xì)菌及真菌等微生物、病毒、蛋白、核酸、糖以及它們的復(fù)合物等生物體分子。另外,設(shè)為檢測(cè)對(duì)象的標(biāo)靶分子并不僅限于1種,也可以同時(shí)檢測(cè)2種以上的標(biāo)靶分子。例如,通過使用針對(duì)蛋白a的第一抗體及第二抗體、針對(duì)蛋白b的第一抗體和第二抗體這四種抗體,可以區(qū)別蛋白a和蛋白b這兩種標(biāo)靶分子地同時(shí)檢測(cè)。1.復(fù)合體形成步驟復(fù)合體形成步驟中,使標(biāo)靶分子、修飾有與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體的載體、與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合且被標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的第二抗體反應(yīng),在所述載體上形成由所述第一抗體、所述標(biāo)靶分子和所述第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體。作為第二抗體,可以使用被標(biāo)記有底物特異性彼此不同的酶的兩個(gè)以上的抗體?!熬哂械孜锴懈罨钚缘拿浮敝灰强梢詫?shí)現(xiàn)由底物的切割造成的熒光物質(zhì)與猝滅劑的解離(詳情后述)的酶,就沒有特別限定。作為“具有底物切割活性的酶”,例如可以使用ec編號(hào)(酶編號(hào)、enzymecommissionnumber)中屬于分類為ec2的轉(zhuǎn)移酶、分類為ec3的水解酶及分類為ec4的裂解酶的酶。作為具體的酶及其底物(以及底物中的切割位點(diǎn))的組合例如可以列舉如下。[表1]酶底物(底物中的切割位點(diǎn))酯酶酯鍵或由酯鍵衍生的鍵葡葡糖苷酶糖苷鍵或由糖苷鍵衍生的鍵磷酸酶磷酸酯鍵或由磷酸酯鍵衍生的鍵dnaasedna或其衍生物rnaaserna或其衍生物蛋白酶肽鍵或由肽鍵衍生的鍵圖1中表示出復(fù)合體形成步驟中形成的復(fù)合體。本步驟中,首先,準(zhǔn)備修飾有與標(biāo)靶分子1特異性結(jié)合的第一抗體3的載體2、與標(biāo)靶分子1特異性結(jié)合且被標(biāo)記有酶51、52的第二抗體41、42。本發(fā)明中,所謂“抗體特異性結(jié)合”,意味著可以與抗原(此處是標(biāo)靶分子1)結(jié)合、然而與其他物質(zhì)不結(jié)合或結(jié)合弱。另外,所謂“結(jié)合弱”,意味著與針對(duì)抗原的結(jié)合親和性相比,對(duì)其他物質(zhì)的結(jié)合親和性足以區(qū)分開來地低。抗體的結(jié)合親和性(affinity)例如可以利用surfaceplasmonresonance(spr)法等公知的方法測(cè)定。第一抗體3是為了將標(biāo)靶分子1捕捉到載體2上而發(fā)揮作用。第二抗體41、42是為了使捕捉到載體2上的標(biāo)靶分子1能夠在光學(xué)上檢測(cè)出而發(fā)揮作用。第一抗體3和第二抗體41、42優(yōu)選結(jié)合于標(biāo)靶分子1的不同表位。換言之,第一抗體3的表位、第二抗體41的表位及第二抗體42的表位優(yōu)選全都不同。以下,也將第一抗體3稱作“捕捉抗體3”,將第二抗體稱作“檢測(cè)抗體41、42”。作為載體2,廣泛使用微球。以下,也將“載體2”稱作“微球2”。本發(fā)明中,“微球”被與“粒子”同義地使用,是該
技術(shù)領(lǐng)域:
中慣用的技術(shù)術(shù)語。微球的形狀沒有特別限定,然而通常設(shè)為球形。微球的材料也沒有特別限定,可以是玻璃、硅膠、聚苯乙烯、聚丙烯、膜及磁性體等。作為具體的材料,可以舉出纖維素、纖維素衍生物、丙烯酸類樹脂、玻璃、硅膠、聚苯乙烯、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基與丙烯酰胺的共聚物、與二乙烯基苯等交聯(lián)了的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、膠乳凝膠、聚苯乙烯葡聚糖、橡膠、硅、塑料、硝基纖維素、纖維素、天然海綿、硅膠、玻璃、金屬塑料、纖維素、交聯(lián)葡聚糖(sephadex(商標(biāo)))及瓊脂糖凝膠(sepharose(商標(biāo)))等。