基于微流控芯片的通用凝血測(cè)定的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2014年9月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/048,183的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。
本發(fā)明涉及一種基于微流控芯片的即時(shí)通用凝血測(cè)定裝置和讀取器，該裝置和讀取器可以用于測(cè)量正常健康患者、凝血障礙患者、抗凝血患者和抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)患者的整體凝血狀態(tài)。
背景技術(shù)：
凝血(coagulation或clotting)是血液從液態(tài)變成凝膠的過(guò)程。該過(guò)程可能引起止血，即從受損的血管停止失血，然后修復(fù)。凝血機(jī)制涉及到血小板的活化、粘附和聚集，伴隨纖維蛋白原到纖維蛋白的轉(zhuǎn)化，纖維蛋白沉積并成熟為穩(wěn)健的網(wǎng)絡(luò)。凝血障礙是可以導(dǎo)致出血或阻塞性凝血(血栓癥)的疾病狀態(tài)。
血管受傷損壞作為血管的內(nèi)襯的內(nèi)皮之后，凝血很快開(kāi)始。將血液暴露于內(nèi)皮下面的空間引發(fā)兩類過(guò)程：血小板變化、以及內(nèi)皮下組織因子暴露于血漿因子vii，最終引起纖維蛋白形成。血小板在傷口部位立即形成血栓；這被稱為初期止血。二期止血同時(shí)發(fā)生：因子vii以外的額外的凝血因子(coagulationfactor或clottingfactor)以復(fù)雜級(jí)聯(lián)產(chǎn)生響應(yīng)從而形成纖維蛋白鏈，這些纖維蛋白鏈強(qiáng)化血小板血栓。
二期止血的凝血級(jí)聯(lián)具有兩條引起纖維蛋白形成的途徑。它們是接觸激活途徑(又稱為內(nèi)源途徑)、以及組織因子途徑(又稱為外源途徑)。先前認(rèn)為，凝血級(jí)聯(lián)由連結(jié)到共同途徑的兩條同樣重要的途徑組成?，F(xiàn)在已知，凝血開(kāi)始的主要途徑是組織因子途徑。這些途徑是一系列反應(yīng)，其中絲氨酸蛋白酶及其糖蛋白輔因子的酶原(無(wú)活性酶前體)被激活成活性組分，這些活性組分然后催化級(jí)聯(lián)中的下一個(gè)反應(yīng)，最終產(chǎn)生交聯(lián)纖維蛋白。凝血因子通常由羅馬數(shù)字表示，并且附帶小寫字母“a”以表示活性形式。
凝血因子通常是通過(guò)使下游蛋白裂解而起作用的絲氨酸蛋白酶。存在一些例外情況。例如，fviii和fv是糖蛋白，并且因子xiii是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。凝血因子作為無(wú)活性酶原循環(huán)。凝血級(jí)聯(lián)經(jīng)典地被分為三條途徑。組織因子途徑和接觸激活途徑兩者都激活因子x、凝血酶和纖維蛋白的“最終共同途徑”。
組織因子途徑(外源)
組織因子途徑的主要作用是產(chǎn)生“凝血酶爆發(fā)”，這是一種過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，凝血級(jí)聯(lián)在其反饋激活作用方面最重要的組成部分—凝血酶非常迅速地釋放。fviia以比任何其他激活的凝血因子更大的量循環(huán)。該過(guò)程包括以下步驟：
在血管損壞之后，fvii離開(kāi)循環(huán)并與在組織因子攜帶細(xì)胞(基質(zhì)成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞)上表達(dá)的組織因子(tf)接觸，從而形成活化復(fù)合物(tf-fviia)。
tf-fviia激活fix和fx。
fvii本身由凝血酶、fxia、fxii和fxa激活。
fx通過(guò)tf-fviia的激活(形成fxa)幾乎立即被組織因子途徑抑制劑(tfpi)抑制。
fxa及其輔助因子fva形成凝血酶原酶復(fù)合物，該復(fù)合物將凝血酶原激活成凝血酶。
凝血酶然后激活凝血級(jí)聯(lián)的其他組分，包括fv和fviii(其激活fxi，fxi進(jìn)而激活fix)，并且激活和釋放fviii不與vwf結(jié)合。
fviiia是fixa的輔助因子，并且一起形成激活fx的“tenase”復(fù)合物；并且因此循環(huán)繼續(xù)進(jìn)行。(“tenase”是“十(ten)”和后綴“-ase”(用于酶)的縮寫。)
接觸激活途徑(內(nèi)源)
接觸激活途徑開(kāi)始于以由高分子量激肽原(hmwk)、前激肽釋放酶和fxii(哈格曼因子)形成膠原蛋白上的主要復(fù)合物。前激肽釋放酶被轉(zhuǎn)化為激肽釋放酶，并且fxii變成fxiia。fxiia將fxi轉(zhuǎn)化成fxia。因子xia激活fix，fix與其輔助因子fviiia形成tenase復(fù)合物，該復(fù)合物將fx激活成fxa。接觸激活途徑在起始凝塊形成中的次要作用可以通過(guò)患有fxii、hmwk和前激肽釋放酶的嚴(yán)重缺陷的患者沒(méi)有出血障礙這一事實(shí)來(lái)說(shuō)明。相反，接觸激活系統(tǒng)看上去更多地參與炎癥。
凝血測(cè)定
若干種技術(shù)被用于凝血測(cè)試，包括基于凝塊的測(cè)試、顯色測(cè)定或顏色測(cè)定、直接化學(xué)測(cè)量和elisa。在這些技術(shù)中，最常使用基于凝塊的測(cè)定和顯色測(cè)定。而凝血測(cè)定提供凝血功能的整體評(píng)定，顯色測(cè)試被設(shè)計(jì)用于測(cè)量特異性定因子的水平或功能。
基于凝塊的測(cè)定常用于評(píng)估疑似患有出血異常的患者并用于監(jiān)測(cè)抗凝治療。這些測(cè)試中大多數(shù)使用枸櫞酸化鈉血漿(citratedplasma)，該血漿的制備需要數(shù)十分鐘，并且在醫(yī)院環(huán)境中通常需要幾個(gè)小時(shí)到幾天才能收到結(jié)果。大多數(shù)凝血測(cè)定的終點(diǎn)是纖維蛋白凝塊形成。
凝血酶原時(shí)間(pt)通過(guò)將含有組織因子(其可以是起源于重組體或來(lái)源于腦、肺或胎盤的提取物)和鈣的凝血活酶試劑添加到血漿中并測(cè)量凝血時(shí)間來(lái)進(jìn)行。pt根據(jù)試劑和凝血計(jì)而不同，但通常范圍在10秒與14秒之間。pt根據(jù)因子vii、x和v、凝血酶原或纖維蛋白原以及針對(duì)這些因子的抗體不足而延長(zhǎng)。本測(cè)試在患有纖維蛋白原向纖維蛋白反應(yīng)抑制劑(包括高劑量的肝素和纖維蛋白降解產(chǎn)物的存在)的患者中也是異常的。通常，pt試劑含有過(guò)量的磷脂，使得與陰離子磷脂反應(yīng)的非特異性抑制劑(即，狼瘡抗凝劑)不延長(zhǎng)凝血時(shí)間。pt最常用于監(jiān)測(cè)華法林治療。pt測(cè)量在多個(gè)裝置或中心之間是不可比較的，并且大多數(shù)華法林診所形成其自己的正?；颊叻秶@是不可轉(zhuǎn)換的，并且對(duì)所用特定測(cè)定中存在的確切試劑具有高度特異性。
