本發(fā)明涉及篩選線粒體活性激活劑的方法(methodforscreeningactivatorofmitochondriaactivity)，更具體地，涉及使用經(jīng)絞股藍(lán)皂苷處理的細(xì)胞來(lái)篩選線粒體活性激活劑的方法、包含所述絞股藍(lán)皂苷的用于篩選線粒體活性激活劑的組合物及含有上述組合物的試劑盒。

背景技術(shù)：

線粒體是在大部分真核細(xì)胞中存在的細(xì)胞器。線粒體的主要功能之一為氧化磷酸化，通過(guò)該過(guò)程來(lái)將源于葡萄糖或脂肪酸等燃料物質(zhì)的能量轉(zhuǎn)換為atp(三磷酸腺苷)，其用于進(jìn)行各種需要能量的生物合成及促進(jìn)其他代謝活性。已知線粒體含有與核基因組dna不同的單獨(dú)的dna，所述線粒體dna為具有約16000堿基對(duì)的環(huán)形dna。此外，所述線粒體dna與核的dna不同，不具有自我修復(fù)機(jī)制(repairmechanism)，且沒有起到保護(hù)dna作用的組蛋白，因此根據(jù)細(xì)胞外部環(huán)境或內(nèi)部環(huán)境而容易變異。大部分所述變異顯示抑制線粒體活性的效果，但有些也可以顯示促進(jìn)線粒體活性的效果。

已知當(dāng)所述線粒體的dna發(fā)生變異而導(dǎo)致線粒體活性受到抑制時(shí)，線粒體膜電位異常所引起的膨脹、活性氧簇或自由基等所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激所引起的功能異常、遺傳因素所引起的功能異常以及用于生成線粒體能量的氧化磷酸化功能缺陷所導(dǎo)致的功能異常會(huì)發(fā)生，從而可能誘發(fā)代謝性疾病、退行性腦病、肝功能異常、肌肉病、免疫疾病等。因此，人們正在開發(fā)用于治療由于線粒體活性受抑制而誘發(fā)的疾病的多種制劑(韓國(guó)授權(quán)專利第1048766號(hào)、韓國(guó)公開專利第2005-0117313號(hào)、韓國(guó)公開專利第2013-0064761號(hào)、韓國(guó)公開專利第2014-0012456號(hào))。

此外，當(dāng)所述線粒體dna發(fā)生變異而促進(jìn)線粒體活性時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的atp而誘發(fā)細(xì)胞功能異常。由此可誘發(fā)的疾病有包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種自身免疫疾病、多種癌癥等。針對(duì)線粒體活性受抑制而導(dǎo)致的疾病而言，人們從促進(jìn)線粒體活性的方面來(lái)進(jìn)行多種研究，但是迄今為止還沒有開發(fā)出適合改善受抑制的線粒體活性的激活劑。理由是雖然發(fā)現(xiàn)了很多顯示線粒體功能促進(jìn)活性的候選物質(zhì)，但實(shí)際沒有起到促進(jìn)線粒體功能。從而現(xiàn)在面臨開發(fā)出一種發(fā)掘?qū)嶋H能夠促進(jìn)線粒體功能的激活劑的方法的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人為了開發(fā)出能夠發(fā)掘促進(jìn)線粒體功能的激活劑的方法而不懈努力研究，結(jié)果開發(fā)出以能夠在分離細(xì)胞中促進(jìn)線粒體活性的絞股藍(lán)皂苷75為基準(zhǔn)物質(zhì)，篩選以等同或高于所述絞股藍(lán)皂苷75的水平促進(jìn)線粒體活性的候選物質(zhì)并將其用作線粒體功能激活劑的方法，由此完成了本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的在于，提供一種通過(guò)將經(jīng)絞股藍(lán)皂苷處理的細(xì)胞用作對(duì)照組而篩選線粒體活性激活劑的方法。