球珠也可以是多孔性。球珠的平均粒徑優(yōu)選為5μm以下,例如可以設(shè)為1μm~4μm左右。而且,平均粒徑例如可以使用電子顯微鏡觀察或動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定。捕捉抗體3對(duì)微球2的修飾是通過借助連接分子使捕捉抗體3與位于微球2的表面的修飾基結(jié)合而進(jìn)行。例如,借助具有n-羥基琥珀酰亞胺(n―hydroxysuccinimide)等的交聯(lián)劑使捕捉抗體3與位于氨基修飾球珠的表面的氨基共價(jià)結(jié)合。對(duì)檢測(cè)抗體41、42加以標(biāo)記的酶51、52被設(shè)為底物特異性彼此不同的酶。此處,所謂“底物特異性”,意味著在由酶催化的底物的切割中該酶不催化該底物以外的物質(zhì)的切割或者催化的程度足夠弱。作為“底物特異性彼此不同的酶”,例如在作為酶51使用酯酶的情況下,作為酶52,使用不以酯鍵作為切割位點(diǎn)的酶,即葡糖苷酶、磷酸酶等。另外,在作為酶與底物的組合采用限制性酶和核酸鏈的情況下,作為底物特異性彼此不同的酶51、52,使用識(shí)別序列(切割位點(diǎn))彼此不同的酶。作為限制性酶,例如可以舉出acci、alui、apai、bamhi、bglii、bsshii、bsteii、clai、ddei、drai、ecori、ecorv、haeiii、hincii、hindiii、hpai、hpaii、kpni、mlui、nari、ncoi、ndei、nhei、noti、psti、pvui、pvuii、rsai、saci、sali、scai、smai、spei、sphi、sspi、stui、xbai、xhoi等。作為酶51、52,可以將它們中的底物特異性不同的2個(gè)酶任意組合使用。以下,主要說明作為酶51、52使用限制性酶的例子,也將酶51、52稱作“限制性酶51、52”。限制性酶51、52對(duì)檢測(cè)抗體41、42的標(biāo)記可以通過使用交聯(lián)劑(crosslinker試劑)在檢測(cè)抗體41、42與限制性酶51、52之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)而進(jìn)行。然后,本步驟中,使標(biāo)靶分子1、修飾有捕捉抗體3的微球2、和標(biāo)記有限制性酶51、52的檢測(cè)抗體41、42反應(yīng)。通過反應(yīng),在微球2上形成由捕捉抗體3和標(biāo)靶分子1和檢測(cè)抗體41、42構(gòu)成的復(fù)合體(參照?qǐng)D1a)。標(biāo)靶分子1、微球2及檢測(cè)抗體41、42的反應(yīng)可以是以一個(gè)階段來進(jìn)行,也可以是以兩個(gè)階段來進(jìn)行。即,可以使標(biāo)靶分子1、微球2及檢測(cè)抗體41、42同時(shí)反應(yīng),也可以在使標(biāo)靶分子1與微球2反應(yīng)后,為了除去沒有與捕捉抗體3結(jié)合的標(biāo)靶分子1而清洗微球2,然后使微球2與檢測(cè)抗體41、42反應(yīng)。標(biāo)靶分子1、微球2及檢測(cè)抗體41、42的反應(yīng)只要通過在適當(dāng)?shù)娜芤褐惺顾鼈兘佑|而進(jìn)行即可,可以在與以往公知的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定相同的條件下進(jìn)行。在標(biāo)靶分子1的濃度低的情況下,反應(yīng)后的各個(gè)微球2將會(huì)是僅具有1個(gè)分子的復(fù)合體、或者完全不具有復(fù)合體的某種。在后述的檢測(cè)步驟中,使本步驟中形成的在表面具有復(fù)合體的微球2與結(jié)合有熒光物質(zhì)的底物接觸,檢測(cè)因?qū)z測(cè)抗體41、42加以標(biāo)記的限制性酶51、52切割該底物而產(chǎn)生的熒光。此時(shí),若產(chǎn)生檢測(cè)抗體41、42向微球2上的非特異性吸附,就會(huì)從在表面具有非特異性吸附的檢測(cè)抗體41、42的微球2中也產(chǎn)生由底物的切割造成的熒光。此處,所謂“抗體非特異性吸附”,意味著抗體吸附在包含抗原的物質(zhì)中的并非抗原的部分、或吸附在不包含抗原的物質(zhì)上,是指不借助抗原-抗體反應(yīng)地吸附在物質(zhì)上。