通過(guò)首先將表面活性劑(例如，高嶺土、硅藻土，鞣花酸或二氧化硅)和稀釋后的磷脂(例如，腦磷脂)添加到枸櫞酸化血漿中來(lái)進(jìn)行活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)測(cè)定。也可以通過(guò)使用類似的化學(xué)活化劑在全血中即時(shí)測(cè)量aptt。因?yàn)榻M織因子不存在，所以將本測(cè)定中的磷脂稱為部分凝血活酶。在孵育以允許最佳地激活接觸因子(因子xii、因子xi、前激肽釋放酶和高分子量激肽原)之后，添加鈣，并測(cè)量凝血時(shí)間。aptt測(cè)量在多個(gè)裝置或醫(yī)院之間是不可比較的，并且大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室形成其自己的正?；颊叻秶?，這是不可轉(zhuǎn)換的，并且對(duì)所用特定測(cè)定中存在的確切試劑具有高度特異性。
盡管凝血時(shí)間根據(jù)所用的試劑和凝血計(jì)而不同，但aptt通常范圍在22秒至40秒之間。aptt可能根據(jù)接觸因子、因子ix、viii、x或v、凝血酶原、或纖維蛋白原不足而延長(zhǎng)。特異性因子抑制劑、以及非特異性抑制劑也可延長(zhǎng)aptt。纖維蛋白降解產(chǎn)物和抗凝劑(例如，肝素、直接凝血酶抑制劑或華法林)也延長(zhǎng)aptt，盡管aptt對(duì)于華法林的敏感性要低于pt。
通過(guò)向血漿中添加過(guò)量凝血酶來(lái)進(jìn)行凝血酶凝血時(shí)間(tct)測(cè)量。在低纖維蛋白原水平或血纖維蛋白原異常的患者和纖維蛋白降解產(chǎn)物水平升高的患者中，tct延長(zhǎng)。這些異常常見(jiàn)于彌散性血管內(nèi)凝血。肝素和直接凝血酶抑制劑也延長(zhǎng)tct。
活化凝血時(shí)間(act)是用于監(jiān)測(cè)大劑量肝素治療或用比伐盧定治療的即時(shí)全血凝血測(cè)試。在這些設(shè)置中所需的肝素或比伐盧定的劑量超出了可用aptt測(cè)量的范圍。通常，將全血收集到含有凝血活化劑(例如，硅藻土、高嶺土或玻璃顆粒)和磁力攪拌棒的管或筒中，并且然后測(cè)量血液凝結(jié)所花費(fèi)的時(shí)間。act的參考值范圍在70秒與180秒之間。抗凝血的期望范圍取決于適應(yīng)癥和使用的測(cè)試方法。act與其他凝血測(cè)試無(wú)關(guān)聯(lián)。
對(duì)于蛇靜脈酶(ecarin)凝血時(shí)間(ect)，使用來(lái)自鱗蝰蛇的毒液將凝血酶原轉(zhuǎn)化為間體凝血酶(meizothrombin)，這是一種對(duì)直接凝血酶抑制劑的抑制敏感的凝血酶原中間體。ect不能用于檢測(cè)紊亂的凝血狀態(tài)，而僅對(duì)治療藥物監(jiān)測(cè)有用。這種測(cè)定對(duì)肝素不敏感，因?yàn)槲蛔枳柚垢嗡?抗凝血酶復(fù)合物抑制間體凝血酶。因?yàn)閑carin也激活華法林治療患者的血漿中發(fā)現(xiàn)的非羧化凝血酶原，所以甚至可以通過(guò)伴隨的華法林治療來(lái)測(cè)定直接凝血酶抑制劑的水平。盡管ect已被用于臨床前研究，但測(cè)試尚未標(biāo)準(zhǔn)化，并不廣泛可用。
抗因子xa測(cè)定用于測(cè)量肝素和低分子量肝素(lmwh)的水平。這些是使用其上連接有發(fā)色團(tuán)的因子xa底物進(jìn)行的顯色測(cè)定。因子xa使顯色底物裂解，從而釋放可以用分光光度計(jì)檢測(cè)的有色化合物，并與存在的因子xa量成正比。當(dāng)將已知量的因子xa添加到含有肝素(或lmwh)的血漿中時(shí)，肝素通過(guò)抗凝血酶增強(qiáng)因子xa抑制，使得較少因子xa可用于使底物裂解。通過(guò)將此結(jié)果與用已知量的肝素產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)，我們可以計(jì)算血漿中的肝素濃度。使用抗xa測(cè)定需要了解患者正在服用哪種抗凝劑以便使用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)器，并且不能用于監(jiān)測(cè)抗-iia抗凝治療。
臨床應(yīng)用中的抗凝藥物包括華法林、肝素(普通肝素和lmwh)和直接凝血酶抑制劑(比伐盧定、水蛭素和阿加曲班)。
華法林對(duì)靜脈血栓栓塞的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防有效；對(duì)預(yù)防具有心房纖維性顫動(dòng)或人工心臟瓣膜的患者的心因性栓塞事件有效；對(duì)預(yù)防具有急性心肌梗塞的患者的中風(fēng)、復(fù)發(fā)性梗塞或心血管死亡有效；并且對(duì)高危人群的急性心肌梗塞的一級(jí)預(yù)防有效。因?yàn)閷?duì)華法林的抗凝血反應(yīng)的可變性，該可變性反映了代謝遺傳變異以及環(huán)境因素(諸如藥物、飲食和伴隨疾病)，所以需要進(jìn)行定期凝血監(jiān)測(cè)和劑量調(diào)整，以將國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(inr)維持在治療范圍內(nèi)。肝素是激活抗凝血酶并促進(jìn)其使凝血酶和因子xa失去活性的能力的間接抗凝血?jiǎng)?。為了催化凝血酶的抑制作用，肝素通過(guò)高親和力五糖序列與抗凝血酶結(jié)合并且與凝血酶結(jié)合。相反，為了促進(jìn)因子xa的抑制作用，肝素只需要通過(guò)其五糖序列與抗凝血酶結(jié)合。含有少于18個(gè)糖單位的肝素分子太短，而不能與凝血酶和抗凝血酶結(jié)合，并且因此不能催化凝血酶的抑制作用。然而，這些較短的肝素片段可以催化因子xa的抑制作用，條件是它們含有五糖序列。因?yàn)榕c內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和血漿蛋白可變的非特異性結(jié)合，所以對(duì)肝素的抗凝反應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的。因?yàn)檫@種可變的抗凝反應(yīng)，所以當(dāng)以大于預(yù)防劑量給予肝素時(shí)，常規(guī)進(jìn)行凝血監(jiān)測(cè)。aptt是最常用于監(jiān)測(cè)肝素的測(cè)試。不幸的是，aptt試劑對(duì)肝素的反應(yīng)性不同，并且aptt治療范圍根據(jù)試劑和用于測(cè)試的凝血計(jì)的靈敏度而不同。已證明了aptt比pt更難標(biāo)準(zhǔn)化，并且通常引用的、為對(duì)照值的1.5至2.5倍的治療范圍經(jīng)常導(dǎo)致系統(tǒng)性給予亞治療肝素劑量。