本發(fā)明的另一目的在于，提供一種含有絞股藍(lán)皂苷的用于篩選線粒體活性激活劑的組合物。

本發(fā)明的又一目的在于，提供一種含有上述組合物的用于篩選線粒體活性激活劑的試劑盒。

發(fā)明效果

使用根據(jù)本發(fā)明的篩選線粒體活性激活劑的方法，能夠有效發(fā)掘?qū)嶋H上促進(jìn)線粒體活性的制劑，從而能夠廣泛用于開發(fā)針對(duì)線粒體活性受抑制而引起的疾病的治療劑。

附圖說(shuō)明

圖1是表示用絞股藍(lán)皂苷、人參皂苷f(shuō)1、人參皂苷rg3、人參皂苷rb2或人參皂苷rb3處理后的細(xì)胞內(nèi)atp量變化的圖譜。

圖2是表示用絞股藍(lán)皂苷、人參皂苷f(shuō)1、人參皂苷rg3、人參皂苷rb2或人參皂苷rb3處理后的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電壓變化的圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的發(fā)明人為了開發(fā)出能夠發(fā)掘?qū)嶋H上能夠促進(jìn)線粒體功能的激活劑的方法而進(jìn)行多種研究的過(guò)程中，關(guān)注到了絞股藍(lán)皂苷。已知作為一種皂苷類化合物的絞股藍(lán)皂苷，除了人參之外，還在絞股藍(lán)、絞股藍(lán)茶中含有。此外，與在細(xì)胞中顯示多種活性的人參皂苷不同，絞股藍(lán)皂苷在細(xì)胞內(nèi)僅顯示抗氧化活性，而其他細(xì)胞內(nèi)活性尚未公知。

本發(fā)明的發(fā)明人用絞股藍(lán)皂苷之一的絞股藍(lán)皂苷75處理分離細(xì)胞，并測(cè)定線粒體中生成的atp生成量的變化，結(jié)果確認(rèn)到通過(guò)絞股藍(lán)皂苷75的處理而導(dǎo)致atp生成量增加，從而可以知道所述絞股藍(lán)皂苷75是實(shí)際上能夠促進(jìn)線粒體功能的激活劑。

從而，通過(guò)將經(jīng)絞股藍(lán)皂苷處理的細(xì)胞用作對(duì)照組，篩選預(yù)期能夠促進(jìn)線粒體功能的候選物質(zhì)時(shí)，確認(rèn)到能夠篩選實(shí)際上能夠促進(jìn)線粒體功能的激活劑，如上所述的使用絞股藍(lán)皂苷來(lái)篩選線粒體活性激活劑的方法以往沒有公開，是由本發(fā)明的發(fā)明人第一次開發(fā)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種篩選線粒體活性激活劑的方法，該方法包括：(a)分別獲得分離細(xì)胞經(jīng)絞股藍(lán)皂苷處理的對(duì)照組和分離細(xì)胞經(jīng)預(yù)期能夠抑制線粒體活性的候選物質(zhì)的處理的實(shí)驗(yàn)組；(b)分別測(cè)定所述對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的線粒體活性的步驟；及(c)篩選所述實(shí)驗(yàn)組中所測(cè)定的線粒體活性等同于或高于所述對(duì)照組中所測(cè)定的線粒體活性的候選物質(zhì)的步驟。

此時(shí)只要是絞股藍(lán)皂苷使線粒體活性得到促進(jìn)的細(xì)胞，上述分離細(xì)胞就不受特別限制，作為一例示可以是胰島素分泌細(xì)胞，可以利用線粒體所生成的atp生成量、線粒體dna水平等來(lái)進(jìn)行測(cè)量。作為一例，若用絞股藍(lán)皂苷處理分離細(xì)胞后線粒體活性得到提高，則上述細(xì)胞內(nèi)測(cè)定的atp生成量隨之增加，因此通過(guò)測(cè)定所述對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞所生成的atp生成量，能夠測(cè)定線粒體活性。