圖1b、c表示復(fù)合體形成步驟中可能產(chǎn)生的、檢測(cè)抗體41、42向微球2上的非特異性吸附。圖1b中,表示檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42的任意一方非特異性吸附于微球2的表面的狀態(tài)。另外,圖1c中,表示檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42雙方非特異性吸附于微球2的表面的狀態(tài)。復(fù)合體形成步驟中,在圖1a所示的作為目的的復(fù)合體形成以外,也可能產(chǎn)生如圖1b、c所示的檢測(cè)抗體41、42的非特異性吸附。產(chǎn)生圖1c所示的檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42雙方的非特異性吸附的頻率與產(chǎn)生圖1b所示的任意一方抗體的非特異性吸附的頻率相比足夠小,對(duì)標(biāo)靶分子1的檢測(cè)精度基本上不造成影響。例如,若假定在微球2的1%中產(chǎn)生檢測(cè)抗體41的非特異性吸附,同樣地在微球2的1%中產(chǎn)生檢測(cè)抗體42的非特異性吸附,則產(chǎn)生檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42雙方的非特異性吸附的頻率只不過為0.01%。后述的分析步驟中,通過將熒光波長(zhǎng)不同的兩個(gè)以上的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)(信號(hào))進(jìn)行處理,而排除因圖1b所示的非特異性吸附而產(chǎn)生的熒光的檢測(cè)信號(hào)所引起的噪音。2.封入步驟封入步驟中,向形成于基板上的液滴中封入微球2。本步驟是將本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法應(yīng)用于數(shù)字式elisa法時(shí)所進(jìn)行的步驟,并非本發(fā)明的檢測(cè)方法的必需的步驟。本步驟中,為了在分析步驟中將來自于標(biāo)靶分子1的信號(hào)用0或1二值化,向僅可以收容1個(gè)微球2的微小體積的液滴中,各封入一個(gè)微球2。微小液滴的形成及微球2向微小液滴中的封入例如可以合適地使用專利文獻(xiàn)1公開的單分子數(shù)字式計(jì)數(shù)器件。根據(jù)該單分子數(shù)字式計(jì)數(shù)器件,可以一邊在基板上超高密度地形成微小的液滴、一邊同時(shí)地向液滴中封入微球2。復(fù)合體形成步驟后的微球2可以在為了除去沒有與標(biāo)靶分子1結(jié)合的檢測(cè)抗體41、42而進(jìn)行清洗后,再次懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┲?,供本步驟使用。復(fù)合體形成步驟后的微球2是形成有復(fù)合體的微球(參照?qǐng)D1a)與沒有形成復(fù)合體的微球的混合物。此外,在沒有形成復(fù)合體的微球中,包含非特異性吸附有檢測(cè)抗體41、42的微球(參照?qǐng)D1b、c)。圖2中,表示出封入微小液滴中的微球2。在形成于基板a上的液滴d中分別各封入了一個(gè)微球2。在復(fù)合體形成步驟中的反應(yīng)時(shí),在標(biāo)靶分子1的濃度低的情況下,各個(gè)微球2將會(huì)是僅具有1個(gè)分子的復(fù)合體、或完全不具有復(fù)合體的某一種。圖中,將在表面形成有復(fù)合體的微球用符號(hào)21表示,將沒有形成復(fù)合體的微球用符號(hào)22表示。微球21是圖1a中所示的狀態(tài)的球珠,在微球22中包含圖1b或c中所示的狀態(tài)的球珠。以下,將形成有復(fù)合體的微球2表述為“微球21”,將沒有形成復(fù)合體的微球2表述為“微球22”。3.檢測(cè)步驟檢測(cè)步驟中,使具有限制性酶51、52的識(shí)別序列且在成為切割位點(diǎn)的該識(shí)別序列的一端側(cè)結(jié)合有熒光物質(zhì)、在另一端側(cè)結(jié)合有猝滅劑的底物(以下也稱作“探針”)、與復(fù)合體形成步驟中形成于微球2的表面的復(fù)合體反應(yīng),檢測(cè)從熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。