支持aptt治療范圍預(yù)測(cè)功效和安全性(相對(duì)于出血)的概念的證據(jù)在某種程度上微不足道。大約25％的患者需要大于35000u/d的肝素劑量以獲得治療性aptt，并且被稱為對(duì)肝素有抗性。這些患者中大多數(shù)在用抗xa測(cè)定測(cè)量時(shí)具有治療性肝素水平，并且2次測(cè)試之間的差異是由于高濃度促凝劑(諸如纖維蛋白原和因子viii)引起的，這縮短了aptt。盡管aptt反應(yīng)與治療范圍內(nèi)的肝素水平線性相關(guān)，但aptt在肝素劑量較高時(shí)變得不能測(cè)量。因此，將對(duì)整體抗凝的敏感度較低的測(cè)試(諸如act)用于監(jiān)測(cè)接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療或主動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈分流手術(shù)的患者的抗凝水平。
lmwh通過(guò)化學(xué)或酶促解聚作用源自普通肝素。lmwh已逐漸取代肝素用于大多數(shù)適應(yīng)癥。lmwh通常當(dāng)用于預(yù)防目的而給予時(shí)以固定劑量給藥，或者當(dāng)用于治療給予時(shí)，以體重調(diào)整劑量給藥。通過(guò)抗因子xa水平監(jiān)測(cè)lmwh的缺陷包括可商購(gòu)的抗-xa顯色測(cè)定之間的差的可比性、各種lmwh制劑中抗-xa與抗iia的比率差異以及血液取樣定時(shí)相對(duì)于劑量給藥的重要性。盡管使用高劑量的lmwh可能延長(zhǎng)aptt，但這種測(cè)定不用于監(jiān)測(cè)。迄今尚無(wú)臨床可用的即時(shí)測(cè)定可用于監(jiān)測(cè)數(shù)百萬(wàn)被給予lmwh的患者。
直接凝血酶抑制劑直接與凝血酶結(jié)合并阻斷凝血酶與其底物的相互作用。三種腸胃外直接凝血酶抑制劑在北美已被許可用于有限的適應(yīng)癥。水蛭素和阿加曲班被批準(zhǔn)用于治療患有肝素誘發(fā)的血小板減少癥的患者，而比伐盧定在接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(pci)的患者中被許可作為肝素的替代品。水蛭素和阿加曲班需要常規(guī)監(jiān)測(cè)。tct對(duì)于用于此目的的少量水蛭素和阿加曲班太敏感。盡管act已用于監(jiān)測(cè)介入性設(shè)置中所需的較高劑量的直接凝血酶抑制劑，但它在高濃度下不能提供最佳的線性反應(yīng)。推薦aptt用于治療監(jiān)測(cè)；然而，每種直接凝血酶抑制劑具有其自己的劑量反應(yīng)，并且測(cè)試對(duì)藥物水平的靈敏度在aptt試劑之間不同。當(dāng)用aptt監(jiān)測(cè)水蛭素治療時(shí)，調(diào)整劑量以維持aptt為對(duì)照的1.5倍至2.5倍，而對(duì)于阿加曲班，目標(biāo)aptt為對(duì)照的1.5倍至3倍(但不超過(guò)100秒)。在需要較高劑量的直接凝血酶抑制劑的患者中，在心肺轉(zhuǎn)流手術(shù)中，aptt似乎不那么有用，因?yàn)檫@種測(cè)試在增加藥物濃度時(shí)變得反應(yīng)性降低。ect似乎對(duì)低濃度和高濃度直接凝血酶抑制劑都有用，并且比aptt更少受到干擾物質(zhì)的影響。然而，如上所述，它不是常規(guī)可用的。inr對(duì)不同藥物濃度的反應(yīng)性根據(jù)測(cè)定試劑和直接凝血酶抑制劑的類型而不同。這一特征使肝素誘發(fā)的血小板減少癥患者從阿加曲班轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素k拮抗劑變得復(fù)雜。
從上述內(nèi)容可以看出，凝血和凝血抑制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。如果使用錯(cuò)誤的凝血測(cè)定確定，則抗凝血?jiǎng)┑念愋蜁?huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)和危險(xiǎn)的結(jié)果。當(dāng)抗凝血患者到達(dá)急診室，沒(méi)有關(guān)于他所用藥物以及正在治療的病癥的信息時(shí)，這將產(chǎn)生潛在的災(zāi)難性情況。有時(shí)不可能等待進(jìn)一步診斷以確定引起長(zhǎng)時(shí)間出血的抗凝血?jiǎng)┗蛘系K。凝血、尤其是即時(shí)(“poc”)測(cè)試對(duì)快速、準(zhǔn)確和通用測(cè)試的需要是眾所周知的；然而，選項(xiàng)極其有限。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確和通用的凝血測(cè)試。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供即時(shí)凝血測(cè)試。
本發(fā)明的又另外一個(gè)目的是提供準(zhǔn)確、可再現(xiàn)、易于操作、并且需要非常少量的樣品的測(cè)試。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種用于測(cè)量分析物(特別是全血或全血衍生物)的物理特性的基于微流控芯片的測(cè)定裝置。這些技術(shù)能夠特別應(yīng)用于測(cè)量全血或血液衍生物的凝血時(shí)間、確定抗凝藥物對(duì)凝血(clotting或coagulation)動(dòng)力學(xué)的影響、以及評(píng)估抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑的效果。此外，這些技術(shù)能夠用于優(yōu)化抗凝藥物和/或其逆轉(zhuǎn)劑的劑量。該測(cè)定獨(dú)立于抗凝血?jiǎng)┑拇嬖?，因?yàn)橥ㄟ^(guò)將該裝置中的血液樣品暴露于玻璃(或其他帶負(fù)電的材料，諸如氧化硅)表面下來(lái)激活凝血，這激活內(nèi)源途徑，并且可以通過(guò)在活化材料表面上施加剪切流而進(jìn)一步加速。沒(méi)有化學(xué)活化劑并且高度受控且可重現(xiàn)的微環(huán)境產(chǎn)生即時(shí)通用凝血測(cè)定。