這種測(cè)定線粒體活性的方法除了上述方法之外可以使用本領(lǐng)域公知的所有方法，顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要可以選擇性地使用上述公知方法。

本發(fā)明的用語(yǔ)“絞股藍(lán)皂苷(gypenoside)”也可以稱為“絞股藍(lán)總皂苷(gynosaponin)”，是指絞股藍(lán)(gynostemmapentaphyllum)及絞股藍(lán)茶中包含的皂苷化合物之一的達(dá)瑪烷型(dammaranetype)皂苷。已知所述絞股藍(lán)皂苷顯示脂質(zhì)代謝改善作用、心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防作用、降血糖作用、中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用、抗癌作用、阻礙血小板凝集作用、強(qiáng)壯作用等效果，在細(xì)胞內(nèi)顯示抗氧化效果。

根據(jù)本發(fā)明，所述絞股藍(lán)皂苷可以用作提高線粒體活性的激活劑，所述絞股藍(lán)皂苷只要是顯示提高線粒體活性的效果就不受特別限制，作為一例，可以單獨(dú)使用或組合使用絞股藍(lán)皂苷1、絞股藍(lán)皂苷3、絞股藍(lán)皂苷4、絞股藍(lán)皂苷5、絞股藍(lán)皂苷8、絞股藍(lán)皂苷17、絞股藍(lán)皂苷48、絞股藍(lán)皂苷75等，作為另一例，可以為下列化學(xué)式1的絞股藍(lán)皂苷75。

[化學(xué)式1]

根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例，用絞股藍(lán)皂苷75處理胰島素分泌細(xì)胞ins-1細(xì)胞，并培養(yǎng)2小時(shí)后，測(cè)定上述細(xì)胞中生成的atp量，結(jié)果確認(rèn)了相比沒有用絞股藍(lán)皂苷75處理的對(duì)照組細(xì)胞，atp生產(chǎn)量增加(圖1)。

作為本發(fā)明另一具體例，提供一種含有絞股藍(lán)皂苷的用于篩選線粒體活性激活劑的組合物及含有所述組合物的用于篩選線粒體活性激活劑的試劑盒。

所述組合物及試劑盒中含有的絞股藍(lán)皂苷75能夠提高細(xì)胞內(nèi)線粒體活性，從而所述組合物及試劑盒能夠用于制作用于篩選線粒體活性抑制劑的對(duì)照組。

尤其，所述試劑盒除了絞股藍(lán)皂苷75還可以包括適合于確認(rèn)候選物質(zhì)是否抑制線粒體活性的方法的一種或多種的其他組成成分的組合物、溶液或裝置。例如，可以進(jìn)一步包含借助絞股藍(lán)皂苷75而線粒體活性得以提高的細(xì)胞、用于所述細(xì)胞培養(yǎng)的容器；用于所述細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基；用于atp生成量測(cè)定的適當(dāng)?shù)木彌_液；用于atp生成量測(cè)定的熒光物質(zhì)(fitc(異硫氰酸熒光素)、ritc(異硫氰酸羅丹明b)等)等。

作為一具體例，根據(jù)本發(fā)明的用于篩選線粒體活性激活劑的試劑盒可以是包含實(shí)施測(cè)定線粒體生成的atp量的熒光素酶測(cè)定法所需的要素的試劑盒。即，所述試劑盒可以包含：細(xì)胞破碎用緩沖液；熒光素酶；誘導(dǎo)所述熒光素酶的熒光發(fā)色的基質(zhì)；所述熒光素酶的熒光發(fā)色所必需的緩沖液；試管或其他適當(dāng)?shù)娜萜鞯取?/p>