圖3中,表示出本步驟中的探針與復(fù)合體的反應(yīng)。在反應(yīng)時(shí),使用結(jié)合有不同的熒光波長(zhǎng)的熒光物質(zhì)的2個(gè)以上的探針。具體而言,圖中以符號(hào)61表示的探針包含對(duì)檢測(cè)抗體41加以標(biāo)記的限制性酶51的切割位點(diǎn)71,夾隔著切割位點(diǎn)71在一個(gè)區(qū)域結(jié)合有熒光物質(zhì)81,在另一個(gè)區(qū)域結(jié)合有猝滅劑91。另外,圖中以符號(hào)62表示的探針包含對(duì)檢測(cè)抗體42加以標(biāo)記的限制性酶52的切割位點(diǎn)72,夾隔著切割位點(diǎn)72在一個(gè)區(qū)域結(jié)合有熒光物質(zhì)82,在另一個(gè)區(qū)域結(jié)合有猝滅劑92。限制性酶51、52由于底物特異性不同,因此切割位點(diǎn)71、72也被設(shè)為彼此不同的堿基序列。另外,作為探針71、72的熒光物質(zhì)81、82,使用熒光波長(zhǎng)彼此不同、可以在光學(xué)上區(qū)分檢測(cè)的熒光物質(zhì)。此處,在作為酶與底物的組合采用限制性酶與核酸鏈的組合以外的情況下,例如作為酶51使用酯酶、作為酶52使用葡糖苷酶的情況下,作為探針61,使用包含對(duì)檢測(cè)抗體41加以標(biāo)記的酯酶的切割位點(diǎn)71(酯鍵)、且夾隔著切割位點(diǎn)71在一個(gè)區(qū)域結(jié)合有熒光物質(zhì)81、在另一個(gè)區(qū)域結(jié)合有猝滅劑91的探針。另外,作為探針62,使用包含對(duì)檢測(cè)抗體42加以標(biāo)記的葡糖苷酶的切割位點(diǎn)72(糖苷鍵)、且夾隔著切割位點(diǎn)72在一個(gè)區(qū)域結(jié)合有熒光物質(zhì)82、在另一個(gè)區(qū)域結(jié)合有猝滅劑92的探針。猝滅劑91、92在位于能夠在與熒光物質(zhì)81、82之間進(jìn)行能量移動(dòng)的一定的距離內(nèi)的狀態(tài)下,阻止(猝滅)熒光物質(zhì)81、82的發(fā)光。作為熒光物質(zhì)81、82及猝滅劑91、92,可以使用實(shí)時(shí)定量pcr等核酸的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)中通用的熒光物質(zhì)和猝滅劑。作為熒光物質(zhì)與猝滅劑的組合,例如可以舉出選自alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))488(invitrogen公司制)、atto488(atto-tecgmbh公司制)、alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))594(invitrogen公司制)及rox(carboxy-x-rhodamine)中的熒光物質(zhì)與bhq(注冊(cè)商標(biāo)、blackholequencher)-1或bhq(注冊(cè)商標(biāo))-2的組合等。另外,可以舉出熒光素與dabcyl的組合等。將通用的熒光物質(zhì)與猝滅劑的組合表示于以下的表中。[表2]反應(yīng)是通過使探針61、62與封入微小液滴d的微球2接觸而進(jìn)行。具體而言,例如將復(fù)合體形成步驟后進(jìn)行了清洗的微球2再次懸浮在包含探針61、62的溶液中,由此使它們接觸。另外,優(yōu)選根據(jù)限制性酶51、52的種類使用合適的組成的緩沖液來進(jìn)行反應(yīng),優(yōu)選在封入步驟中使用此種緩沖液形成微小液滴。而且,對(duì)各種限制性酶最佳化了的緩沖液被與限制性酶組合起來在市場(chǎng)上銷售。在向微小液滴d中封入了微球21的情況下,利用對(duì)形成復(fù)合體的檢測(cè)抗體41加以標(biāo)記了的限制性酶51將探針61的切割位點(diǎn)71切割。一旦切割位點(diǎn)71被切割,探針61就被切割為片段61a和片段61b,熒光物質(zhì)81從猝滅劑91解離而變?yōu)槟軌虬l(fā)光的狀態(tài)。