樣品在微流控系統(tǒng)中進(jìn)行處理。引入測(cè)試室的樣品的體積在納升、微升或毫升范圍(最優(yōu)選地1-10微升)內(nèi)。將樣品直接從血液樣本或個(gè)體(諸如從手指針刺)引到入收集孔中。在一個(gè)實(shí)施例中，在通過(guò)注射器收集到無(wú)添加劑紅頂管(red-toppedtube)或毛細(xì)管中之后，將樣品(諸如血液或血漿)收集并轉(zhuǎn)移到加熱的微型裝置中。通過(guò)血液或血漿暴露于裝置內(nèi)的玻璃表面下和樣品暴露于用于分析凝血的裝置下來(lái)開(kāi)始進(jìn)行樣品的凝血，優(yōu)選地一式兩份。然后通過(guò)毛細(xì)管作用或使用泵將血液樣品從收集孔抽吸到測(cè)試室中，該泵引起轉(zhuǎn)向并且將血液樣品暴露于活化材料表面下，同時(shí)將幾何控制量的血液樣品遞送到測(cè)試室中。微流控系統(tǒng)與集成電極、加熱器結(jié)構(gòu)或傳感器或致動(dòng)器的其他部分被設(shè)計(jì)為一次性的。將微流控系統(tǒng)插入分析型可重復(fù)使用的殼體(在此稱為“讀取器”)中，該殼體是分析儀器的一部分，其連接微流控系統(tǒng)并提供用于測(cè)量凝血并將測(cè)量時(shí)間和特征傳輸至外部讀取器、監(jiān)視器或記錄器的流體接口、電氣接口、光接口和熱接口。
通過(guò)粘度、光透射、電阻抗和/或壓力的變化評(píng)估凝血。在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)量通過(guò)集成電極的血液阻抗和/或通過(guò)分別使用紅外(ir)led和光電二極管測(cè)量光透射來(lái)檢測(cè)凝血。集成的熱電阻加熱器/冷卻器結(jié)構(gòu)，諸如固態(tài)熱泵或珀耳帖冷卻器，將血液樣品保持在限定的溫度，最優(yōu)選地約37℃(體溫)，并確保測(cè)量的可重復(fù)性和可比性。隨著纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，ir吸收度增加，直到其以可測(cè)量的方式達(dá)到峰值。全血凝血時(shí)間的測(cè)定是在或大約在ir吸收度峰值下進(jìn)行的。在完成測(cè)量之后，將包含血液樣品的微流控芯片從讀取器中取出并丟棄。
可以通過(guò)測(cè)量電阻抗來(lái)監(jiān)測(cè)凝血的發(fā)展。纖維蛋白的形成增大電阻抗，直到其以可測(cè)量的方式達(dá)到峰值。在電阻抗峰值或約為峰值時(shí)，測(cè)定全血凝血時(shí)間?？梢酝ㄟ^(guò)單獨(dú)或同時(shí)測(cè)量的ir吸收度和電阻抗來(lái)測(cè)量全血凝血時(shí)間，作為比較的基礎(chǔ)。電阻抗和ir吸收度曲線基本上一致，并通過(guò)獨(dú)立的測(cè)量模式提供確認(rèn)。
通過(guò)應(yīng)用微技術(shù)制造并且加工和鍵合由硅、玻璃或其他合適材料制成的晶圓來(lái)制造微流控系統(tǒng)。還可以通過(guò)替代手段、例如通過(guò)應(yīng)用軟光刻技術(shù)或通過(guò)產(chǎn)生可以單獨(dú)使用的讀取器部分(例如由塑料或不同的合適的、基本上不透ir的材料制成)、或與微圖案化芯片組合形成微流控系統(tǒng)來(lái)制造微流控系統(tǒng)。微流控系統(tǒng)通常由進(jìn)入端口、出口和一個(gè)或多個(gè)通過(guò)通道連接的室組成，這些通道的長(zhǎng)度范圍從幾十微米到幾十毫米，并且高度和深度在幾十微米到幾百微米范圍內(nèi)。
附圖說(shuō)明
圖1是凝血級(jí)聯(lián)的示意圖。
圖2a是其中將血液吸移到一個(gè)室中并且然后將芯片插入封裝中的微流控裝置的一個(gè)實(shí)施例的橫截面視圖。
圖2b是可以通過(guò)室側(cè)引入血液的微流控裝置的實(shí)施例的橫截面視圖；“吸取器”伸出讀取器，類似于血糖測(cè)量。
圖3a是兩個(gè)樣品室裝置的開(kāi)放版的視圖。
圖3b是兩個(gè)樣品室裝置的封閉后的視圖。
圖4a-4h是室的視圖，示出了室、連接通道、電接觸焊盤和熱敏電阻。
圖5是從封閉版讀取器的底部的頂部觀看的透視圖。
圖6是封閉版讀取器的底部側(cè)面的截面視圖。
圖7是封閉版讀取器的頂部的透視截面圖，示出了已就位的樣品測(cè)定裝置。
圖8是從封閉版讀取器的頂部的頂部觀看的透視圖。
圖9a是從開(kāi)放版讀取器的底部的頂部觀看的透視截面圖。
圖9b是從開(kāi)放版讀取器的底部部分的側(cè)面觀看的透視截面圖。
圖10a是從開(kāi)放版讀取器的頂部的側(cè)面和底部觀看的透視截面圖。
圖10b是從開(kāi)放版讀取器的頂部的側(cè)面和頂部觀看的透視截面圖。
圖11是系統(tǒng)的示意圖，示出了包含單次使用的一次性測(cè)定室、讀取器以及到計(jì)算機(jī)處理器和監(jiān)視器的連接的箱子。
圖12a-12f分別是無(wú)抗凝血?jiǎng)┑膶?duì)照、每毫升血液300ng依杜沙班(edoxaban)抗凝血?jiǎng)?、和每毫升血?00ng依杜沙班與ciraparantag(per977；一種抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑)的隨時(shí)間推移(以分鐘為單位)的阻抗(圖12a、12c、12e)與紅外透射(圖12b、12d、12f)的曲線圖。
具體實(shí)施方式
i.定義
微流控
微流控是一種從工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、微米/納米技術(shù)和生物技術(shù)中得到的高度跨學(xué)科的領(lǐng)域。范圍從毫微微升到毫升的小體積液體通常在微流控系統(tǒng)中處理。用于制造微流控系統(tǒng)的方法通常允許傳感器和/或致動(dòng)器的集成，使得可以在微流控系統(tǒng)內(nèi)有效地輸送、操縱和分析液體。微流控系統(tǒng)與其環(huán)境之間的接口使得能夠?qū)崿F(xiàn)用于輸送、操縱和分析的外部機(jī)構(gòu)。
微米/納米技術(shù)
微米/納米技術(shù)通常用于制造微系統(tǒng)，包括微流控系統(tǒng)。微米/納米技術(shù)通常能夠產(chǎn)生尺寸在微米或納米范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)。這些技術(shù)可以基于最初開(kāi)發(fā)用于集成電子電路的制造的硅晶圓加工技術(shù)。
毛細(xì)管作用
將液體樣品裝載到微流控系統(tǒng)中的便捷方式是通過(guò)毛細(xì)管作用。樣品收集端口用樣品潤(rùn)濕，并且通過(guò)毛細(xì)管力將樣品有效地吸入微流控系統(tǒng)的狹窄的親水通道和室。
抗凝血?jiǎng)?/p>
抗凝血?jiǎng)┦且环N干擾血液凝固能力的物質(zhì)。作為治療藥物給藥，抗凝血?jiǎng)┛梢岳鐜椭鷾p少或預(yù)防潛在的危及健康和/或生命的栓塞或血栓癥的發(fā)生。
抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑
抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑可以作為治療藥物來(lái)給藥，以便部分地或全部逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┑男Ч；謴?fù)血液凝固的能力可以是挽救生命的，例如，服用抗凝血?jiǎng)┎⑶艺诮?jīng)歷嚴(yán)重傷害的患者可以用用于恢復(fù)血液凝固能力和防止過(guò)度失血的逆轉(zhuǎn)試劑來(lái)治療。