作為另一例，根據(jù)本發(fā)明的用于篩選線粒體活性激活劑的試劑盒可以是包含實(shí)施pcr而擴(kuò)增線粒體dna所需的要素的試劑盒。即，所述試劑盒可以包含：對(duì)所述線粒體dna的各特異性引物對(duì)；試管或其他適當(dāng)?shù)娜萜鳎环磻?yīng)緩沖液(ph及鎂濃度不同)；脫氧核糖核苷三磷酸(dntps)；諸如taq聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶等酶；dnase(脫氧核糖核酸酶)；rnase(核糖核酸酶)抑制劑；焦炭酸二乙酯-水(depc-water)；滅菌水等。此外，還可以包含對(duì)用作定量對(duì)照組的基因的特異性引物對(duì)。

實(shí)施例

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但是這些實(shí)施例僅用于示例性說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不由這些實(shí)施例限定。

實(shí)施例1：絞股藍(lán)75的線粒體活性促進(jìn)效果

線粒體的功能降低時(shí)，由于胰島素信號(hào)傳遞阻礙而可能成為糖尿病的原因。從而，為了確認(rèn)絞股藍(lán)皂苷75的線粒體功能活化效果，用絞股藍(lán)皂苷75處理后，測(cè)定增加的atp的量和線粒體膜電壓。

首先，將胰島素分泌細(xì)胞ins-1細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)器中培養(yǎng)后(37℃、5％co2、rpmi(無(wú)血清細(xì)胞凍存)培養(yǎng)基、10％fbs(胎牛血清))，用10μm的絞股藍(lán)皂苷75、人參皂苷f(shuō)1、人參皂苷rg3、人參皂苷rb2或人參皂苷rb3處理2小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的atp量和線粒體膜電壓。此時(shí)，對(duì)照組使用經(jīng)dmso(二甲亞砜)的處理的細(xì)胞。

然后，使用熒光素酶測(cè)定細(xì)胞內(nèi)atp量，由于熒光素的活化引起的熒光發(fā)色依賴atp的量，因此通過(guò)測(cè)定所述熒光發(fā)色水平就能夠測(cè)定細(xì)胞內(nèi)atp量。

具體地，將處理上述各物質(zhì)的ins-1細(xì)胞通過(guò)冷凍-解凍及超聲波處理來(lái)粉碎而獲得細(xì)胞粉碎液，在上述獲得的細(xì)胞粉碎液中添加熒光素酶和熒光素誘導(dǎo)熒光發(fā)色后，量化熒光發(fā)色水平并進(jìn)行比較(圖1)。

圖1是表示用絞股藍(lán)皂苷、人參皂苷f(shuō)1、人參皂苷rg3、人參皂苷rb2或人參皂苷rb3處理后的細(xì)胞內(nèi)atp量變化的圖譜。如圖1所示，可以確認(rèn)用絞股藍(lán)皂苷75處理時(shí)，相比對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)atp量增加50％。

最后，通過(guò)tmrm(四甲基若丹明甲酯)染色測(cè)定線粒體膜電壓，由于tmrm染色水平相對(duì)于線粒體膜電壓成比例地增加，因此通過(guò)測(cè)定tmrm染色水平就能夠測(cè)定細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜電壓。

具體地，處理了上述各物質(zhì)的ins-1細(xì)胞用tmrm進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞分析儀(facs)定量分析上述染色水平并進(jìn)行比較(圖2)。

圖2是表示根據(jù)使用絞股藍(lán)皂苷、人參皂苷f(shuō)1、人參皂苷rg3、人參皂苷rb2或人參皂苷rb3處理的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電壓變化的圖譜。如圖2所示，確認(rèn)了當(dāng)用絞股藍(lán)皂苷75處理時(shí)，相比對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)膜電壓增加約40％。

綜合上述圖1和圖2的結(jié)果，可以確認(rèn)絞股藍(lán)皂苷75活化細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能，增加細(xì)胞內(nèi)atp水平和線粒體膜電壓水平。

工業(yè)實(shí)用性

使用本發(fā)明的篩選線粒體活性激活劑的方法，能夠有效發(fā)掘?qū)嶋H上能夠促進(jìn)線粒體活性的制劑，從而能夠廣泛用于開發(fā)針對(duì)線粒體活性受抑制而導(dǎo)致的疾病的治療劑。