同樣地,一旦利用對(duì)形成復(fù)合體的檢測(cè)抗體42加以標(biāo)記了的限制性酶52將探針62的切割位點(diǎn)72切割,熒光物質(zhì)82也會(huì)從猝滅劑92解離而變?yōu)槟軌虬l(fā)光的狀態(tài)。熒光的檢測(cè)是通過使用熒光顯微鏡、圖像傳感器等檢測(cè)來自于封入了微球2的各微小液滴的熒光而進(jìn)行。另外,本步驟中,優(yōu)選還檢測(cè)是否在各微小液滴中收容有微球2。該檢測(cè)例如可以通過在顯微鏡下觀察微球2的有無來進(jìn)行,也可以通過檢測(cè)由微球2造成的散射光的方法、利用借助場(chǎng)效應(yīng)晶體管(fet)的電位計(jì)測(cè)的方法等來進(jìn)行。4.分析步驟分析步驟中,將熒光波長(zhǎng)不同的兩個(gè)以上的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理,將發(fā)出標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)的微小液滴d的個(gè)數(shù)作為標(biāo)靶分子的個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)。在復(fù)合體形成步驟中的反應(yīng)時(shí),在標(biāo)靶分子1的濃度低的情況下,封入各個(gè)微小液滴d中的微球2會(huì)是僅具有1個(gè)分子的復(fù)合體的微球21、或完全不具有復(fù)合體的微球22的某一種,因此可以將發(fā)出標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)的微小液滴d的個(gè)數(shù)視為標(biāo)靶分子1的個(gè)數(shù)。另外,可以使用封入了微球21及微球22的微小液滴d的個(gè)數(shù)、和封入了微球21的微小液滴d的個(gè)數(shù),算出微球2的總數(shù)當(dāng)中捕捉到標(biāo)靶分子1的個(gè)數(shù)的比例。由此,就可以將標(biāo)靶分子的濃度定量化。如上所述,若在微小液滴d中封入有微球21,就可以檢測(cè)出來自于熒光物質(zhì)81的熒光、和來自于與該熒光波長(zhǎng)不同的熒光物質(zhì)92的熒光。若只是如圖1b所示的檢測(cè)抗體41或檢測(cè)抗體42非特異性吸附于微球2的表面,則只能從沒有形成復(fù)合體的微球22檢測(cè)出來自于熒光物質(zhì)81及熒光物質(zhì)92的任意一個(gè)的熒光。因而,通過將熒光物質(zhì)81及熒光物質(zhì)92這兩方的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理,就可以大幅度降低由從沒有形成復(fù)合體的微球22產(chǎn)生的熒光的檢測(cè)信號(hào)引起的噪音。由此,可以高精度地進(jìn)行標(biāo)靶分子1的檢測(cè)信號(hào)的二值化,從而能夠提高標(biāo)靶分子1的定量性。而且,在如圖1c所示的檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42雙方非特異性吸附于微球2的表面的情況下,也可能產(chǎn)生熒光物質(zhì)81及熒光物質(zhì)92這兩方的熒光,然而如前說明所示,由于產(chǎn)生檢測(cè)抗體41及檢測(cè)抗體42這兩方的非特異性吸附的頻率足夠小,因此該熒光對(duì)于標(biāo)靶分子1的定量性基本上不造成影響。本實(shí)施方式中所用的、微球2和檢測(cè)抗體41、42(參照?qǐng)D1)、以及探針71、72(參照?qǐng)D3)可以作為用于實(shí)施本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法的試劑盒恰當(dāng)?shù)貙?shí)施。即,本發(fā)明在一個(gè)方面也提供一種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)試劑盒,其包含:(i)載體,其被修飾有與標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體;(ii)第二抗體,其為與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合、被標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的兩個(gè)以上的抗體,且所述酶的底物特異性彼此不同;(iii)底物,其為具有所述酶的切割位點(diǎn)、在該切割位點(diǎn)的一端側(cè)結(jié)合有熒光物質(zhì)、在另一端側(cè)結(jié)合有猝滅劑的兩個(gè)以上的底物,且所述熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)彼此不同。