“開(kāi)放”和“封閉”裝置
“開(kāi)放”裝置具有從內(nèi)室到外部的通道，允許血液直接進(jìn)入室中?！胺忾]”裝置沒(méi)有外部通道，并且在與外部密封(與傳感器、電極、led、和在室內(nèi)評(píng)定凝血時(shí)利用的其他元件相關(guān)聯(lián)的小孔除外)之前被填充。微流控系統(tǒng)的“開(kāi)放版”被設(shè)計(jì)成使得芯片可以首先插入其封裝中，被加熱，但仍然可以是可進(jìn)入的(開(kāi)放)。樣品可以通過(guò)潤(rùn)濕側(cè)端口被裝載到系統(tǒng)中，其中芯片已經(jīng)擱置在其封裝中。將通過(guò)毛細(xì)管力將樣品吸入芯片中。
微流控系統(tǒng)的“封閉版”在其被放入其封裝之后將是無(wú)法進(jìn)入的。在將芯片通過(guò)背面?zhèn)榷丝诘臐?rùn)濕或移液到其中來(lái)放入其封裝中之前，必須將樣品裝載到系統(tǒng)中。
ii.裝置
微流控芯片及其讀取器的實(shí)施例在圖2-10中示出，其中該系統(tǒng)包括圖11反映的兩個(gè)部分。如圖2a和圖2b所指示的，通過(guò)如下制造微流控芯片10：硅晶圓的各向異性濕法蝕刻和后續(xù)熱氧化、
可以通過(guò)替代手段，使用任何適合于產(chǎn)生微流控結(jié)構(gòu)的方法和任何適合于激活血液凝固級(jí)聯(lián)的帶負(fù)電荷的材料來(lái)制造微流控芯片。
可以修改室12a和12b以及連接這些室的通道14的截面尺寸和幾何形狀，并且可以改變室的數(shù)量。表面與體積的比率將總體影響凝固時(shí)間。在室裝置密封之前，或通過(guò)允許從微室的外部進(jìn)入的側(cè)通道16，直接進(jìn)入這些室(“封閉”，圖2b)。
如圖3a和圖3b所示，芯片被設(shè)計(jì)成使得能夠：
-通過(guò)背面電阻或電加熱器結(jié)構(gòu)進(jìn)行加熱(在室12a和12b的下側(cè))
-通過(guò)頂側(cè)(外部)熱敏電阻器18進(jìn)行用于加熱控制的溫度測(cè)量
-通過(guò)氣壓測(cè)量進(jìn)行凝血檢測(cè)
-通過(guò)經(jīng)嵌入電極20a和接觸墊20b測(cè)量整個(gè)血液樣本的阻抗進(jìn)行凝血檢測(cè)
-通過(guò)光學(xué)測(cè)量進(jìn)行凝血檢測(cè)
如圖4a-4h所示，將電阻結(jié)構(gòu)22沉積到硅晶圓24的背面(以形成電阻加熱結(jié)構(gòu)32，圖4g、圖4h)，沉積到硅晶圓的正面26上(以分別在每個(gè)室的底板處形成用于阻抗測(cè)量的電極20a、20b和熱敏電阻器18)，并且沉積到
圖2b、圖3b中的裝置(稱為‘封閉裝置’)具有通過(guò)硅部分30蝕刻的兩個(gè)進(jìn)入端口28a，28b。在將裝置10插入密封封裝之前，可以將樣品吸移到端口28a、28b之一中。圖2a、圖3b中的裝置具有通過(guò)硅部分蝕刻的一個(gè)進(jìn)入端口28b和一個(gè)旁側(cè)進(jìn)入端口16，其實(shí)現(xiàn)為蝕刻到
組合式加熱器/冷卻器控制系統(tǒng)和熱敏電阻器可以在‘芯片’的外部，并且可以集成到讀取器結(jié)構(gòu)中。如果放置芯片的空腔的壁比芯片質(zhì)量明顯更大，導(dǎo)熱性高，并且形成幾乎完全的環(huán)繞，則該空腔近似于‘黑體’，并且芯片必須與空腔達(dá)到熱平衡。如果芯片與空腔接觸或間隔緊密，則平衡時(shí)間常數(shù)可以非常短。這可以在發(fā)展過(guò)程中通過(guò)高溫計(jì)測(cè)量來(lái)確立。這應(yīng)降低系統(tǒng)的一次性部分的復(fù)雜性并且(有望)降低成本。
如圖5-10所示的芯片封裝或“讀取器”為芯片提供電氣、光學(xué)和流體接口。讀取器由通過(guò)高精度3d打印、成型、機(jī)加工或其他制造工藝制造的底部(圖5、圖6、圖9a、圖9b)和頂部(圖7、圖8、圖10a、圖10b)部分組成。兩個(gè)部分通過(guò)鎖定配合到孔56中的金屬定位銷而連結(jié)并相互壓靠。讀取器可以包括用于顯示、存儲(chǔ)信息和通信能力的裝置。
圖5和圖6示出了從兩個(gè)不同角度看時(shí)的封閉裝置芯片的底部讀取器部分50。位于讀取器內(nèi)的凹陷54中的通道52a、52b將室2和1分別連接到芯片進(jìn)入端口。在讀取器的一側(cè)，電磁閥(未示出)可以在通道端58處附接到讀取器，以控制讀取器通道與擰入讀取器底部的帶倒鉤的管接頭之間的連接。在相反側(cè)，壓力傳感器(未示出)可以在孔60處附接到讀取器上，以監(jiān)測(cè)施加到讀取器通道和芯片進(jìn)入端口的壓力。每個(gè)進(jìn)入端口62a、62b由固定在孔70a、70b、70c和70d處的其自己的電磁閥/壓力傳感器來(lái)控制/監(jiān)測(cè)。底部讀取器部分展現(xiàn)了用于微流體芯片的凹陷54。小的豎直孔64a、64b固持彈簧銷以在芯片底部接觸加熱器結(jié)構(gòu)。在閱讀器部分的中心處的孔66將irled芯片固持在金屬殼讀取器中，該讀取器沿光路68延伸。
ir部件可以成型或集成為“chipstrate”形式。
盡管顯示為單點(diǎn)光學(xué)測(cè)量，但可以使用多點(diǎn)光學(xué)測(cè)量。
圖7和圖8示出了從兩個(gè)不同角度看時(shí)的封閉裝置芯片的頂部讀取器部分80。中心處的大(例如5mm)孔82將ir光電二極管芯片(未示出)固持在通過(guò)孔86引導(dǎo)光的金屬殼讀取器中。三個(gè)小(例如，小于一毫米)的豎直孔84固持三個(gè)彈簧銷(未示出)以接觸三個(gè)用于阻抗測(cè)量的電極(兩腔室一個(gè)共用接地電極和每個(gè)室中一個(gè)對(duì)電極)，使得阻抗測(cè)量可以在兩個(gè)室里進(jìn)行。另外兩個(gè)豎直孔88固持彈簧銷以接觸芯片頂部的熱敏電阻器。這些裝置的其他實(shí)施例是已知的并且容易可供用于相同的功能。irled和光電二極管被放置成使得它們?cè)儐?wèn)一個(gè)室的1mm直徑的中心區(qū)域。
芯片讀取器本身附接到項(xiàng)目箱100的蓋子上，該項(xiàng)目箱包含執(zhí)行自動(dòng)化測(cè)量所需的電子電路、閥門和泵，如圖11所示。將項(xiàng)目箱100連接到pc102，其中測(cè)量由labview程序和處理器110控制，并且結(jié)果顯示在監(jiān)視器104上。
圖9a和圖9b示出了從兩個(gè)不同角度看時(shí)的開(kāi)放裝置芯片的底部讀取器部分120。定位銷孔122用于固定裝置。讀取器內(nèi)的通道124將室2和1分別連接到芯片進(jìn)入端口。在讀取器的一側(cè)，電磁閥(未示出)可以在通道端處附接到讀取器，以控制讀取器通道與擰入讀取器底部的帶倒鉤的管接頭之間的連接。在相反側(cè)，壓力傳感器(未示出)可以在孔126a、126b處附接到讀取器上，以監(jiān)測(cè)施加到讀取器通道和芯片進(jìn)入端口的壓力。每個(gè)進(jìn)入端口由固定在孔處的其自己的電磁閥/壓力傳感器來(lái)控制/監(jiān)測(cè)。底部讀取器部分展現(xiàn)了用于微流體芯片的凹陷128。在閱讀器部分的中心處的孔130將irled芯片固持在金屬殼讀取器中。