在該試劑盒中,微球2可以是被預(yù)先修飾有捕捉抗體3(第一抗體)的微球,也可以是在使用時(shí)借助連接分子使抗體與位于球珠的表面的修飾基結(jié)合的微球。另外,檢測(cè)抗體41、42(第二抗體)可以是被預(yù)先標(biāo)記有酶的抗體,也可以是在使用時(shí)使用交聯(lián)劑使酶與抗體結(jié)合的抗體。另外,本發(fā)明的試劑盒也可以還包含用于捕捉抗體3對(duì)微球2的修飾或酶對(duì)檢測(cè)抗體41、42的標(biāo)記的交聯(lián)劑等試劑、在復(fù)合體形成步驟及檢測(cè)步驟中所用的各種緩沖液、在封入步驟中使用的基板a(參照?qǐng)D2)等。上述說明中說明了如下的實(shí)施方式,即,使用2個(gè)檢測(cè)抗體、2個(gè)與之對(duì)應(yīng)的探針,將熒光波長(zhǎng)不同的2個(gè)熒光的檢測(cè)信號(hào)作為標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào),由此來降低來自于檢測(cè)抗體的非特異性吸附的噪音。在本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法中,也可以使用3組以上的檢測(cè)抗體及探針,在該情況下,只要將熒光波長(zhǎng)不同的3個(gè)以上的熒光的檢測(cè)信號(hào)作為標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)即可。所用的檢測(cè)抗體及探針的個(gè)數(shù)越多,就越可以提高對(duì)來自于檢測(cè)抗體的非特異性吸附的噪音的降低效果。另外,上述說明中說明了如下的實(shí)施方式,即,作為第二抗體,使用標(biāo)記有具有底物切割活性的酶的檢測(cè)抗體,利用該酶切割探針中的切割位點(diǎn),由此產(chǎn)生熒光。本發(fā)明的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法中,也可以作為第二抗體應(yīng)用標(biāo)記有以往在化學(xué)發(fā)色中所用的酶的檢測(cè)抗體、或標(biāo)記有熒光色素的檢測(cè)抗體。即,本發(fā)明還作為其第二實(shí)施方式包含包括以下的步驟的標(biāo)靶分子的檢測(cè)方法。(a)復(fù)合體形成步驟,使標(biāo)靶分子、修飾有與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的第一抗體的載體、和與所述標(biāo)靶分子特異性結(jié)合且被進(jìn)行了彼此不同的標(biāo)記的兩個(gè)以上的第二抗體反應(yīng),在所述載體上形成由所述第一抗體、所述標(biāo)靶分子和所述第二抗體構(gòu)成的復(fù)合體。(b)檢測(cè)步驟,檢測(cè)來自于所述標(biāo)記的信號(hào)。(c)分析步驟,將來自于不同的兩個(gè)以上的所述標(biāo)記的所述信號(hào)作為所述標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理。此處,在步驟(c)中,在“來自于標(biāo)記的信號(hào)”中,包含從該標(biāo)記直接及間接產(chǎn)生的信號(hào)。具體而言,在將標(biāo)記有熒光色素的檢測(cè)抗體作為第二抗體應(yīng)用的情況下,“來自于標(biāo)記的信號(hào)”是指從該熒光色素產(chǎn)生的熒光(參照?qǐng)D4b)。另外,在將標(biāo)記有化學(xué)發(fā)色中所用的酶的檢測(cè)抗體作為第二抗體應(yīng)用的情況下,“來自于標(biāo)記的信號(hào)”是指借助該酶的被催化的化學(xué)發(fā)色(參照?qǐng)D4a)。步驟(a)除了作為第二抗體使用堿性磷酸酶、半乳糖苷酶等在以往化學(xué)發(fā)色中所用的酶、或標(biāo)記有各種熒光物質(zhì)的檢測(cè)抗體以外,可以與上述的實(shí)施方式(第一實(shí)施方式)的步驟(1)相同地進(jìn)行。另外,在作為數(shù)字式elisa法實(shí)施本實(shí)施方式的情況下,可以包含第一實(shí)施方式中作為步驟(2)說明的封入步驟??梢岳蒙鲜龅墓椒▉磉M(jìn)行酶或熒光色素對(duì)檢測(cè)抗體的標(biāo)記。另外,標(biāo)記有酶或熒光色素的抗體也可以利用各種市售的產(chǎn)品。步驟(b)中,檢測(cè)出在載體的表面形成了復(fù)合體的檢測(cè)抗體的來自于標(biāo)記的信號(hào)。圖4a中,表示出在作為檢測(cè)抗體41、42使用了標(biāo)記有堿性磷酸酶的抗體和標(biāo)記有半乳糖苷酶的抗體時(shí)形成于微球2上的“捕捉抗體3-靶物質(zhì)1-第二抗體41、42”的復(fù)合體。在使用標(biāo)記有酶的檢測(cè)抗體的情況下,信號(hào)的檢測(cè)可以利用使用了該酶的底物的發(fā)色法來進(jìn)行。例如,在標(biāo)記有堿性磷酸酶的檢測(cè)抗體的情況下,可以通過取代第一實(shí)施方式中所用的探針而使作為堿性磷酸酶的發(fā)色底物的bcip(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)或nbt(4-nitrobluetetrazoliumchloride)與復(fù)合體反應(yīng)來進(jìn)行。另外,在標(biāo)記有半乳糖苷酶的檢測(cè)抗體的情況下,作為發(fā)色底物使用x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷)等。作為檢測(cè)抗體使用標(biāo)記有彼此不同的酶的兩個(gè)以上的抗體,作為發(fā)色底物根據(jù)對(duì)各抗體加以標(biāo)記了的酶使用兩個(gè)以上的化合物。通過利用吸光度計(jì)測(cè)來測(cè)定各發(fā)色底物的發(fā)色,就可以檢測(cè)出來自于各個(gè)酶的信號(hào)。另外,在使用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的檢測(cè)抗體的情況下,信號(hào)的檢測(cè)是通過使用熒光顯微鏡或圖像傳感器檢測(cè)從熒光物質(zhì)中發(fā)出的熒光來進(jìn)行。圖4b中,表示出在作為檢測(cè)抗體41、42使用標(biāo)記有fitc的抗體和標(biāo)記有texasred(注冊(cè)商標(biāo))的抗體時(shí)形成于微球2上的“捕捉抗體3-靶物質(zhì)1-第二抗體41、42”的復(fù)合體。通過作為檢測(cè)抗體使用標(biāo)記有熒光波長(zhǎng)彼此不同的熒光物質(zhì)的兩個(gè)以上的抗體,對(duì)每個(gè)波長(zhǎng)范圍檢測(cè)來自于熒光物質(zhì)的熒光,就可以檢測(cè)出來自于各個(gè)熒光物質(zhì)的信號(hào)。步驟(c)中,將來自于不同的兩個(gè)以上的標(biāo)記(上述的例子中是堿性磷酸酶和半乳糖苷酶、或者fitc和texasred)的信號(hào)作為標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理。如上所述,在因檢測(cè)抗體只是非特異性吸附于載體的表面而沒有形成復(fù)合體的情況下,只能檢測(cè)出來自于兩個(gè)以上的標(biāo)記中的任意一個(gè)標(biāo)記的信號(hào)(參照?qǐng)D1)。因而,通過將來自于不同的兩個(gè)以上的標(biāo)記的信號(hào)作為標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行處理,可以大幅度降低因檢測(cè)抗體在載體上的非特異性吸附而引起的噪音。由此,可以提高標(biāo)靶分子的檢測(cè)精度,進(jìn)而可以提高其定量性。符號(hào)的說明1:標(biāo)靶分子,2:微球(載體),3:捕捉抗體(第一抗體),41、42:檢測(cè)抗體(第二抗體),51、52:限制性酶,61、62:探針,71、72:切割位點(diǎn),81、82:熒光物質(zhì),91、92:猝滅劑。當(dāng)前第1頁(yè)12