圖10a和圖10b示出了從兩個(gè)不同角度看時(shí)開(kāi)放裝置芯片的頂部讀取器部分140。中心處的大(例如5mm)孔142將ir光電二極管芯片(未示出)固持在通過(guò)孔144引導(dǎo)光的金屬殼讀取器中。三個(gè)小(例如，小于一毫米)的豎直孔146固持三個(gè)彈簧銷(未示出)以接觸三個(gè)用于阻抗測(cè)量的電極(兩腔室一個(gè)共用接地電極和每個(gè)室中一個(gè)對(duì)電極)，使得阻抗測(cè)量可以在兩個(gè)室里進(jìn)行。另外兩個(gè)豎直孔148固持彈簧銷以接觸芯片頂部的熱敏電阻器。irled和光電二極管被放置成使得它們?cè)儐?wèn)一個(gè)室的1mm直徑的中心區(qū)域。
盡管關(guān)于使用一條光束對(duì)兩個(gè)室詢問(wèn)進(jìn)行了描述，但可以使用單獨(dú)的光束來(lái)詢問(wèn)兩個(gè)室。僅用于說(shuō)明目的，示出一條光束。
如圖11所示，芯片讀取器如上所述使用螺孔150附接到項(xiàng)目箱的蓋板。
a.用于激活血液凝固的表面
微流控系統(tǒng)被制造成使得引入的血液或血漿樣品與玻璃表面、微流控芯片的頂部部分和/或微流控芯片的底部部分的表面(由諸如
微流控系統(tǒng)被制造成使得引入的血液或血漿樣品與玻璃表面(或其他帶負(fù)電荷的表面)接觸，該玻璃表面用于在不使用額外的化學(xué)或生物試劑的情況下激活凝血級(jí)聯(lián)。通過(guò)使用分別用于制造微流控系統(tǒng)的玻璃晶圓和氧化硅晶圓來(lái)生成玻璃表面。可替代地，可以通過(guò)使用集成在形成微流控系統(tǒng)的讀取器部分中的玻璃芯片，通過(guò)將玻璃沉積到微流控系統(tǒng)的內(nèi)表面上(例如，通過(guò)使用旋涂玻璃產(chǎn)品)或通過(guò)將微小物體與微流控系統(tǒng)內(nèi)的玻璃表面(例如，玻璃微珠)集成來(lái)實(shí)現(xiàn)玻璃表面。此外，可以通過(guò)硅表面的氧化來(lái)引入玻璃表面。
b.沉積的金屬薄膜的電氣特征
沉積的金屬薄膜可以由鉻粘附層(大約20nm厚)和金頂層(對(duì)于用于阻抗測(cè)量的內(nèi)部電極大約為50nm厚，對(duì)于熱敏電阻器大約為100nm厚，對(duì)于加熱器結(jié)構(gòu)大約為150nm厚)形成。使用塑料讀取器中的彈簧加載式彈簧銷實(shí)現(xiàn)與微流控控芯片上的所有薄膜電極的電接觸。連接到金屬膜測(cè)試結(jié)構(gòu)的任一端的兩個(gè)銷(其中長(zhǎng)度大約2mm并且寬度大約1mm)之間的典型電阻在銷接觸加熱器結(jié)構(gòu)的金屬膜時(shí)為1.8歐姆，接觸熱敏電阻器的金屬膜時(shí)為2.7歐姆，接觸用于阻抗測(cè)量的內(nèi)部電極的金屬膜時(shí)為22歐姆。內(nèi)部電極銷之間的顯著更高的電阻可能是由于較薄的金層和在大約300℃的陽(yáng)極鍵合過(guò)程中可能的接觸退化引起的。陽(yáng)極鍵合之后，沉積加熱器結(jié)構(gòu)和熱敏電阻器。
為了測(cè)量沉積的金屬薄膜的電阻溫度系數(shù)，使用展現(xiàn)電阻器/熱敏電阻器結(jié)構(gòu)的芯片代替用于阻抗測(cè)量的開(kāi)路電極。將芯片插入其讀取器中并在爐內(nèi)加熱。在不同溫度下測(cè)量加熱器、熱敏電阻器和內(nèi)部電極電阻器的電阻，并計(jì)算電阻溫度系數(shù)α：
-加熱器薄膜：α＝0.0016k-1
-熱敏電阻器薄膜：α＝0.00115k-1
-內(nèi)部電極薄膜：α＝0.000108k-1。
c.用于樣品定位的內(nèi)部電極
除了阻抗測(cè)量以外，集成電極也可以用于檢測(cè)微流控系統(tǒng)中分析物(諸如纖維蛋白)的存在與否和/或跟蹤例如由于外部施加的氣壓脈沖引起的分析物移動(dòng)。一旦將分析物添加到微流控系統(tǒng)中，就可以使用這樣的檢測(cè)和跟蹤來(lái)開(kāi)始分析程序，以將分析物定位在微流控系統(tǒng)內(nèi)的具體位置，并且分別在限定位置之間來(lái)反復(fù)地來(lái)回地移動(dòng)該分析物。
盡管關(guān)于兩個(gè)室和兩個(gè)電極進(jìn)行了舉例說(shuō)明，但可以使用多個(gè)電極來(lái)確認(rèn)多個(gè)室的填充(在凝血測(cè)量部位或在測(cè)量凝血的室之前的一個(gè)點(diǎn)，諸如更接近進(jìn)口處)。
可以施加全血或血漿沿玻璃表面的反復(fù)移動(dòng)，以增加血液的活化，加速血液凝固和/或減少測(cè)量時(shí)間。
d.過(guò)濾器結(jié)構(gòu)的集成
機(jī)械過(guò)濾器結(jié)構(gòu)可以集成到微流體芯片中，使得只有血漿到達(dá)分析室。過(guò)濾器可以實(shí)現(xiàn)為微柱陣列或者實(shí)現(xiàn)為被蝕刻到硅或玻璃中的微通道。以此方式，可以就地生產(chǎn)血漿(不使用抗凝血?jiǎng)?，諸如枸櫞酸鈉或edta)，并以與全血相同的方式非?？焖俚販y(cè)試，在分析中沒(méi)有紅細(xì)胞干擾。微柱陣列可以按偏移圖案安排以抑制紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)將“堵塞”可用通道截面的過(guò)多部分的概率降到最低。
e.凝血檢測(cè)手段
可以應(yīng)用各種方式來(lái)確定血液凝固時(shí)間。
粘度
血液的粘度可以用作為表征凝血時(shí)間的測(cè)度?？梢詰?yīng)用兩個(gè)一般原則來(lái)產(chǎn)生粘度的直接或間接測(cè)度?？梢酝ㄟ^(guò)具有已知幾何形狀的通道移動(dòng)樣品?？梢酝ㄟ^(guò)以光學(xué)方式或通過(guò)成像或多光束“檢查點(diǎn)”或由多電極阻抗傳感器以電方式跟蹤通過(guò)“長(zhǎng)”通道的穿透速率來(lái)測(cè)量粘度?？梢蚤g接地測(cè)量粘度，例如通過(guò)測(cè)量樣品在具體時(shí)間間隔期間在通道內(nèi)行進(jìn)的距離、在具體時(shí)間間隔期間被移位的樣品體積或在具體時(shí)間間隔期間驅(qū)動(dòng)力的變化(例如，如果樣品被加壓體積的捕獲空氣移動(dòng)、氣壓的變化可以用作為樣品體積位移的間接測(cè)度)?？商娲?，物體可以通過(guò)血液樣品移動(dòng)，例如通過(guò)靜電力或磁力被驅(qū)動(dòng)。跟蹤物體移動(dòng)可以產(chǎn)生樣品粘度的間接測(cè)度。
分析物的粘度可以通過(guò)微流控系統(tǒng)內(nèi)的分析物通過(guò)加壓的截留空氣體積的移動(dòng)來(lái)檢測(cè)?？諝饪梢岳缤ㄟ^(guò)連接到微流控系統(tǒng)的電動(dòng)氣泵進(jìn)行加壓。通過(guò)關(guān)閉連接到微流控系統(tǒng)的電磁閥，可以截留加壓空氣。在芯片的一個(gè)進(jìn)入端口處的截留空氣的壓力降低指示分析物移動(dòng)。了解微流控系統(tǒng)的幾何形狀和施加的壓力的大小允許計(jì)算分析物粘度和檢測(cè)粘度變化(例如，由于在血液情況下凝血而引起的粘度增大)。
經(jīng)粘度監(jiān)測(cè)進(jìn)行的凝塊檢測(cè)涉及到測(cè)量連接到讀取器上的流體端口的片上進(jìn)口和出口上的壓差(使用o形環(huán)密封件形成空氣/流體密封)。
分析物的粘度可以通過(guò)微流控系統(tǒng)內(nèi)的分析物通過(guò)加壓的截留空氣體積的移動(dòng)來(lái)檢測(cè)。空氣可以例如通過(guò)連接到微流控系統(tǒng)的電動(dòng)氣泵進(jìn)行加壓。通過(guò)關(guān)閉連接到微流控系統(tǒng)的電磁閥，可以截留加壓空氣。在芯片的一個(gè)進(jìn)入端口處的截留空氣的壓力降低指示分析物移動(dòng)。了解微流控系統(tǒng)的幾何形狀和施加的壓力的大小允許計(jì)算分析物粘度和檢測(cè)粘度變化(例如，由于在血液情況下凝血而引起的粘度增大)。
阻抗
樣品的凝固可能與其電阻抗或在施加電流或電壓時(shí)復(fù)電阻有關(guān)。電阻抗由樣品的歐姆電阻以及電容分量產(chǎn)生。例如，電阻抗可以例如通過(guò)直接集成在微流控芯片中或集成在讀取器中的電極來(lái)測(cè)量，該讀取器與其他部分一起形成微流控系統(tǒng)。電極可以部分地與樣品直接接觸或者僅通過(guò)薄的絕緣體(厚度范圍從納米到數(shù)百微米)與樣品分離。
電極和導(dǎo)線可以形成為沉積到形成微流控系統(tǒng)的襯底上的圖案化金屬薄膜。電極和導(dǎo)線還可以通過(guò)插入并夾在讀取器部分之間的圖案化金屬片或膜的集成來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果使用半導(dǎo)體晶圓來(lái)制造微流控芯片，則半導(dǎo)體材料本身可以包含通過(guò)擴(kuò)散法、注入法、蝕刻法、微加工或類似于集成電路或其他微裝置生產(chǎn)中使用的技術(shù)的適當(dāng)技術(shù)的任何組合制造的集成電極。集成電極可以用于直接測(cè)量分析物的電氣特性(例如，電阻、電容、阻抗)。也可以使用合適的電子電路將分析物變化(和電氣特性的相關(guān)變化)轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電壓、電流、頻率或其他合適的參數(shù)。也可以在構(gòu)建期間通過(guò)3d打印插入多個(gè)部分，或直接集成多個(gè)部分。例如，電阻器加熱元件將由半導(dǎo)體襯底中的摻雜通道(例如，通過(guò)離子束注入)制造。
經(jīng)阻抗監(jiān)測(cè)進(jìn)行的凝塊檢測(cè)通過(guò)將芯片插入讀取器中來(lái)完成，從而在讀取器中的金墊(連接到芯片上電極)和彈簧銷之間形成接觸，例如通過(guò)lcr儀表、或任何其他適當(dāng)?shù)臏y(cè)量系統(tǒng)從該讀取器中讀取電信號(hào)。
為了通過(guò)測(cè)量阻抗來(lái)檢測(cè)凝血，將樣品裝載到芯片中，將芯片插入其讀取器中，并且經(jīng)由開(kāi)爾文線夾將連接到內(nèi)部阻抗電極的彈簧銷連接到quadtech1920lcr儀表。以15秒的間隔記錄血液樣品的復(fù)阻抗的大小和相位。在100hz、1khz、10khz和100khz處的測(cè)量示出了大小或相位或兩者的特征峰或平臺(tái)期。峰或平臺(tái)期表示凝血時(shí)間的測(cè)度。
參照?qǐng)D3a-3b，對(duì)于阻抗測(cè)量，外部lcr儀表在室12a的每一側(cè)的兩個(gè)電極20b、20a之間施加交流電壓(20mvrms)，并測(cè)量電極之間的電流。然后計(jì)算阻抗的大小和相位并計(jì)算凝血。
光學(xué)特性
樣品的光學(xué)特性可能與凝血事件有關(guān)?？梢允褂貌ㄩL(zhǎng)在500nm至10,000nm(優(yōu)選地1,300nm)范圍內(nèi)的光來(lái)通過(guò)微流控與芯片讀取器照亮樣品。以下參數(shù)可以用于跟蹤凝血：透射光、反射光和散射光。如果使用相干光源，則可以使用偏振作為附加參數(shù)。
通過(guò)將芯片插入讀取器中并測(cè)量橫穿芯片的厚度(通過(guò)玻璃、流體填充室和下面的硅)的紅外透射來(lái)進(jìn)行經(jīng)ir透射的凝塊檢測(cè)。這是通過(guò)在芯片和正下方對(duì)齊的光電二極管檢測(cè)器上方放置ir源(led)來(lái)完成的。
對(duì)于光凝塊檢測(cè)，如上所述，將irled和光電二極管插入其讀取器部分中。將血液樣品吸移到芯片中，并且將芯片放入讀取器中。在1,300nm的ir光下持續(xù)照亮樣品。以通常100ms的時(shí)間間隔記錄由光電二極管的光電流引起的1m歐姆電阻器上的電壓降。通常測(cè)得電壓為幾伏。樣品的凝固引起透射光和光電流隨時(shí)間推移而變化。透射光曲線的特征峰指示凝血時(shí)間的測(cè)度。
連續(xù)照明測(cè)量作為一個(gè)簡(jiǎn)單的說(shuō)明來(lái)呈現(xiàn)?？梢允褂酶鼜?fù)雜的測(cè)量技術(shù)。例如，如果在1khz的重復(fù)率下照亮ir發(fā)射器持續(xù)50％持續(xù)時(shí)間，并且使用同步檢測(cè)器來(lái)處理光電檢測(cè)器輸出，接著是1秒積分周期，則以上實(shí)例中的信噪比可以提高多達(dá)三十倍。此外，有源信號(hào)處理將允許處理小得多的信號(hào)，從而準(zhǔn)許光電檢測(cè)器的相對(duì)較低的阻抗終止，降低本征噪聲和抵消漂移。環(huán)境電噪聲敏感度將大大降低。
聲學(xué)特性
測(cè)量樣品中或沿樣品表面的聲音傳播可以用作為凝血的附加測(cè)度。外部超聲換能器可以用于測(cè)量超聲行進(jìn)通過(guò)樣品所花費(fèi)的時(shí)間。此外，表面聲波裝置可以用于測(cè)量樣品的聲學(xué)特性并檢測(cè)凝血。
iii.制作裝置的方法
除了諸如光刻等標(biāo)準(zhǔn)工藝之外，可以應(yīng)用諸如硅晶圓的陽(yáng)極鍵合或氫氧化鉀各向異性濕蝕刻等特殊技術(shù)來(lái)形成微系統(tǒng)。除了標(biāo)準(zhǔn)紫外光光刻技術(shù)，可以使用諸如直接激光寫入微消融或侵蝕、電子束光刻或聚焦離子束銑削等技術(shù)來(lái)限定微米級(jí)或納米級(jí)的結(jié)構(gòu)。軟光刻是制造微流控系統(tǒng)的相關(guān)方式，并且基于微結(jié)構(gòu)或圖案的產(chǎn)生，例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)，以及隨后在成型/鑄造工藝中使用這些圖案。彈性體材料(諸如聚二甲基硅氧烷(pdms))通常用于通過(guò)軟光刻產(chǎn)生微流控系統(tǒng)。通過(guò)軟光刻產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)化膜可以彼此附接或者附接到任何其他結(jié)構(gòu)化或非結(jié)構(gòu)化襯底上以形成復(fù)雜的微流控系統(tǒng)。另外，可以單獨(dú)使用其他技術(shù)，諸如鉆孔、銑削、成型或3d打印，或者與其他微米/納米技術(shù)組合使用以制造微系統(tǒng)。
iv.樣品采集
采血
在大多數(shù)情況下，待測(cè)試的個(gè)體將出現(xiàn)在診所或醫(yī)院，可能對(duì)于使用抗凝血?jiǎng)┑闹委煚顟B(tài)未知?？梢酝ㄟ^(guò)使用注射器、刺血針、或者直接從含血管線獲得血液。由于使用替代性凝血途徑，其中使用玻璃型表面激活凝血，血液可以含有抗凝血?jiǎng)T如華法林、肝素、低分子量肝素、因子iia抑制劑、因子xa抑制劑、和其他因子抑制或因子受損血液。
華法林和相關(guān)的含有4-羥基香豆素的分子通過(guò)抑制維生素k環(huán)氧化物還原酶來(lái)減少血液凝固，該環(huán)氧化物還原酶是一種在維生素k1參與幾種血液凝固蛋白(主要是凝血酶原和因子vii)的羧化之后將氧化的維生素k1再循環(huán)至其還原形式的酶。華法林不會(huì)拮抗維生素k1的作用，而是拮抗維生素k1的再循環(huán)，消耗活性維生素k。因此，新鮮維生素k總能逆轉(zhuǎn)藥理作用。當(dāng)給藥時(shí)，這些藥物不會(huì)立即抗凝血。相反，它們的效果開(kāi)始需要在剩余的活性凝血因子已經(jīng)有時(shí)間自然消失在代謝中前大約一天，并且單次劑量的華法林的作用持續(xù)時(shí)間為2至5天。當(dāng)中斷或給予維生素k1時(shí)華法林作用果的逆轉(zhuǎn)需要相似的時(shí)間。
肝素是肝臟和其他組織中發(fā)生抑制血液凝固的化合物。含硫多糖，作為抗凝血?jiǎng)┯糜谥委熝òY。低分子量肝素是一種更高度加工的產(chǎn)品，因?yàn)樗恍枰ㄟ^(guò)aptt凝血參數(shù)(其具有更加可預(yù)測(cè)的血漿水平)進(jìn)行監(jiān)測(cè)并且具有較少的副作用，所以是有用的。然而，在緊急出血情況下，監(jiān)測(cè)lmwh的能力是顯著的未滿足的臨床需求，因?yàn)獒槍?duì)lmwh抗凝血?jiǎng)┍O(jiān)測(cè)尚無(wú)臨床上可接受的即時(shí)測(cè)定。
藥物(諸如利伐沙班、阿哌沙班和依杜沙班)通過(guò)直接抑制因子xa起作用(與通過(guò)抗凝血酶活化起作用的肝素和磺達(dá)肝素不同)。
另一種類型的抗凝血?jiǎng)┦侵苯幽敢种苿Ｄ壳斑@一類成員包括二價(jià)藥水蛭素、來(lái)匹盧定和比伐盧定；和一價(jià)藥物阿加曲班和達(dá)比加群。
樣品可以作為血液或血漿進(jìn)行測(cè)試。血漿可以通過(guò)過(guò)濾或離心來(lái)制備。此外，通過(guò)使用例如雙深度芯片或通道內(nèi)珠粒封裝將玻璃珠引入通道中，可以增加一個(gè)或多個(gè)微流控通道的額外的玻璃表面積。
其他生物樣品
該裝置可以與通過(guò)暴露于玻璃下來(lái)激活的其他類型的樣品一起使用。
v.使用方法
將樣品收集并給予到該裝置中。當(dāng)樣品放入該裝置時(shí)，開(kāi)始確定凝血的手段。將結(jié)果與未凝固樣品(通常來(lái)自匯集的血漿或匯集的血液)的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行比較，或參考治療開(kāi)始時(shí)的凝血時(shí)間，如在個(gè)體被給予抗凝血?jiǎng)?、或用于中和抗凝血?jiǎng)┎⒒謴?fù)較正常的血液凝固的治療劑的情況下。
參考以下非限制性實(shí)例來(lái)進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)例1.芯片上加熱的示范
使用芯片來(lái)示范集成加熱器(或集成加熱器/冷卻器)的效果；優(yōu)選固態(tài)熱泵或‘珀耳帖冷卻器’)結(jié)構(gòu)。將12v直流電壓施加到微流控芯片的硅部分背面的加熱器電阻器上。在施加加熱器電壓和在加熱過(guò)程中，在每個(gè)室(在硅前表面上的內(nèi)部熱敏電阻器)內(nèi)和每個(gè)室的頂部(
-外部熱敏電阻器：δt＝20.3k
-內(nèi)部熱敏電阻器：δt＝23.8k。
實(shí)例2：血液凝固的測(cè)量
材料與方法
使用市售的采血裝置從患者上獲得血液。獲得10μl血液并移液到微量離心管中。將鹽水用作緩沖溶液。將血液樣品在微量離心管中用以下試劑之一上下移液五次進(jìn)行混合：
-1μl緩沖溶液(稱為假對(duì)照)，
-1μl含有濃度為300ng/ml的抗凝血?jiǎng)┮蓝派嘲嗟木彌_液，
-1μl含有濃度均為300ng/ml的抗凝血?jiǎng)┮蓝派嘲嗪涂鼓獎(jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑per977的緩沖溶液。
依杜沙班是市售抗凝血?jiǎng)?。per977(ciraparantag)是一種被設(shè)計(jì)成用于逆轉(zhuǎn)依杜沙班的效果的試驗(yàn)藥物。混合后立即將2.5μl的每個(gè)血液樣品移液到封閉的裝置芯片中。將芯片插入其讀取器中，并且在室溫(大約27℃)下立即記錄ir光和阻抗測(cè)量值。省略了血液樣品的加熱。
通過(guò)ir和粘度阻抗兩者獲得結(jié)果。
結(jié)果
從圖12a-12f中明顯的是，ir(圖12b、圖12d和圖12f)和阻抗測(cè)量值(圖12a、圖12c和圖12e)彼此密切關(guān)聯(lián)。兩個(gè)測(cè)量值顯示在2分鐘左右時(shí)的特征峰值的假對(duì)照，指示樣品凝血時(shí)間。添加抗凝血?jiǎng)┮蓝派嘲鄬⒃摲逯缔D(zhuǎn)移到大約4分鐘。除了峰值，依杜沙班曲線顯示出12分鐘左右時(shí)的特征局部最小值。將抗凝血?jiǎng)┠孓D(zhuǎn)劑per977添加到含有依杜沙班的血液樣品中，將每條曲線中的峰值轉(zhuǎn)移回到2分鐘，并抑制在12分鐘左右時(shí)出現(xiàn)局部最小值。這些測(cè)量值指示依杜沙班的凝血延緩效果，并通過(guò)額外給予per977逆轉(zhuǎn)這種效果。
根據(jù)前述詳細(xì)描述，裝置、系統(tǒng)及其使用方法的修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的，并且旨在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
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